Journal of Molecular Signaling, 2006; 1: 2-2 (más artículos en esta revista)

Levadura Ste2 receptores como herramientas para el estudio de proteínas de mamíferos y adaptadores de quinasas involucradas en el tráfico del receptor

BioMed Central
Dezhong Yin (yin@pharm.sunysb.edu) [1], Elena Shumay (shumay@pharm.sunysb.edu) [1], Hsien-yu Wang (wangh@pharm.sunysb.edu) [2], Craig C Malbon (craig@pharm.sunysb.edu) [1]
[1] Departamento de Farmacología de la Diabetes y Enfermedades Metabólicas Centro de Investigación, Facultad de Medicina, SUNY / Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-8651, EE.UU.
[2] Fisiología y Biofísica, Diabetes y Enfermedades Metabólicas Centro de Investigación, Facultad de Medicina, SUNY / Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-8651, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Que los receptores de mamíferos pareja a través de efectores heterotrimeric G proteínas (por ejemplo, beta 2-adrenérgicos) y con los receptores tirosina quinasa intrínseca actividad (por ejemplo, la insulina y el IGF-I receptores) constituyen los puntos proximal dominante de dos vías de señalización celular. Los receptores acoplados a proteínas G pueden ser sustratos de tirosina quinasas, la integración de las señales de ambas vías. Células de levadura, por el contrario, mostrar la proteína G-junto receptores (por ejemplo, alfa-factor receptor Ste2 feromona) que han evolucionado en ausencia de receptores tirosina quinasas, tales como las que se encuentran en organismos superiores. Hemos tratado de comprender los motivos en la proteína G-junto receptores que actúan como sustratos para los receptores de tirosina quinasas y el funcional consecuencia de dicha fosforilación en los receptores de la biología. Nosotros expresamos en humanos HEK 293 células de levadura de tipo salvaje Ste2 así como una quimera Ste2 con la ingeniería frente al citoplasma de dominios de la beta 2-adrenérgicos y los receptores a prueba el secuestro en respuesta a la activación del receptor de insulina de tirosina quinasa.

Resultados

La levadura Ste2 se ha expresado en células HEK 293. En respuesta a alfa-factor, Ste2 señales a la mitogen-activated vía proteína quinasa y interioriza. Lavar de agonistas y antagonistas Además de no dar lugar a Ste2 reciclado a la membrana celular. Internalizado Ste2 no es significativamente degradada. Beta 2-adrenérgicos mostrar internalización en respuesta a agonistas (isoproterenol), pero rápidamente reciclar a la membrana celular después de lavado de agonistas y antagonistas Además de. Beta 2-adrenérgicos mostrar internalización en respuesta a la activación de los receptores de insulina (es decir, cruz de regulación), mientras que Ste2 no. La sustitución de los dominios frente al citoplasma de la β 2-adrenérgicos para los de Ste2 crea un Ste2/beta 2-adrenérgicos quimera que muestra la insulina estimula la internalización.

Conclusión

Chimera compuesto de la levadura Ste2 en que los dominios de proteínas de mamíferos G-junto receptores han sido sustituidos, cuando se expresa en las células animales, proporcionan una herramienta única para el estudio de la regulación de la proteína G-receptor acoplado trata de mamíferos del receptor tirosina quinasas y adaptador de proteínas.

Fondo

G-proteína unida receptores (GPCR) son intrínsecos proteínas de membrana que transduce agonista vinculante en heterotrimeric activación de las proteínas G, un paradigma para la ampliación de la señalización de células de levadura a los mamíferos [1]. La levadura STE2 producto génico es un heptahelical, GPCR que se une y transduces señalización intracelular de la α-factor de feromonas [2, 3]. Recientemente hemos logrado en la expresión de la levadura α-factor receptor de feromonas en humanos Ste2 células HEK293, lo que demuestra que Ste2 es plenamente funcional y capaz de estimular la activación de la mitogen-activated proteína quinasa Erk1 / 2 en respuesta al factor α-[4]. En la levadura, la activación de Ste2 conduce a la internalización, ubiquitination, y la rápida degradación de este GPCR. A diferencia de la situación en células de levadura, en células HEK 293 α-factor estimula la internalización de Ste2, pero no conduce a una reducción significativa del número celular complemento del receptor [4]. Células de levadura no expresar los receptores tirosina quinasas y Ste2 ha evolucionado en su ausencia. Nosotros expresamos la levadura α-factor de receptores de feromonas (Ste2) en células HEK293 humanos con el fin de emplear Ste2 como objetivo los receptores heptahelical motivos en que se encuentran en mamíferos GPCRs podría insertarse el fin de explorar la contribución (s) de dominio insertado (s ) A los receptores de la trata de los receptores tirosina quinasas.

Resultados

Pusimos a prueba si el Ste2 interiorizado, que no están sujetos a una rápida degradación, el reciclado de compartimiento citosólico a la membrana celular una vez agonista de acción se dio por terminada, una propiedad de la mayoría de los miembros de la superfamilia de GPCRs mamíferos [5]. HEK293 células fueron transfectadas transitoriamente, ya sea con proteína verde fluorescente de etiquetado Ste2 (Ste2-GFP) o GFP-etiquetados β 2 AR (β 2 AR-GFP, figura 1] y vistos por microscopía confocal. Expresión de un receptor fue ensayada por inmunotransferencia y radioligand vinculante (no se muestra). En ausencia de α-factor, Ste2 se expresaron en gran medida de la membrana celular (figura 1; flechas blancas destacar la superficie celular de receptores localizados, Ste2-GFP). Tras 30 minutos de estimulación con α-factor (figura 1; α-factor, 10 μ M, 0,5 h), el grueso de Ste2 se observó a ser internalizado (figura 1; puntas de flecha amarilla destacar internalizado los receptores). Las células fueron lavadas libre de agonista y se incubaron con α-factor antagonista (des-Trp, Ala-3 α-factor mutante, 10 μ m) y la localización de Ste2 seguimiento a las 0,5, 1, 2 y 3 horas más tarde (figura 1; lavado + α-factor antagonista). Internalizado Ste2 sigue siendo localizado en el compartimento citoplásmico en cada una de estas ocasiones, a raíz de lavado de agonistas y antagonistas además de, por ejemplo., No significativo de reciclaje de los internalizado Ste2 volver a la membrana celular se observó.

Al igual que Ste2, β 2 AR-GFP se expresa en células HEK293 se limita en gran medida a la membrana celular (figura 1; flechas blancas destacar la superficie celular de receptores localizados). En presencia de β-agonista adrenérgico (figura 1; isoproterenol, 10 μ M, 0,5 h), β 2 AR muestra muy conocido agonista inducida por la internalización (figura 1; puntas de flecha amarilla destacar internalizado los receptores). - Lave de β-agonista adrenérgico y la adición de un β-adrenérgicos antagonista (figura 1; lavar-out + propranolol, 10 μ M), en marcado contraste con la situación que se observa para Ste2, fue seguido por una rápida y casi completa de reciclado la β 2 AR a la membrana celular dentro de las 3 horas. Para estos estudios, el medio se completó con el inhibidor de la síntesis de proteínas cycloheximide (20 μ g / ml) para suprimir la síntesis de nuevos receptores. Por lo tanto, la habilidad para expresar Ste2 levadura en células de mamífero proporciona una novedosa plantilla que permita el estudio de los receptores de los motivos necesarios para el reciclado de los mamíferos de los GPCRs compartimento citoplásmico a la membrana celular.

Células de mamífero expresar miembros de los receptores tirosina quinasas, incluidos epidermeal receptor del factor de crecimiento, receptor de insulina, derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento, y otros que han demostrado para regular GPCRs a través de la fosforilación de tirosina [6]. Un ejemplo de regulación de los GPCRs de los receptores de tirosina quinasas es bien conocida la insulina counterregulation de β 2 técnicos [6]. Cuando se expresa en células HEK293, β 2 técnicos de visualización de fosforilación de tirosina y la internalización rápida en respuesta a la insulina [6], tal como se observa en hámster conducto deferente células musculares lisas, las células humanas A431, y otras líneas celulares [7]. Tal y como se muestra por microscopía confocal (figura 2], β 2 AR-GFP está localizado en la membrana celular (figura 2, panel a; "basal", flechas blancas destacando la superficie celular de receptores localizados). El β 2 AR son internalizados en respuesta a la insulina (100 nM, 0,5 h), aunque algunos la superficie celular localizada β-AR 2 se siguen observando tras la estimulación de insulina (figura 2, panel b, ver flechas blancas). La capacidad de los receptores tirosina quinasas que responden a la insulina (se muestra), IGF-1 [8], y otros factores de crecimiento para provocar la internalización de los GPCRs, tales como la β 2 AR, que se denomina "counterregulation" [7] .

Células de levadura, en cambio, no expresan receptores tirosina quinasas (por ejemplo, del factor de crecimiento epidérmico receptor, el receptor de insulina y el IGF-I receptor), lo que hace Ste2 un objetivo ideal para el estudio de los motivos de proteínas de mamíferos a través de la cual tirosina quinasas regular GPCRs. El Ste2-GFP está localizado en la membrana celular en condiciones unstimulated (figura 2; panel c), pero a diferencia de la AR β 2 no muestra la internalización en respuesta a un tratamiento de insulina (figura 2; panel d). La incapacidad de observar la insulina para regular el tráfico de Ste2 confirmó nuestra base de esta premisa sobre la levadura del receptor y también creó la oportunidad de emplear el Ste2 GPCR como un modelo en el que la sonda a la proteína motivos por el cual la insulina, así como otros factores de crecimiento, puede regulan la internalización y el reciclado de sustratos GPCR.

Un receptor quimérico que hace uso de la Ste2 exofacial segmentos transmembrana y con la sustitución de los dominios de citoplásmica Ste2 con los de la AR β 2 se ha diseñado y probado si el Ste2 / β 2 AR quimera permitiría a la insulina estimulada internalización. El Ste2 / β 2 AR quimera, tal como se presume, perdió su capacidad de transduce α-factor de estimulación en la activación de la mitogen-activated proteínas quinasas Erk1, 2 (datos no presentados). El GFP-etiquetados Ste2 / β 2 AR quimera, estudiados por microscopía confocal, fue localizada en gran medida a la membrana celular (figura 2; panel e) en ausencia de hormonas añadido. En respuesta a la estimulación de la insulina (100 nM) durante 30 min, la β 2 AR muestran marcadas internalización (figura 2, panel b); Ste2 no mostrar de manera significativa la insulina estimula la internalización (figura 2; panel d). El Ste2 / β 2 AR quimera, por el contrario, muestra la internalización prominente en respuesta a la estimulación de insulina (figura 2; panel f). Evolucionando en la ausencia de proteínas de mamíferos quinasas y adaptador de proteínas que actúan en los receptores GPCR tráfico [9], Ste2 proporciona un objetivo útil para el análisis molecular de proteínas motivos que actúan como sustratos de tirosina quinasas y adaptador de moléculas.

Discusión

Ste2 se encontró para mostrar agonista inducida por la internalización en respuesta a la estimulación de las células con α-factor, pero, a diferencia de los β 2-adrenérgicos2 AR) y la mayoría de los GPCRs, no pudo demostrar el reciclaje a la membrana celular tras la retirada de su agonista, proporcionando un nuevo sistema para la investigación de los motivos decisivos para GPCR reciclado. La insulina estimula, a través de la activación de su receptor tirosina quinasa y la fosforilación de receptores de su sustrato [10], un counterregulation de GPCRs, incluida la β 2 AR [11]. Levadura Ste2 expresada en las células animales, por el contrario, no muestra la insulina estimula la internalización, después de haber evolucionado en ausencia de receptores tirosina quinasas de la naturaleza de la insulina, EGF, IGF-I, y los receptores de PDGF. Un receptor quimérico compuesto por los exofacial y segmentos de transmembrana Ste2 en la que el citoplasma de dominios AR β 2 se sustituyen y se ha diseñado con éxito se expresa en las células animales. A diferencia de Ste2, el receptor quimérico se encontró para mostrar la insulina estimula la internalización. Estos resultados proporcionan una prueba de concepto para la utilidad de la levadura Ste2 expresada en las células animales como una herramienta para el estudio de proteínas de mamíferos y adaptadores de quinasas involucradas en el tráfico de GPCR.

Conclusión

La levadura de feromonas Ste2 GPCR, constituye un valioso ejemplo de la primitiva del receptor de la regulación, en el sentido de que el receptor de la biología es casi lineal agonista de los receptores de unión a la degradación, es decir. Vinculante> activación> internalización> ubiquitination> degradación de la proteosome . En organismos superiores, nuevas capas adicionales de regulación puede observarse en que la retención de los GPCR y / o reciclaje de su internalización son esenciales para el mantenimiento de la señalización adecuada. Obviamente, para los receptores de neurotransmisores en las sinapsis, de un solo hit biología, en el que el receptor se activa y poco después degradado, plantearía un problema enorme capacidad para la biosíntesis de la neurona. Resensitization y el reciclado de los GPCRs internalizado es más la norma para los mamíferos y los sistemas centrales de la cuestión que se plantea es, ¿cómo regular las células de mamífero de células de la superficie tiempos de retención y la capacidad de reciclaje? En el presente trabajo, hemos hecho uso de los conocimientos que la levadura GPCRs funcionan en la falta de aportaciones de los receptores tirosina quinasas que son bien conocidos para desempeñar funciones esenciales en la modulación de GPCRs en organismos superiores. La levadura Ste2 una "limpia" de pizarra, puesto que una vez expresó con éxito en células animales, se demostró funcional de señalización corriente abajo y agonista inducida por la internalización. Pero, a diferencia de la situación en células de levadura, la internalización Ste2 provocado ni rápida destrucción de este GPCR ni ningún evidente reciclaje de los receptores internalizados volver a la membrana celular para la reutilización. Dado que el Reglamento de GPCR trata de los receptores tirosina quinasas (por ejemplo, el receptor de insulina) puede implicar directa fosforilación de la tirosina los GPCR, así como la fosforilación de GPCR de abajo serina / treonina cinasas de proteína (por ej., La proteína kinasa B / Akt), la comprensión amplia gama de motivos de proteínas, phosphorylations, y abajo las interacciones con adaptador de proteínas (por ejemplo, Grb2) puede ser mejor puesto de manifiesto mediante la introducción de las regiones específicas de GPCRs en Ste2 sondaje y la regulación de la quimera en las células animales. Hemos logrado que confiere counterregulation de insulina a las levaduras Ste2 mediante la creación de una quimera frente al citoplasma de dominios con sustituida por la β 2-adrenérgicos. La proteína cinasas, fosfatasas, y adaptador de moléculas necesarias para resensitization / reciclado de los mamíferos GPCRs pueden ser supervisados por el estudio de este tipo internalizado Ste2 quimera. Ofrecemos la prueba de concepto para esta estrategia y sugieren que Ste2 quimera puede resultar muy valiosa en muchos de esos esfuerzos por la sonda determinantes estructurales que participan en GPCR que afectan a la superficie celular tiempos de retención y el reciclaje GPCR, aspecto esencial de la biología GPCR en organismos superiores.

Métodos
Plásmidos

El STE2 gen fue amplificado por PCR utilizando el plásmido pDB02 [12] como la plantilla y un par de primers diseñados con Nhe I o Bam HI enlaces. El producto de PCR fue digerido con Nhe I y BamH I y clonado en el único Nhe I / Bam HI sitios de peGFP-N1 expresión vector (Clontech). El plásmido codificación de la mayor GFP-etiquetados humanos β 2 AR (en pCDNA3) ha sido totalmente caracterizada por una variedad de líneas de células de mamíferos [13, 14]. Un receptor quimérico (Ste2 / 2 β AR) se generó por la sustitución de los tres bucles citoplasmáticas y el C-terminal de la Ste2 con las correspondientes regiones de la β 2 AR mediante la superposición de extensión PCR y clonado en el Nhe I / Bam HI sitios de la pEGFP-N1. La secuencia de construcción de cada una fue confirmada por secuenciación del ADN.

Cultivo de células y transfections

El riñón de embriones humanos HEK293 células se mantuvieron en Dulbecco's modificó Eagles Medium (DMEM) complementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB, HyClone), penicilina (60 μ g / ml) más estreptomicina (100 μ g / ml), y crecido en un humidificado atmósfera de 5% de CO 2 y el 95% de aire a 37 ° C. Por transfections, las células fueron sembradas a una densidad de 2 × 10 6 cells/100-mm plato, cultivadas durante 24 h, y transfectadas transitoriamente utilizando LipofectAMINE (Invitrogen), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células entonces se cultivaron en el medio de cultivo durante 48 h.

La microscopía confocal

Para los estudios de microscopía confocal, las células que expresan GFP-receptores fueron marcados crecido en Nunc ® coverglasses septadas. Después de un suero de la noche a la mañana el hambre, las células fueron tratadas como se indica y fija con helado de metanol por 2 min a -20 ° C. Las imágenes fueron tomadas con Zeiss invertido 510 microscopio confocal (60 ×, aceite de inmersión). Las imágenes fueron importados como tiff.files, transformados y preparados en Adobe Photoshop © 5,5.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Autores de las contribuciones

DY ingeniería la expresión del receptor de construcciones y redactó el manuscrito original. ES previstas dirección sobre las condiciones para la expresión de receptores y la experiencia en la microscopía confocal. HYW ayudó a concebir el estudio y participó en el diseño de los experimentos. MCP ayudó a concebir el estudio, elaborado y editado el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado del manuscrito final.

Abreviaturas

AR β 2, beta 2-adrenérgicos; las buenas prácticas agrarias, el aumento de proteína verde fluorescente; GPCR, la proteína G-receptores acoplados; HEK, de embriones humanos riñón.

Agradecimientos

Los autores reconocen el apoyo generoso de los Institutos Nacionales de Salud en la realización de estos estudios con las subvenciones a DY (T32 DK007521), HYW (R01 GM69375), y del MCP (R01 DK30111, R01 DK25410). El plásmido codificación de la mayor GFP-etiquetados humanos β 2 AR (en pCDNA3) fue un generoso obsequio del doctor Jeffrey Benovic. (Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University, Filadelfia, PA)