Journal of Molecular Signaling, 2006; 1: 3-3 (más artículos en esta revista)

Diferencial de particionado G α i1 con la microtúbulos celulares: un posible mecanismo de desarrollo de Taxol resistencia humana en células de carcinoma de ovario

BioMed Central
Hemant K Parekh (hemant.parekh @ temple.edu) [1], Mahesha Adikari (madikari@temple.edu) [1], Bharathi Vennapusa (barti_venn@yahoo.com) [1]
[1] Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Temple University School of Medicine, 3400 N. Broad Street, Filadelfia, PA 19140, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Taxol se une a los microtúbulos celulares y suprime su inestabilidad dinámica. Desarrollo de células tumorales resistencia a taxol es típicamente asociados con el aumento de expresión de la bomba de eflujo de drogas P-glicoproteína y / o alteraciones en los microtúbulos. Recientemente, los cambios en la dinámica de la inestabilidad de los microtúbulos también se han asociado con el desarrollo de resistencia a taxol en un cáncer de pulmón de células. Hemos establecido un 250 veces taxol resistentes a carcinoma de ovario humano sublínea (2008/13/4) que no muestra las típicas alteraciones asociadas con el desarrollo de resistencia a las drogas.

Resultados

Utilizando el diferencial de mRNA de visualización técnica, se observó incremento en la expresión de una subunidad alfa de los nucleótidos guanina-proteína de unión, G α i1, en el taxol resistentes a carcinoma de ovario humano líneas celulares en comparación con las células parentales 2008. Varias isoformas de la α-subunidad de la proteína G se han identificado y el G α i (inhibitoria) es llamada así porque inhiben la actividad de Adenilato ciclasa conducen a la inactivación de AMPc dependiente de la proteína quinasa A (PKA) itinerario. Además, G α i1 se sabe también de obligar a microtúbulos y activa GTPase su actividad y, por tanto, induce depolymerization de los microtúbulos. En el presente estudio demuestran que los niveles intracelulares de cAMP y la actividad PKA fueron mayores en el taxol-resistentes 2008/13/4 y 2008/17/4 las células a pesar del incremento en la expresión de G α i1 en estas células. Por otra parte, G α i1 se encontró a no ser localizados en la membrana celular, pero en compartimentos intracelulares en el taxol-sensibles y resistentes a humanos carcinoma de células de ovario. Curiosamente, el aumento de la asociación de G α i1 proteínas y los microtúbulos en el taxol resistentes a las células en comparación con las células parentales 2008 se observó, tanto antes como después del tratamiento de estas células con taxol.

Conclusión

Sobre la base de oponerse a los efectos de taxol y el G α i1 proteína en la dinámica de inestabilidad microtúbulos (taxol suprime microtúbulos inestabilidad dinámica, mientras que el G α i1 proteína inhibe la represión) nuestros resultados indican el funcionamiento de una nueva vía que permita a las celdas para escapar de los efectos citotóxicos de Taxol.

Fondo

El antimitotic de drogas contra el cáncer paclitaxel (taxol) tiene un único mecanismo de acción: a diferencia de otros venenos huso mitótico (a saber. Vinca alcaloides), taxol se une a la N-terminal final de β-tubulina y microtúbulos promueve la asamblea [1 - 3]. El efecto de taxol en la dinámica del microtúbulo se ha estudiado ampliamente en los sistemas de células libres así como en las células vivas [4 - 6]. Observaciones hechas por lo tanto, indicar el taxol inducida por la supresión de la dinámica del microtúbulo inhibe el ritmo y la magnitud de la reducción de microtúbulos aberrante mitótico causando la formación de ejes y la detención del ciclo celular [4 - 6].

Sobreexpresión de P-glicoproteína (P-gp, que funciona como una bomba de eflujo de drogas, [7, 8]] es el fenotipo común observado en el taxol resistentes a las células tumorales. Además, teniendo en cuenta su objetivo intracelular, no es de extrañar que la resistencia a taxol también se ha asociado con alteraciones en los microtúbulos como resultado una reducción de las drogas afinidad o disminución de los niveles intracelulares de polimerizado tubulina y / o cambios en la expresión de determinados isotipos de tubulina [8 -- 10]. Recientemente, Goncalves et al. informó de una mayor asociación de microtúbulos dinámica con taxol resistencia en cáncer de pulmón de células [11]. Sin embargo, no identificar los mediadores celulares de la mayor comportamiento dinámico de microtúbulos en el taxol resistentes a las células.

Hemos establecido una serie de taxol resistentes a adenocarcinoma de ovario humano líneas celulares [12]. El> 1500 veces taxol-resistentes 2008/17/4 línea celular que aparece la clásica resistencia a múltiples fenotipo con sobreexpresión de P-gp y resistencia cruzada a otras drogas de productos naturales [12]. En contraste, el 2008/13/4 línea celular, que fue 252 veces resistente a taxol relativo a la línea celular de sus padres (2008), no presentan sobreexpresión de la P-gp y / o alteraciones en los microtúbulos [12]. La acumulación intracelular de taxol en el 2008/13/4 células fue similar al observado en 2008 células. El in vitro vinculante de taxol a microtúbulos semi-purificado de la 2008/13/4 células y 2008 fue también idéntico [12]. Los niveles basales de diversos α-y β-tubulina isotipos (excepto B α-1), así como polimerizados tubulina fueron similares en el taxol resistentes a los padres y las células (inédito observación). Esto sugiere que los mecanismos que no hayan sido identificados y no típicamente asociados con el desarrollo de resistencia a taxol-se aplicaría en los 2008/13/4 sub-línea. Teniendo en cuenta la utilidad potencial de taxol en el tratamiento de la enseñanza primaria y cisplatino-resistentes a los cánceres de ovario, es de gran importancia clínica para dilucidar estos mecanismos. Emplear el ARNm análisis diferencial de visualización que hemos identificado un incremento en la expresión de una proteína implicada en el G-proteína unida vía de transducción de señales, denominado G α i1, en el taxol resistentes a las células en comparación con las células de sus padres.

El G α proteínas, sobre la base de comparación de secuencias se dividen en cuatro clases, Gs, Gi, GQ y G12-13. El G α i es el marco regulador de señalización molécula que inhibe la actividad Adenilato ciclasa [13]. El aumento de expresión de G α i1 podría inhibir la actividad Adenilato ciclasa y, por tanto, el Camp de transducción de señales mediadas (que actúan a través de la PKA). Disminución de la actividad PKA conduce a la activación de la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) vía iniciada por c-Raf-1 [14]. En las células en reposo, el G α i heterotrimeric forma un complejo (con la β-y γ-guanina subunidades de la proteína de unión de nucleótidos) que proporciona señal de acoplamiento a través de una serie de proteínas G-receptores acoplados [13]. Tras la activación de una señal, el receptor interactúa con la membrana plasmática obligado heterotrimeric G-proteína y cataliza el intercambio de obligado PIB para el GTP en la subunidad α. Posteriormente, el GTP-G obligado subunidad α y βγ de la subunidad de disociar el receptor, así como el uno del otro. La "activa" subunidad α-y el "libre"-subunidad βγ iniciar la respuesta celular de alterar la actividad de las moléculas efectoras intracelulares [13].

Sin embargo, estudios recientes han indicado que una gran fracción del G α i proteínas muestran localización perinuclear [15, 16]. Además, Roychowdhury et al. [17] han demostrado que la α G i1 específicamente se une a los microtúbulos y se activa el GTPase actividad de tubulina que resulta en una mayor dinámica de microtúbulos y el aumento de la inestabilidad depolymerization de los microtúbulos. Por lo tanto, la hipótesis de que el aumento de G α i1 asociación con los microtúbulos en el taxol resistentes a las células sería suficiente para inhibir el taxol inducida por la supresión de microtúbulos dinámica de inestabilidad tal que permita el taxol-obligado a depolymerize microtúbulos. Esto influir negativamente en los efectos citotóxicos de taxol (en la formación de microtúbulos estables conducen a arresto mitótico) y proporcionar un mecanismo mediante el cual resistentes a drogas células sería capaz de eludir los efectos citotóxicos de taxol. Sobre la base de nuestros resultados presentados en este estudio, así como las de Roychowdhury et al. [17] y Goncalves et al. [11], es concebible que el aumento obligatorio de G α i1 con los microtúbulos en la droga-resistentes a las células podría inhibir el taxol inducida por la supresión de la dinámica de microtúbulos, lo que permite a las células para completar la mitosis.

Resultados

Dos taxol-resistentes sublines se utilizaron en este estudio. La sublínea 2008/17/4 clásica muestra un fenotipo MDR, un incremento en la expresión de la P-gp y la disminución de la acumulación intracelular de taxol [12]. En contraste, el 2008/13/4 sublínea son insignificantes P-gp expresión y no defecto en la acumulación intracelular de taxol [12]. Los niveles basales de tubulina expresión fueron similares en los padres de 2008 y el taxol-2008/13/4 resistentes a las células y la in vitro vinculante afinidades de taxol a microtúbulos purificada derivada de estas células no fueron significativamente diferentes [12].

Expresión diferencial de G α i1 en el taxol resistentes a las células

Para identificar los genes cuya expresión es inducida o bien la reducción en el taxol resistentes a las células, en comparación sistemática de los patrones de ARNm pantalla entre los padres (2008) y el taxol-resistente (2008/13/4 y 2008/17/4) células. Hemos escogido sólo aquellos grupos que muestran una expresión diferencial consistente en la duplicados de las muestras de la 2008/13/4 células y / o 2008/17/4 células en comparación con el 2008 células. Por otra parte, elegimos sólo aquellas bandas que exhibieron al menos 3 veces el cambio en la intensidad densitométricas. Por lo tanto, identificó el upregulation de la alfa-i1 subunidad de la guanina proteína de unión de nucleótidos del mRNA (G α i1; datos no presentados) en el 2008/13/4 y 2008/17/4 células en comparación con el 2008 células. El incremento en la expresión de la α G i1 a las células resistentes al taxol fue confirmada por el norte y el Western Blot análisis. Como se muestra en la Figura 1, un 15 veces y 6 veces mayor expresión de G i1 α (ARNm y proteínas, respectivamente) se observó en el 2008/13/4 y 2008/17/4 células, respectivamente, en comparación con el 2008 células.

El efecto de taxol en los niveles de AMPc y PKA en la actividad de sus padres y taxol resistentes a las células

El G α i es una molécula de señalización de reglamentación que inhibe la actividad Adenilato ciclasa [13]. El aumento de expresión de G α i1 podría inhibir la actividad Adenilato ciclasa y, por tanto, el Camp de transducción de señales mediadas (que actúan a través de la PKA). Se evaluaron los niveles basales de AMPc, así como la actividad basal PKA en el de sus padres y taxol resistentes a las células. Efecto de taxol en la exposición los niveles intracelulares de cAMP y la PKA actividad también se evaluó en estas células.

El nivel basal de cAMP en el 2008, 2008/13/4 y 2008/17/4 células se midió utilizando un kit de inmunoensayo competitivo de Laboratorios de Investigación de Biomol (Plymouth Meeting, PA). Sorprendentemente, el nivel basal de cAMP fue de 4,5 veces y 9 veces más altos que en el 2008/13/4 células en comparación con el 2008 y 2008/17/4 células, respectivamente (Fig. 2]. Estos resultados indican que el incremento en la expresión de G α i1 observado en el 2008/13/4 células no inhibe la actividad basal de CA en estas células. En contraste, el tratamiento (para 16 hr), con aumento de la concentración de taxol no alteró los niveles de cAMP en el 2008, 2008/13/4 y 2008/17/4 células significativamente. Es probable que la exposición a taxol provoca una leve inhibición de la actividad Adenilato ciclasa con la consiguiente disminución insignificante en los niveles intracelulares de campo observados (Fig. 2].

A continuación, se determinó la actividad de AMPc dependiente de la proteína quinasa A en los padres y taxol resistentes a las células. Como se muestra en la Fig. 3, la actividad de PKA en el 2008 células no tratadas fue de 8 unidades / mg de proteína y es 4 veces (32 unidades / mg de proteína) y 2,5 veces (21 unidades / mg de proteína) más alto en el 2008 / 13 / 4 y el 2008/17/4 células, respectivamente. El tratamiento (de 16 hr) con el aumento de las concentraciones de taxol no afectan significativamente la actividad de PKA en cualquiera de las líneas celulares estudiadas (Fig. 3].

Sobre la base de estas observaciones llegamos a la conclusión de que la sobreexpresión de α G i1 a la 2008/13/4 y 2008/17/4 células no inhibe el AMPc dependiente de vías de transducción de señales, de lo contrario la inhibición de la Adenilato ciclasa (debido al aumento de la actividad de α G i1) habría dado lugar a una disminución en los niveles intracelulares de cAMP y una disminución en la actividad del AMPc dependiente de PKA.

Asociación de G α i1 con los microtúbulos en las células resistentes al taxol

Los resultados presentados hasta el momento indican que el modo de acción del G α i1 en el taxol resistentes a las células tal vez distinta de su capacidad para inactivar AC. Estudios recientes han demostrado que la α G i1 específicamente se une a los microtúbulos y se activa el GTPase actividad de tubulina [17]. Teniendo en cuenta que el objetivo de celular es el taxol microtúbulos, queríamos investigar si las alteraciones en la interacción del G α i1 con los microtúbulos acompañado el desarrollo de resistencia a taxol la 2008/13/4 y 2008/17/4 las células.

Utilizando la microscopía confocal (Fig. 4] y la extracción diferencial (Figs. 5, 6], que ahora muestran una mayor asociación de G α i1 con los microtúbulos en el taxol resistentes a las células en comparación con las células sensibles, tanto antes como después del tratamiento con taxol . Cabe señalar aquí que la vincristina, un fármaco contra el cáncer conocidos por depolymerize microtúbulos no aumentó la asociación de G α i1 con los microtúbulos, ya sea en el 2008 o el 2008/13/4 y 2008/17/4 células (Figs. 4 y 7].

Como se muestra en la Fig. 4, una clara localización citoplasmática del G α i1 proteína (verde) se observó en todas las líneas celulares estudiadas. Los microtúbulos (rojo) también fueron teñidas con anticuerpos dirigidos contra la β-tubulina. Co-localización de G α i1 con microtúbulos (evaluada por la presencia de coloración amarilla) no se observó en las células no tratadas 2008, pero fue claramente visible en el taxol-resistentes 2008/13/4 y 2008/17/4 células. Por otra parte, el tratamiento con taxol inducida por un tiempo-dependiente aumento de la asociación de α i1 G proteínas y los microtúbulos en la red taxol resistentes a las células. Este fenómeno fue totalmente ausente en las células parentales 2008 a 4 y 24 horas post-tratamiento con taxol. Sin embargo, después de 24 horas de exposición a taxol, unos 2008 células (<1%) está representada con manchas co-localización del G α i1 proteínas con los microtúbulos. También evaluó los efectos de la vincristina sobre la distribución de celulares G α i1 proteína. Como se muestra en la Fig. 4, el tratamiento con vincristina disminuyó la asociación del G α i1 proteínas con los microtúbulos en el taxol resistentes a las células sin afectar a su localización en células 2008. Estos resultados ilustran claramente que el uso de G α i1 es diferencialmente relacionados con los microtúbulos en el taxol resistentes a las células en respuesta a taxol.

Además de la conservación in-situ la localización del G α i1 con los microtúbulos también evaluó la asociación de G α i1 con los microtúbulos y el efecto del tratamiento sobre el taxol esta asociación en el 2008 y el 2008/13/4 células utilizando un procedimiento de extracción diferencial. Como se muestra en la Fig. 5, la utilización de 5 μ g de proteína / carril, G α i1 no se ha encontrado para ser asociado con el citoesqueleto fracción en el 2008 células no tratadas o la 2008/13/4 células. Sin embargo, cabe señalar que el aumento de la concentración de proteínas a 30 μ g permite mostrar un bajo nivel basal de G α i1 obligado a la fracción citoesqueleto en el 2008 y el 2008/13/4 células (como se muestra en la Fig. 7]. Tratamiento de 2008 células con 25 nM (IC 50) o 500 nM (20 × CI 50) concentración de taxol no vinculante de inducir α i1 G con los microtúbulos. En marcado contraste, el tratamiento de la 2008/13/4 células con 500 nM o 5 μ m (IC 50) concentración de taxol demostraron un incremento dosis-dependiente de la presencia de α G i1 en el citoesqueleto fracción.

A continuación, se evalúa la distribución de α G i1 a las distintas fracciones celulares (citoplasma, citoesqueleto, membrana y nucleares) antes y después del tratamiento con taxol en el 2008, 2008/13/4 y 2008/17/4 células. Como se muestra en la Fig. 6, expresión de G α i1 fue significativamente mayor en el conjunto de células sin tratar de lisados 2008/13/4 y 2008/17/4 células en comparación con 2008 células. El tratamiento con taxol no afectó los niveles de α G i1 a la 2008/13/4 lisado de células enteras, sin embargo una disminución significativa en G α i1 niveles se observó en todo el lisado de células obtenidas a partir de 2008 y 2008/17/4 células tratadas con taxol para el 24 AR. Muy baja a niveles insignificantes de G α i1 fueron observados en la membrana fracción de cada línea celular (datos no presentados) y el tratamiento con taxol no aumentó el G α i1 niveles en la membrana fracción. Localización de G α i1 en la fracción nuclear no se observó en cualquier líneas celulares (datos no presentados). Similares a los resultados obtenidos anteriormente (Fig. 5], asociación de G α i1 con los microtúbulos no se observa en cualquier momento (antes o después del tratamiento taxol) en el 2008 células. En contraste, un tiempo que dependen de aumento en la partición de G α i1 al citoesqueleto fracciones se observó en las células 2008/13/4. En caso de las células 2008/17/4, una parte importante de G α i1 ya estaba asociada con los microtúbulos en las células no tratadas, que no se vio afectado por el tratamiento taxol. Cuando evaluamos la localización de G α i1 en la fracción citoplásmica en no tratados y tratados con taxol células, se observó que los niveles de α soluble G i1 no tratados en 2008 y 2008/13/4 células fueron similares, mientras que niveles muy bajos de α soluble G i1 se observaron en los 2008/17/4 células. Esta última opción podría ser debido a una mayor asociación de G i1 α y los microtúbulos en las células no tratadas 2008/17/4. El tratamiento con taxol de 24 Horas disminuido los niveles de α soluble G i1 en todas las líneas celulares. Sobre la base de estas observaciones y los reportados en la Fig. 4 (in-situ immunolocalization usando microscopía confocal) Se postula que, si bien la disminución en los niveles de citoplásmica G α i1 en el 2008 células podría ser un resultado directo del aumento de la degradación de las proteínas, disminución de la α soluble G i1 en respuesta a taxol en el 2008/13/4 células y posiblemente 2008/17/4 células se debe a una mayor compartimentación del G α i1 citoplásmica de la fracción a la fracción citoesqueleto.

Estamos próximos a determinar si la diferencial de particionado de α G i1 a los microtúbulos en la fracción taxol células resistentes a las drogas fue específicos (Figura 7]. Se han tratado los padres y taxol-resistente (2008/13/4) células con vincristina y evaluaron los niveles de α G i1 en el lisado de células enteras y en el citoesqueleto fracción. Vincristina se utilizó porque se trata de (como el taxol) antimitotic una droga contra el cáncer, sin embargo a diferencia del taxol, vincristina induce depolymerization de los microtúbulos. Vincristina (50 nM) se redujo el nivel de G α i1 en el 2008 lisado de células enteras (Figura 7, carril 2) sin afectar el total de los niveles en los 2008/13/4 células (Figura 7, carril 4). Además, en contraste con la observación formulada con taxol, el tratamiento de 2008 (50 nM) y 2008/13/4 (5 μ M) células con vincristina disminuyó la asociación de G α i1 citoesqueleto con la fracción (Figura 7, los carriles 6 y 8, respectivamente ). Estos resultados sugieren que el diferencial de particionado de α G i1 a los microtúbulos fracción observada en los tratados con taxol resistentes a drogas es, en efecto, células de drogas específicas aportar otras pruebas que G α i1 puede estar implicada en la inhibición de la taxol inducida por la supresión de la dinámica del microtúbulo.

Discusión

Heterotrimeric las proteínas G transduce señales en virtud de su localización en estrecha yuxtaposición con la proteína G-receptores acoplados a la parte citoplásmica de la membrana plasmática [13]. Inducir a los receptores activados de cambio del PIB para el GTP en la subunidad α G y, por tanto, mediar en la disociación de G α y βγ-subunidades [13]. Disociarse G α i1 disminuye los niveles de cAMP (debido a la inhibición de Adenilato ciclasa) y, por tanto, suprime el AMPc dependiente de PKA vía. Sin embargo, en el presente estudio, a pesar de incremento en la expresión de G α i1, bajo condiciones basales y en presencia de taxol, los niveles de AMPc intracelular, así como la PKA actividad fue mayor en el taxol resistentes a las células (Figs. 2 y 3] en comparación con la de sus padres células y> 95% del G α i1 muestra la localización intracelular (ya sea en el citoplasma y / o en el citoesqueleto fracción; Fig. 4, 5, 6] a los padres y taxol resistentes a las células. Por otra parte, el tratamiento con taxol inducida por una diferencia de particionamiento de G α i1 en el citoesqueleto fracción específicamente en el 2008/13/4 y 2008/17/4 células.

Estos resultados sugieren que la maquinaria bioquímica necesaria para la orientación de G i1 α no es operativa bajo condiciones basales o bajo condiciones de estrés asociado con la exposición a taxol o bien a la patria potestad o en el taxol resistentes a las células. Varios estudios indican que covalentes modificación, incluida myristoylation y palmitoylation de G α subunidades son importantes en su orientación a la membrana [18, 19]. Aunque activada constitutivamente mutantes de la subunidad α G han sido identificados, su importancia en la localización celular parece estar asociada con la falta de afinidad de estos mutantes con la subunidad βγ-pareja, una interacción necesaria para la localización de membrana [20]. Por lo tanto, es probable que la alteración en la conformación del G α i1 proteínas debido a postraduccional modificaciones y / o cambios en los niveles de expresión de proteínas asociadas (s) (que ayuda a la orientación a los microtúbulos) se encarga de la localización diferencial de G α i1 con los microtúbulos en el taxol resistentes a las células. Membrana celular localización de G α i1 es necesaria para que su efecto inhibitorio sobre la Adenilato ciclasa vía. La ausencia de G α i1 localización de la membrana celular en el taxol-sensibles y resistentes al cáncer de ovario humano las líneas celulares utilizadas en este estudio, podría explicar la falta de correlación entre el aumento de los niveles intracelulares de G α i1 en el taxol resistentes a las células, con los celulares cAMP contenido y la actividad de PKA en estas células.

G i1 α se expresa en el 2008, aunque a niveles más bajos que en el taxol resistentes a las células, por lo que no está claro de por qué la orientación específica de α G i1 a los microtúbulos (antes y después del tratamiento con taxol) se observa sólo en el taxol resistentes a las células . Si bien es posible que las diferencias en la modificación postraduccional del G α i1 proteína podría ser responsable de su orientación microtúbulos en el taxol resistentes a las células, también es probable que el tratamiento de células 2008/13/4 con taxol induce (a) la expresión de un "chaperón" ; Proteína (vinculado a los microtúbulos y expresó sólo en el taxol resistentes a las células) que podría obligar a la solubles G i1 α y por lo tanto, aumentar su asociación con el citoesqueleto o (b) unión de G α i1 con un "chaperón" de proteínas aumenta la capacidad de la complejos para interactuar con los microtúbulos. Mientras que una tercera posibilidad existe, es decir, alteración en los microtúbulos sí que aumenta la afinidad de G α i1 vinculante, ese cambio daría lugar a un aumento constitutiva de la asociación G α i1 con los microtúbulos, un fenómeno no observado en el 2008/13/4 células.

Hemos tenido inicialmente la hipótesis de que la observada upregulation del G-proteínas podrían funcionar a través de la Adenilato ciclasa - cAMP - PKA mediada por la vía de transducción de señales en el desarrollo de resistencia a taxol. En caso de las células 2008/13/4, aunque los cambios fueron identificados en esta vía de estas no puede atribuirse directamente como un efecto de incremento en la expresión de la α G i1. Estas observaciones hacen un argumento que los demás y poco sutil efectos del G α i1 pueden estar involucrados en el desarrollo de taxol resistencia observada en el 2008/13/4 y 2008/17/4 células.

Además de ser obligado membrana, varios informes [15, 16], incluido el presente estudio han demostrado que la α G i1 proteína está presente en la región perinuclear de la célula y es probable que participan en la transferencia de señales de superficie celular de receptores intracelulares a las moléculas efectoras. Wang et al. demostrado recientemente que la une a la tubulina purificada G i1 α y α s G proteína con una alta especificidad, pero no a los demás miembros del G α i familia de proteínas [21]. Por otra parte, Roychowdhury et al. demostrado que la unión de α G i1 a dímeros de tubulina y / o microtúbulos dado lugar a la activación de tubulina GTPase actividad y la modulación de la dinámica del microtúbulo polimerización [17]. Un elegante modelo de regulación de los microtúbulos in vivo dinámica de G α i proteínas propuesto por estos autores sugieren que la unión de la proteína G al final de un microtúbulos induce la hidrólisis de GTP y la posterior pérdida de la estabilización de la tapa, lo que resulta en microtúbulos depolymerization (una catástrofe caso) [17]. En contraste, unión de taxol a microtúbulos conduce a la estabilización de los microtúbulos del polímero, en otras palabras, supresión de la inestabilidad dinámica de microtúbulos (4-6). Tomados en conjunto, es muy atractiva para especular que el incremento en la expresión de la α G i1 proteína sería capaz de inducir depolymerization del taxol-microtúbulos estabilizado en los polímeros resistentes al taxol 2008/13/4 y 2008/17/4 las células, lo que resulta en finalización de la mitosis y la posterior división celular.

Conclusión

Se postula que todo lo demás en igualdad de condiciones, la presencia de una mayor cantidad de α G i1 proteína en las cercanías del taxol sujetos a microtúbulos es probable que anulen la supresión efectos de la droga y permitir a microtúbulos depolymerize al final de la mitosis y completar el ciclo celular . La idea es que G α i1 con su capacidad para activar la intrínseca-tubulina GTPase actividad permitirá a taxol-estabilizado a depolymerize microtúbulos. Estudios están en curso en este laboratorio para determinar si ese fenómeno se produce in vitro utilizando microtúbulos purificado de las células resistentes al taxol.

Métodos
Materiales

Taxol se obtuvo a partir de las drogas de síntesis y la Subdivisión de Química, Programa de Desarrollo Terapéutica de la División de Tratamiento de Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud. Se disuelve en DMSO a una concentración final de 20 mm y la concentración del disolvente no superó nunca el 0,1% en cualquier protocolo experimental. [α-32 P] dCTP (3000 Ci / mmol) fue adquirido de Dupont-NEN Research Products. El azar cebado kit de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) se utilizó para etiquetar la radiación α G i1 cDNA. El aumento de quimioluminiscencia se reactivos bioquímicos de Pierce (Rockford, IL). Los anticuerpos utilizados en este estudio y sus proveedores son; conejo policlonal G α i1 de anticuerpos fue de Biotecnología Inc Santacruz (Santa Cruz, CA), mouse monoclonal β-tubulina de anticuerpos fue de BD Biosciences (San Diego, CA), conjugado con rodamina-anti - ratón y el anticuerpo-conjugado con FITC anti-conejo de anticuerpos fue de sustancias bioquímicas Pierce (Rockford, IL).

Líneas celulares

Los padres humanos de carcinoma de células de ovario, 2008 taxol y sus derivados-resistente (2008/13/4 y 2008/17/4) se mantuvieron como hemos descrito anteriormente [12]. El 2008/13/4 y 2008/17/4 las células fueron derivados por la exposición de las células a 2008 gradual aumento de las concentraciones de taxol [12]. El 2008/13/4 células son transversales resistentes a otros fármacos antimitotic (a saber., Vincristina, vinblastina) y etopósido, pero no son resistentes a cruzar a adriamycin y cisplatino. El 2008/13/4 células no tienen defectos en el transporte de taxol, expresar niveles insignificantes de P-glicoproteína y son 252 veces resistente a taxol en comparación con el 2008 células. En cambio el> 1500 veces taxol-2008/17/4 células resistentes a mostrar un clásico multirresistentes fenotipo con resistencia cruzada a todo producto natural probado drogas, la expresión de altos niveles de P-glicoproteína y un importante defecto en la acumulación intracelular de Taxol. Sin embargo, la unión de taxol a microtúbulos es similar en el taxol resistentes a los padres y las células [12].

Los niveles de AMPc intracelular

Los niveles de AMPc intracelular en el 2008, 2008/13/4 y 2008/17/4 células se determinaron utilizando una versión acetilado de un campamento de medición kit de Laboratorios de Investigación de Biomol (Plymouth Meeting, PA). Una curva estándar de conocer las concentraciones de cAMP acetilado se generó para cada experimento. El campamento (pmol / mg de proteína) en las células resistentes al taxol se comparó con los observados en el 2008 células considerarse como 1.

AMPc dependiente de la actividad PKA

PKA actividad se determinó utilizando el ensayo colorimétrico Pierce Kit (Rockford, IL) que utiliza un marcado fluorescente Kempeptide (PKA-péptido específico (LRRASLG) sustrato). Los padres y taxol resistentes a las células fueron sembradas a una densidad de 2 × 10 6 mm cells/100 placa y se incubaron durante 24 horas. Posteriormente, las células o bien se deja sin tratamiento o tratadas con diferentes concentraciones de taxol para los períodos de tiempo indicado. Si no se trata taxol y células tratadas fueron homogeneizados en un Dounce homogeneizadora (10 golpes con un estricto ajuste pestle) en una solución tampón que contiene 25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 10 mM DTT y cóctel inhibidor de la proteasa. El homogenado se centrifuga a 13000 × g durante 20 minutos y la PKA se midió la actividad (por triplicado) en el sobrenadante la fracción como por las instrucciones del kit de proveedor. Los valores mostrados son media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes.

Proteína preparativos

El 2008, 2008/13/4 y 2008/17/4 células fueron sembradas a una densidad de 1 × 10 6 / ml y se incubaron en condiciones de crecimiento normales durante 36 horas. Posteriormente, las células se deja sin tratamiento o tratadas con diferentes concentraciones de taxol o vincristina para los períodos de tiempo indicado. Al final de cada período de tiempo las células fueron lavadas con PBS refrigerados (3 ×) y de diversas fracciones proteicas fueron extraídos como se indica a continuación.

Lisado de células enteras

Plenario células lisado fue preparado a partir de cada una de la línea celular de células de raspado en una solución tampón que contiene 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% (v / v) Triton-X - 100, 0,5% (v / v) Nonidet P40, 2,5 mM pirofosfato de sodio, 1 mM de sodio orthovanadate, 50 mM de fluoruro de sodio y 1 × inhibidor de la proteasa y cóctel incubando en hielo durante 15 minutos. A continuación, el lisado se centrifugó a 13000 × g durante 20 min y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Las proteínas fueron separadas en una SDS-PAG y trasladado a una membrana de PVDF. Western Blot análisis se realizó utilizando anticuerpos policlonales de conejo contra el G i1 α (Santacruz Biotecnología Inc, Santa Cruz, CA) y el aumento de quimioluminiscencia de reactivos bioquímicos Pierce (Rockford, IL).

Citoesqueleto fracción proteica

El citoesqueleto fracción se aisló en esencia, tal como se describe anteriormente [22]. En pocas palabras, el adjunto células se incuban en un microtúbulos de la estabilización de amortiguación (0,1 M TUBOS, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 2 M glicerol, pH 8,0) durante 20 min. Posteriormente, la proteína citosólica fueron retirados por incubando las células en la estabilización de los microtúbulos una solución tampón que contiene 0,1% NP-40 y un inhibidor de la proteasa cóctel para 20 min. El citoesqueleto fracción (que se adjunta a los platos de plástico) se raspó en RIPA buffer (PBS que contenga un 1% NP-40, el 0,5% de sodio deoxycholate y 0,1% SDS) que contiene un inhibidor de la proteasa cóctel. Este procedimiento de extracción selectiva ha demostrado ser ideal para la preservación de la asociación entre el citoesqueleto y otras moléculas reguladoras asociados [22]. El citoesqueleto fracción (5 μ g de proteína / carril) fue sometido a SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas PVDF y Western Blot se realizó utilizando el anticuerpo policlonal contra el G α i1, tal como se describe anteriormente.

Subcelular fracciones proteicas

The cells were processed for the extraction of cytoplasmic and nuclear fraction utilizing the protocol supplied by manufacturer of the NE-PER extraction kit (Pierce Biochemicals, Rockford, IL). The membrane fraction was extracted utilizing the single step Mem-PER extraction kit and protocol supplied by the manufacturer (Pierce Biochemicals, Rockford, IL). Protein (5 – 20 μg/lane) from each fraction were resolved on a 12% (w/v) SDS-PAG and then transferred to a PVDF membrane. Western blotting was performed utilizing the Gαi1 polyclonal antibody (Santacruz Biotech, Inc., Santacruz, CA) as described above.

Northern blotting analysis

Total RNA (20 μg) extracted from each cell line was fractionated on 1% agarose-formaldehyde gel and then stained with ethidium bromide to ensure equal RNA loading. Thereafter the RNA was transferred to a Nylon membrane and probed with a full-length Gαi1 cDNA labeled with 32 P-dCTP with a random priming kit from Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Hybridization was performed at 55°C overnight and nonspecific binding was removed by washing the nylon membrane in a high stringency buffer at 55°C for 30 min.

Immunolocalization of Gαi1

To immunolocalize the Gαi1 protein, the 2008, 2008/13/4 and 2008/17/4 cells were grown on tissue culture-treated slides. After 48 hr, cells were treated with either taxol or vincristine (50 nM in case of 2008 cells, and 5 μM in case of the 2008/13/4 and 2008/17/4 cells) for 4 hr and 24 hr. At the end of each time period, the cells were rapidly rinsed in chilled PBS and then fixed with 4% (w/v) paraformaldehyde and processed for immunostaining. After blocking nonspecific binding sites by incubating the slides with 5% (v/v) normal goat serum, the slides were incubated with primary antibody directed against Gαi1 (1:100 rabbit polyclonal) and β-tubulin (1:200 mouse monoclonal) for 1 hr. After washing in chilled PBS (3×), the slides were incubated with FITC-conjugated anti-rabbit antibody or rhodamine-conjugated anti-mouse antibody for 30 min (Pierce Biochemicals, Rockford, IL). At the end of the incubation, the slides were washed again in PBS and mounted in media containing anti-fade. Localization of Gαi1 and β-tubulin was accomplished using an Olympus Confocal microscope.

Abbreviations

Taxol, Paclitaxel; P-gp, P-glycoprotein; Gαi1, guanine nucleotide binding protein, subunit alpha i1; PKA, Protein kinase A; MAPK, Mitogen-activated protein kinase; PBS, phosphate-buffered saline; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; MDR, multidrug-resistance.

Competing interests

The author(s) declare that they have no competing interests.

Agradecimientos

Supported by NIH Grant RO1-CA76400 to HKP