Journal of Molecular Signaling, 2006; 1: 4-4 (más artículos en esta revista)

Tirosina-MAPK fosfatasas específicas y el control de señalización de ERK en células PC12

BioMed Central
Yvet E Noordman (y.noordman @ ncmls.ru.nl) [1], Patrick AM Jansen (p.jansen @ ncmls.ru.nl) [1], Wiljan JAJ Hendriks (w.hendriks @ ncmls.ru.nl) [1]
[1] Departamento de Biología Celular, Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Geert Grooteplein 28, 6525 GA Nijmegen, Países Bajos

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Resumen
Fondo

Espacio-temporales de control de señales extracelulares reguladas quinasa (ERK) actividad, un determinante crítico de la célula de la respuesta a los factores de crecimiento, requiere tiempo dephosphorylation de su reglamentación y la tirosina / treonina o de residuos de MAPK fosfatasas. Se estudió la función fisiológica de la interacción motivo quinasa (KIM) que contienen la proteína tirosina fosfatasas (PTPs) en el control de EGF-y NGF-ERK inducida por la actividad neuroendocrina en células PC12.

Resultados

Hemos encontrado una sola que contenga KIM-Senderos de la Paz a ser endógena se expresa en las células de rata PC12: la isoforma PTPRR transmembrana denominado PCPTP1. Proteína knock-down de PCPTP1, por cuatro o sobreexpresión de su ratón orthologue, PTPBR7, a la izquierda y EGF-NGF inducida por ERK1 / 2, la actividad en las células PC12 inalterada. Ectópico expresión de isoformas citosólicas PTPRR, sin embargo, dio lugar a una reducción inducida por EGF-ERK1 / 2 de actividad, un efecto que depende de la actividad de la fosfatasa y KIM-el dominio de estas PTPs.

Conclusión

El hallazgo robusto que los cambios en tirosina-fosfatasa específica MAPK expresión los niveles de menor a efectos temporales ERK1 / 2 en la actividad de control PC12 sugiere que las células de doble especificidad MAPK fosfatasas pueden actuar como importantes reguladores del factor de crecimiento inducido por ERK1 / 2 señalización en estas células .

Fondo

Una de las mejor estudiadas relés de señalización celular es la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) en cascada de señalización, el mecanismo central de que los factores de crecimiento celular orientar las decisiones fundamentales, como la proliferación y diferenciación [1]. Ha quedado claro que no se trata sólo de la amplitud, sino también el espacio-temporales de distribución de la actividad MAPK en las células que determina el resultado final de esta señalización de relé. Por ejemplo, en la rata PC12 phaeochromocytoma línea de células seminales estudios han demostrado que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) inducida por la proliferación se basa en una transitoria activación de la señal extracelular-quinasas reguladas 1 y 2 (ERK1 / 2) en el citosol, mientras que los nervios factor de crecimiento (NGF) inducida por la diferenciación requiere un compromiso sostenido ERK1 / 2 activación y translocación al núcleo [2, 3]. Por lo tanto, no sólo las moléculas de señalización que activan estos ubicuos MAPKs, sino también los que inactivar y / o localizar ellos son importantes para determinar la especificidad de señalización. Activación de ERK requiere la fosforilación de cerca de dos espaciados de reglamentación de tirosina y treonina residuos de la doble especificidad MAP quinasa quinasas MEK1 / 2 [4]. Al mismo tiempo, ERK implica dephosphorylation inactivación de estos residuos de MAPK fosfatasas. A pesar de que el EGF y NGF específicos vías que conducen a la activación de ERK han sido cartografiados en detalle en las células PC12 [3], la contribución de MAPK fosfatasas en este modelo de sistema ha recibido poca atención.

El dephosphorylation de ERK1 / 2 de reglamentación de tirosina y treonina residuos puede lograrse por tres diferentes tipos fosfatasa: proteína serina / treonina fosfatasas, doble especificidad (serina / treonina y tirosina) fosfatasas (MKPs / DUSPs) y clásicos de la fosfotirosina específicas fosfatasas de proteína tirosina ( PTPs) [5]. Los dos últimos tipos han adquirido un gran interés porque contienen un llamado kinasa interacción motivo (KIM), que también está presente en las aguas arriba MAPK quinasas MEK1 / 2. El KIM-dominio medie la interacción y en parte determina vinculante especificidad hacia las diferentes MAPKs [6 - 8]. Es importante destacar que esta interacción puede ser regulado a través de cAMP porque PKA mediada por fosforilación de un residuo de serina en el KIM-dominio suprime vinculante y dephosphorylation de MAPKs [9, 10].

Mamíferos incluir tres clásicos PTP familias que podrán regular la actividad de ERK KIM-dependiente vinculante y dephosphorylation: HePTP / LC-PTP, STEP y PTPRR (Fig. 1A]. El hematopoyética HePTP / LC-PTP ha sido demostrado, a través de genes destinados a estudios, a ser un regulador fisiológico de ERK en linfocitos [11] y la estriatal enriquecido fosfatasa (STEP), la enzima se encontró la familia para regular la actividad de ERK en la enseñanza primaria neuronal culturas [ 12]. Por PTPRR isoformas los datos actuales reflejan principalmente en estudios de sobreexpresión no células neuronales [6, 9, 13]. Dado que la rata PTPRR receptor de tipo isoforma (PCPTP1) los niveles de mRNA en células PC12 son el aumento de nueve veces dentro de las 8 h siguientes NGF tratamiento [14], un papel en la diferenciación neuronal inducida por la sostenida actividad de ERK, cabe esperar.

En el presente estudio se evaluó la contribución de las KIM-dominio-que contiene clásicos PTPs para la regulación de la actividad de ERK en células de rata PC12. HePTP y STEP mRNAs no detectables en las células PC12. Por el gen PTPRR un solo tipo de transcripción, codificación de la isoforma PCPTP1 transmembrana, se ha tropezado. Estamos explotados transducción retroviral para aumentar o disminuir los niveles de proteína PTPRR y seguimiento del factor de crecimiento inducido por activación de ERK utilizando phosphospecific anticuerpos. Nuestros resultados demuestran que KIM-dominio que contienen tirosina-específica PTPs son indispensables para una correcta ERK-dependiente de señalización en las células PC12 y presentar los productos de doble especificidad MAPK fosfatasas como los reguladores fisiológicos de la actividad ERK en estas células.

Resultados
Un solo clásico KIM-Senderos de la Paz que contienen se expresa en las células PC12

Para determinar cuál de los tres KIM contienen fosfotirosina específicos de PTPs endógena se expresa en las células de rata PC12, una RT-PCR en el análisis de RNA total se realizó. Amplicones esperados para STEP y HePTP se obtuvieron a partir de cerebro de ratón y el ratón de ARN del bazo, respectivamente, pero PASO HePTP mensajeros y se mantuvo indetectable en PC12 material (Fig. 1B], en concordancia con los informes anteriores [15, 16]. Por el gen de rata PTPRR dos diferentes transcripciones, codificación PCPTP1 y PCPTP1-Ce, respectivamente, se han notificado [17, 18]. PCPTP1 mRNA está presente en las células PC12 [14, 17, 19], pero PCPTP1-Ce transcripciones siguen siendo indetectables en ARN PC12, aunque el producto de amplificación es fácilmente obtenidas utilizando ARN cerebelo de rata (fig. 1B]. En el ratón PTPRR-codificación genética genera una tercera isoforma transcripción que codifica la proteína otras dos isoformas (PTPPBS γ-42 y PTPPBS γ-37) mediante el uso de alternativas de traducción sitios empezar [20]. Para poder sonda para detectar la presencia de ratas putativo PTPPBS γ variantes, se realizaron búsquedas en las bases de datos públicas para la rata PTPRR región genómica mostrando muy alta homología con el ratón PTPPBS γ transcripción específicos y secuencias de los primers diseñados para su uso en la RT-PCR ensayos. De hecho, las previsiones PTPPBS γ-tipo fragmento se amplificó a partir de ARN del cerebelo de rata, ratón, mientras que PTPPBS γ cDNA sirvió como control positivo, pero no se obtuvo la señal utilizando material PC12 (Fig. 1B]. Así, en células de rata PC12 sólo la mayor PTPRR transcripción, que codifica el receptor de tipo isoforma PCPTP1, se expresa.

Hemos investigado próximo PTPRR isoforma expresión en las células PC12 en el nivel de proteínas. Ambos Western blot PC12 de lisados celulares y immunoprecipitation experimentos revelaron múltiples bandas inmunorreactivas (por ejemplo, Fig. 2A y datos no presentados) así que comparar a los patrones de expresión obtenidos con construcciones de rata PCPTP1 [17]. Las proteínas de alrededor de 72 y 65 kDa en tamaño que se detecte que representan endógeno PCPTP1 rata y una post-translationally variante modificada, respectivamente, como es el caso del mouse ortholog PTPBR7 [20]. Estos datos están en consonancia con PTPRR isoforma PCPTP1 a ser el único detectable KIM-que contiene la fosfotirosina fosfatasa específica en células PC12.

RNAi mediada por knock-down de PCPTP1

Para evaluar si dephosphorylation de PCPTP1 es de importancia para la regulación de EGF-y NGF-ERK inducida por la señalización en las células PC12, tendiente a silenciar PCPTP1 expresión a través de interferencia por ARN. Diferentes secuencias siRNA fueron probados a través de la transducción viral con pSUPER-Retro [21] y el blanco para los nucleótidos 2380-2398 de PCPTP1 dado lugar a una casi completa PCPTP1 ablación de los niveles de proteína (Figura 2A]. Con el fin de permitir la exclusión de fuera de objetivo efectos en estas células, desmontables fue rescatado también por la introducción de un vector retroviral expresión de codificación PTPBR7, el mouse ortholog de PCPTP1. Efectos sobre la actividad de ERK siguientes FEAG o NGF administración de suero de hambre células PC12 se vigilará en el análisis de inmunoblot de lisados celulares utilizando phosphospecific ERK1 / 2 anticuerpos. Reprobing la misma inmunoblot con antisuero contra ERK1 total permitido para la carga de corregir las diferencias entre las muestras y para expresar ERK1 / 2 relativa como actividad de fosforilación unidades. FEAG administración a simulacros de transduced-PC12 células dio lugar a una muy rápida pero transitoria ERK1 / 2 picos de activación que dentro de los primeros 5 minutos (Fig. 2B, parte superior de los paneles). Tras el tratamiento NGF, ERK1 / 2 biphosphorylation es máxima después de unos 10 minutos y luego disminuye gradualmente, con sostenido ERK1 / 2, la actividad sigue siendo detectable después de 48 h (Fig. 2B, paneles inferiores) [22]. Razonamiento que los posibles efectos sobre la alteración de los niveles PCPTP1 sería más notable en el tiempo máximo de puntos con ERK1 / 2 activación, en comparación relativa fosfato ERK1 / 2 en los niveles de células transduced a 2 y 5 minutos después de FEAG Además (Fig. 2C] o a 10, 20, 30 y 60 min después de NGF administración (datos no presentados). El agotamiento de PCPTP1, sin embargo, no dio lugar a la alteración significativa de la respuesta a FEAG o NGF administración. También el uso de muy bajas concentraciones de EGF, para garantizar que ERK1 / 2 no está al máximo y fosforilados PCPTP1 desmontables puede permitir nuevo aumento de ERK1 / 2 de actividad, no reveló una diferencia significativa en ERK1 / 2 simulacros de activación entre transduced y desmontables células PCPTP1 (Fig. 2D].

Efectos de la sobreexpresión en PTPRR transitoria y sostenida actividad de ERK

Como una forma alternativa de evaluar la pertinencia de PTPRR actividad para la regulación de la señalización de ERK, que genera fuentes de células PC12 estable que expresó PTPRR isoformas del ratón por medio de transducción retroviral. Lisados de las líneas de células resultantes fueron analizadas por Western blots para determinar los niveles de expresión PTPRR (Fig. 3A]. Transducción con el ratón PTPBR7 la codificación de virus resultó en inmunorreactiva bandas que se superponen a las de PCPTP1 endógena, lo que confirma la anterior anotación de estas señales. Expresión ectópica de ratón PTPPBS γ transcripciones dado lugar a otras dos bandas inmunorreactivas que representan PTPPBS γ-42 y PTPPBS γ-37 [20]. Células transduced con una codificación construir PTP-SL, el mouse ortholog de PCPTP1-Ce, no apreciable para mostrar los niveles de expresión (no se muestra) y, por tanto, no se incluyen en este estudio. Cuantificación reveló que PTPBR7 expresión superior a tres veces el nivel endógeno PCPTP1, mientras que PTPPBS γ expresar PTPRR células muestran que los niveles son algunos de diecisiete veces mayor que en los no-transduced controles (Fig. 3B]. Análisis de la distribución subcelular reveló que PCPTP1 endógeno muestra una débil vesículo-tipo en tinción de las células PC12, y sólo limitada membrana celular localización (Fig. 3C, panel izquierdo). De acuerdo con los datos anteriores [20, 23, 24], su mouse ortholog PTPBR7 fue detectado en la membrana celular, en estructuras vesiculares y en el aparato de Golgi (Fig. 3C, panel central). Mouse PTPPBS γ isoformas citosólicas son proteínas que están excluidos del núcleo, mientras endógeno PCPTP1 añade una speckled patrón (Fig. 3C, panel derecho).

Efectos de PTPBR7 y PTPPBS γ expresión en ERK1 / 2 perfiles de actividad en las células transduced se determinará una vez más a través de fosfato ERK1 / 2 immunoblots (Fig. 4A]. Los valores medios durante seis experimentos independientes se trazan (Fig. 4B, C] e idénticos resultados se obtuvieron utilizando independiente derivados PC12 estable transduced celular piscinas. Expresión ectópica de PTPBR7 se encontró que no tienen ningún efecto sobre EGF inducida por NGF y transitoria inducida sostenido ERK1 / 2. A los 5 minutos siguientes FEAG Además, la expresión de células PTPBR7 mostrar una pequeña reducción en ERK1 / 2 actividad, pero esto no alcanzó significación. Del mismo modo, a 2 min tras la administración FEAG y en el 10, 20, 30 o 60 minutos después de NGF el tratamiento fosfato ERK1 / 2 niveles en las diversas piscinas de células que expresan PTPPBS γ son indiferentes de los que están en modelo de transduced células. Por el contrario, PTPPBS γ expresar las células muestran una reducción significativa de ERK1 / 2 niveles de actividad después de 5 min FEAG administración (p <0,008; Fig. 4B]. Un análisis separado de la ERK1 y ERK2 los niveles de actividad siempre y esencialmente los mismos resultados (datos no presentados). De este modo, impulsar la actividad PTPRR en el citosol de 17 veces resulta en una significativa ~ reducción del 25% de ERK1 / 2, actividad durante la fase posterior de la respuesta transitoria a EGF.

PTPRR efectos sobre la actividad de ERK implicar KIM mediada por las interacciones

La unión de KIM-dominio que contienen fosfatasas MAPK a sus objetivos pueden ser derogadas por el AMPc dependiente de la proteína quinasa PKA, a través de la fosforilación de un residuo de serina en el KIM-dominio [9, 10, 12]. Curiosamente, los modelos actuales sobre transitorios versus sostenida activación ERK en células PC12 incorporar un NGF inducida por PKA-vía de señalización mediada [22]. Para investigar si este mecanismo mantenerse PTPRR isoformas de la regulación de los niveles de fosforilación ERK en células PC12, se determinó el estado de fosforilación de la serina KIM dominio de residuos en immunoprecipitated PTPRR proteínas utilizando un anticuerpo dirigido contra los sustratos fosforilados PKA. Administración de la PKA activador forskolin se utilizó para determinar los niveles máximos de KIM-fosforilación de dominio [12]. Fosforilación de los niveles endógenos PCPTP1 en células PC12 fueron, por desgracia, por debajo del nivel de detección (datos no presentados). En PTPPBS γ-PC12 células que expresan alrededor de la mitad de esta fosfatasa fosforilados apareció la noche a la mañana siguiente suero hambre, y FEAG o NGF administración incluso dio lugar a una disminución significativa en la fosforilación de la serina de regulación (Fig. 5A, B]. En PTPBR7 células que expresan, sin embargo, el KIM-PTPBR7 dominio parece fosforilados al máximo en todas las condiciones de ensayo (Fig. 5C, D], lo que puede explicar los resultados negativos con respecto a ERK1 / 2, la actividad de esta modulación del receptor de tipo PTPRR isoforma.

Para determinar si la actividad de la fosfatasa y / o MAPK vinculante potencial de PTPPBS γ se requiere para observar la atenuación de la EGF-estimulado la actividad transitoria ERK (Fig. 4], de células PC12 piscinas que se generaron estable expresar específicas PTPPBS γ mutantes. PTPPBS γ C343S y D309A mutantes representan catalíticamente afectada versiones que todavía podrán quedar vinculadas fosfotirosina que contienen sustratos [25]. En el Δ KIM KIM los mutantes de dominio se ha suprimido, por lo que es incapaz de asociarse con MAPKs [6]. Por otra parte, porque la fosforilación es conocido para regular su asociación con MAPKs [9, 13], que también incluyó la PTPPBS γ S94A/T116A doble mutante en esta serie de experimentos. El PTPPBS γ-mutante de células que expresan piscinas demostrado que los niveles de expresión eran comparables con o incluso superior a la de tipo salvaje-γ PTPPBS expresar las células (Fig. 6A]. Una vez más, en comparación con fosfato ERK1 / 2 se determinaron los niveles de fosfato análisis de inmunoblot. Sólo en células que expresan PC12 tipo salvaje PTPPBS γ o PKA-γ PTPPBS insensible S94A/T116A una disminución significativa de ERK1 / 2, actividad a los 5 min, pero no a 2 min, tras la estimulación FEAG es evidente (Fig. 6B, p <0,05). Los mutantes catalíticamente afectada, así como la versión sin el dominio KIM-han perdido esta capacidad, lo que demuestra la exigencia de una asociación directa y con posteriores dephosphorylation de la MAPK por el PTP.

Discusión

El neuroendocrino de células PC12 línea representa un sistema modelo para estudiar espacial y temporal de los aspectos del factor de crecimiento inducido por la señalización MAPK [2, 26]. En este estudio hemos hecho un inventario de las asocia-MAPK, la fosfotirosina específicos de PTPs endógena que son expresadas en este sistema celular y fisiológico a prueba su importancia para el espacio-temporales de control de EGF-y NGF inducida por ERK1 / 2. El PTPRR isoforma PCPTP1 es el único detectable KIM-dominio que contengan clásico Senderos de la Paz en estas células. PCPTP1 desmontables de los niveles de proteína o expresión adicional de su mouse ortholog PTPBR7, sin embargo, a la izquierda transitoria y sostenido ERK1 / 2 señalización en respuesta a EGF o NGF, respectivamente, sin modificaciones. Nuestra conclusión de que en este sistema de células PTPBR7 es constitutivamente fosforilados en una reglamentación de residuos serina en el KIM-dominio, lo que impide su unión a ERK, ofrece una explicación probable. Expresión ectópica de la citosólica PTPPBS γ isoformas dado lugar a una disminución de EGF inducida, pero no inducida por NGF, ERK1 / 2 activación. Este efecto requiere PTPPBS γ actividad enzimática y una intacta KIM-dominio, lo que indica una asociación directa con dephosphorylation y de las MAPK. En consonancia con esto, sólo unos 30-50% de las moléculas de γ PTPPBS resultó ser fosforilados en sus KIM serina de residuos, dejando a la mayoría disponible para la acción en ERK vinculante y dephosphorylation.

No está claro qué causa el efecto diferencial de las isoformas PTPPBS γ, en comparación con el receptor de tipo PTPBR7 proteína en la amplitud de la actividad de ERK transitorios siguientes FEAG administración. Bien puede ser atribuible a las distintas localizaciones subcelulares de estas isoformas PTPRR o más bien podría ser el reflejo de la expresión mucho más altos niveles de PTPPBS γ-42 / PTPPBS γ-37 en comparación con PTPBR7. ¿Por qué PTPPBS γ ectópico expresión afecta sólo a la transitoria y no sostenida la actividad de ERK perfil, sin embargo, debe tener otros motivos. Modelos actuales incorporar un NGF inducida por PKA-vía de señalización mediada por células PC12 [22] y, razonamiento a lo largo de estas líneas, PTPPBS γ proteínas pueden convertirse en el hyperphosphorylated KIM-NGF dominio a otra parte. Por el contrario, hemos encontrado que el tratamiento con NGF y FEAG resultado en ambos significativamente inferiores PTPPBS γ niveles de fosforilación. Esto puede explicarse por el supuesto de que el primer impulso de ERK1 / 2 siguiente actividad del factor de crecimiento además se traduce en una rápida KIM región mediada por asociación de PTPPBS γ y ERK1 / 2, a fin de proteger la reglamentación serina KIM en la región posterior de fosforilación. Independientemente, la PKA de señalización mediada por que los resultados de NGF tratamiento de las células PC12, y que es necesaria para que el carácter sostenido de la actividad de ERK en comparación con los efectos transitorios FEAG [22], no explica la PTPPBS γ selectiva.

De acuerdo con nuestros hallazgos, ectópico sobreexpresión de una versión citosólica de PTP-SL (por lo tanto, se asemeja PTPPBS isoformas γ) en células PC12 se ha informado previamente a una reducción de fosfato ERK5 y fosfato ERK1 / 2 niveles siguientes FEAG administración [27]. Estos datos, sin embargo, no se cuantificaron ni la prueba de significación estadística. En contraste con nuestros estudios, y compañeros de trabajo Ogata hizo observar un efecto supresor de PTPBR7 sostenido en la actividad ERK en células PC12 [19]. Los experimentos, sin embargo, participan transitoria transfections que probablemente resultaría en PTPBR7 mucho más altos niveles de expresión, y la activación de las células PC12 se hizo a través de co-transfección de MEK1 constitutivamente activa en lugar de NGF administración. Por otra parte, no ERK fosforilación, pero la actividad transcripcional de su sustrato Elk1 abajo se utilizó como lectura, y juntos lo que puede haber causado una exageración de los efectos.

PCPTP1, la rata homólogo de ratón PTPBR7, es abundantemente expresado en varias regiones del cerebro de rata, incluyendo el cerebelo, corteza cerebral y el hipocampo [17]. Curiosamente, los niveles de mRNA PCPTP1 son el aumento de 9 veces durante las primeras 8 h de NGF inducida por la diferenciación de células PC12 [14], en consonancia con un papel en la diferenciación neuronal inducida por la sostenida actividad de ERK. Nuestra proteína desmontables experimento, sin embargo, están en contradicción con un papel crítico para PCPTP1 en ERK1/2-dependent procesos en las células PC12. Otros KIM-dominio que contienen tirosina-específica PTPs no puede camuflar los efectos de señalización PCPTP1 ya que excluye la expresión de otras isoformas PTPRR, STEP y HePTP / LC-Senderos de la Paz en células PC12. Por otro lado, la redundancia con KIM-dominio que contienen doble especificidad fosfatasas (MKP / DUSP) puede muy bien explicar PTPRR del efecto modesto sobre ERK1 / 2 señalización. En Drosophila, por ejemplo, con respecto a la redundancia ERK inactivación se ha tropezado para DMKP3, un homólogo de mamíferos MKP-3/MKP-4, y PTP-ER, el homólogo de Drosophila PTPRR [28]. Los posibles candidatos que podrían asumir el papel de la PTPRR proteínas en las células PC12 son MKP-3, MKP-4, MKP-X Dusp2 y, en vista de su localización en el citoplasma y la elevada especificidad por las ERK1 / 2 [5]. Hemos detectado MKP-3 y MKP-X transcripciones en células PC12 por RT-PCR análisis (datos no presentados), pero no se observan alteraciones en el factor de crecimiento inducido por ERK1 / 2 perfiles de actividad siguientes estrategias de interferencia por ARN hacia el agotamiento de MKP-3 y MKP - X (datos no presentados). Cabe señalar que la verificación de los cambios en los niveles de proteína MKP no se realizó debido a la falta de adecuados anticuerpos.

¿Qué otros objetivos sustrato para PCPTP1 puedan existir en las células PC12 para explicar su presencia endógeno? Además de ERK1 / 2, PTPRR proteínas, se mostró de obligar a los miembros de la familia MAPK p38 α y ERK5 [6, 9, 13, 27, 29], pero estos estudios fueron realizados en su mayoría no las células neuronales, utilizando cualquiera de proteínas recombinantes o ectópica y expresó fosfatasas MAPKs. Nuevos estudios para la identificación de los objetivos fisiológicos de PTPRR isoformas son, por tanto, necesario. Además, los actuales estudios in vitro podría ser obstaculizada por el hecho de que los posibles ligandos para PCPTP1/PTPBR7 la parte extracelular, lo que puede crítica de controlar la actividad de la fosfatasa, no han sido identificados aún. También en vista de la limitada expresión del patrón Ptprr genes [17, 24, 30] y conserva su potencia para generar múltiples isoformas de proteínas mediante el uso de diferentes promotores, splicing alternativo y varios codones de inicio [18, 20, 30] que puede muy bien ser que la tirosina fosfatasa PTPRR miembros de la familia será fisiológicos reguladores de señalización MAPK en otros sistemas celulares y después de diferentes estímulos que las probadas aquí. Dada la falta de expresión endógena PTPRR en muchas líneas de células neuronales, estudios en ratones deficientes PTPRR son esperadas para hacer frente a su significado funcional en la señalización MAPK en vivo.

Conclusión

El PTPRR isoforma PCPTP1 es el único específico de tirosina-PC12 Senderos de la Paz en las células que es capaz de obligar a ERK MAPKs a través de su dominio KIM-y es fácilmente hasta el momento reguladas del factor de crecimiento inducido por la diferenciación de estas células. Sin embargo, la regulación fisiológica de ERK1 / 2 señalización en las células PC12 no podía atribuirse a este PTP. Llegamos a la conclusión de que los demás, de doble especificidad MAPK fosfatasas pueden actuar como importantes reguladores del EGF-y NGF inducida por vías de señalización en estas células.

Métodos
RT-PCR

Total RNA de forma exponencial cada vez más células PC12, rata cerebelo, cerebro del ratón o del bazo fue purificado utilizando RNazol B (Campro Científico, Veenendaal, Holanda). RT-PCR se realizaron análisis como se describe en esencia [31]. En pocas palabras, se sintetizó cDNA de RNA total de azar hexamer cebado usando superíndice ™ II RNasa H - Reverse Transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Breda, Holanda) y utilizados para PCR. Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa. Primers utilizados son: PCPTP1 de avance 5'-CCTCAATGCACACACTATGAGG-3 '; PCPTP1-Ce-forward 5'-CTTCAGCTCGCAGGC TTTC-3'; PTPPBS γ (rata)-forward 5'-GTGCAGGACGTGGAGGAAG-3 '; PTPRR inversa-5'-TCCTTCTTTGCTCCAGAT -3 '; STEP-forward 5'-GAGGACTACCGGCTGCGAC-3'; invertir STEP-5'-GGCTCATGGCGTGGTGCAC-3 '; HePTP adelante-5'-CATCTGCTCAGT GAACACACC-3'; HePTP inversa-5'-GTCTGCTACAGTGTTGGGC-3 '; β - actina-forward 5'-GCTAGAGCTGCCTGACGG-3 'y β-actina-revertir 5'-GAGGCCAGGATGGAGCC-3'.

Plásmidos

Subcloning de un Xho I-No me fragmento de pIRES2-eGFP (Clontech) en Xho I-No he digerido retrovirales plásmido pLXSN (Clontech) generados pLXSN-IRES2-eGFP. El Bam HIsite en pLXSN-IRES2-eGFP se utilizó posteriormente para insertar los BGL II insertar pSG5 de PTPPBS-γ-FL [20], lo que hace pLXSN-PTPPBS γ-IRES2-eGFP. Mediante la inserción de la N-terminal de codificación Eco RI fragmento de PTPBR7-eGFP [23] en Eco RI-digerido pLXSN-PTPPBS γ-IRES2-eGFP generamos pLXSN-PTPBR7-IRES2-eGFP. Mutant pLXSN-γ PTPPBS construcciones se han generado de la siguiente manera. En primer lugar mutante PTP-SL marcos de lectura abierta fueron extirpados de pRK5-PTP-SL vectores de expresión ([6] facilitaron amablemente por el Dr. R. Pulido, Valencia, España), utilizando y no me Xho I, y en ligated entre los correspondientes sitios en pLXSN. La utilización de la BST BI que posteriormente eliminado la mutación que contengan la secuencia de las piezas obtenidas plásmidos y se incluirán en BST BI-digerido pLXSN-PTPPBS γ-IRES2-eGFP. Por siRNA construye, se proceda oligonucleótidos annealed y ligated en la pSUPER-Retro vector PSR [21]. Plásmidos PSR-1211 y PSR-2380 codificar siRNAs que el objetivo de nucleótidos 1211-1229 y 2380-2398 en el ARNm PCPTP1 [GenBank: D38292 ], Respectivamente. Todas las construcciones fueron verificadas por el análisis de secuencias.

Cultivo celular y transducción retroviral

PC12 células (# ATCC CRL-1721) se cultiva en el colágeno recubiertas de platos en DMEM complementado con un 10% de FCS y el 5% suero de caballo (HS) a 37 ° C. Ecotropic Phoenix células embalaje [32] se cultivaron en DMEM, 10% de FCS. Para la producción de retrovirus, Phoenix células fueron transfectadas transitoriamente por calciumphosphate precipitaciones. Veinticuatro horas después de transfección, medio fue reemplazado por DMEM que contenga 10% FCS y el 5% HS. Después de 10 h retrovirus que contienen medio fue recogido, filtrada a través de un 0,45-μ m de tamaño de poro de filtro y se completará con polybrene (Sigma-Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht, Países Bajos) a una concentración final de 5 μ g / ml. PC12 células infectadas mediante la sustitución de un medio de cultivo sin diluir con polybrene y retrovirus que contienen medio de 8-16 h. Después de cuatro rondas posteriores de la infección, transduced células fueron seleccionadas por 2-3 semanas en medio que contiene 500 μ g / ml G418 (Gibco Europa, Breda, Holanda) o 2,5 μ g / ml puromycin (Sigma-Aldrich Chemie BV), respectivamente.

El análisis por inmunotransferencia

Las células fueron sembradas en seis platos así a una densidad de 1 * 10 6 células /. Al día siguiente medio fue reemplazado por DMEM sin suero. Después de o / n privación de suero, las células fueron tratadas con 0.075-100 ng / ml EGF (una especie de regalo del doctor J. van Zoelen, Nijmegen, Holanda) o 50 ng / ml NGF (N6009, Sigma-Aldrich Chemie BV) para los diferentes períodos de tiempo. Las células fueron lavadas dos veces con helado de buffer fosfato salino (PBS) antes de que se raspó con una goma de policía en 75 μ l de buffer de lisis: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% tritón X-100; 100 mM NaF , 2 mM Na 3 VO 4, 20 mM Na 4 P 2 O 7, 1 mM PMSF; cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Lisis se continuó en hielo durante 30 min y componentes insolubles fueron posteriormente pildoradas por centrifugación durante 25 min a 14,000 rpm y 4 ° C. Sobrenadantes se almacenaron a -20 ° C hasta su posterior utilización. Las concentraciones de proteína se determinó por espectrofotometría [33].

Proteína muestras (8 μ g) fueron sometidos a SDS-PAGE en un 10% PA geles y borrado de fluoruro en polivinilideno (PVDF) membranas. Blots fueron bloqueados durante 30 minutos usando el 3% de materia grasa no seca la leche en TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl; 0,05% de Tween-20) y se incubaron durante la noche a 4 ° C con una 1:2000 dilución de un fosfato ERK1 / 2 anticuerpo monoclonal (# 9106, Señalización Celular Tecnología, Beverly, EE.UU.). Después de tres lavados con TBS-T, blots fueron incubadas por 1 h con una dilución de 1:10000 y conjugado con peroxidasa de cabra anti-ratón IgG (Biotecnología Inc Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) en 3% sin grasa en la leche seca TBS-T. Inmunorreactivas se detectaron bandas con Lumi-LightPLUS el Western Blot Substrato (Roche Diagnostics GmbH) BioChemi utilizando un sistema de procesamiento de imágenes y señales obtenidos fueron cuantificados con el programa Labworks 4,0 (UVP Bioimaging Systems, Cambridge, UK). Blots fueron despojados de 40 min a 60 ° C (en 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,6, 100 mM β-mercapto-etanol, 2% SDS), lavado con TBS-T y reprobed por 1 h con conejo policlonal ERK1 ( C-16) de anticuerpos (sc-93, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, EE.UU.) a una dilución de 1:8000 en TBS-T que contiene el 3% seco lácteo no graso. Y conjugado con peroxidasa de cabra anti-conejo IgG (Pierce Inc Biotecnología) se utiliza para la detección y cuantificación, tal como se describe más arriba. Ratios de las señales phospho-ERK1/2/total ERK1 se determinó para cada muestra y, para poder comparar los ratios señal procedente de diferentes Blots, una referencia normal de la muestra (correspondiente a un lisado de células PC12 siguientes 5 minutos el tratamiento con EGF) incluidos en cada mancha.

PTPRR expresión se determinaron los niveles de someter a 50 μ g de proteína total para SDS-PAGE e inmunoblot análisis como se describe más arriba, utilizando anticuerpos monoclonales 6A6 [20]. PTPPBS fosfato γ y fosfato PTPBR7 niveles se determinaron por Western Blot de 6A6 immunoprecipitates, realizado tal como se describe anteriormente [20], de PTPPBS γ o PTPBR7 expresar las células que han sido incubadas con 10 ng / ml EGF, 50 ng / ml NGF o 10 μ M forskolin suero de la noche a la mañana después de la muerte por inanición. Blots fueron incubadas simultáneamente con un conejo monoclonal fosfato PKA sustrato (RRXS * / T *) (100G7) anticuerpo (# 9624, Señalización Celular Tecnología) y con 6A6, tanto en una dilución 1:1000. Cabra anti-ratón y de cabra anti-conejo secundario conjugado con anticuerpos Alexa Fluor 680 (Molecular Probes) o IRDye800 (Rockland Immunochemicals) tintes fluorescentes se utilizan para la detección y cuantificación en una odisea sistema de formación de imágenes por infrarrojos (LI-COR).

Microscopía de inmunofluorescencia

Las células, cultivadas en colágeno recubiertas de cubreobjetos, se fijaron a temperatura ambiente durante 30 minutos en PHEM buffer (60 mM PIPA, 25 mM HEPES, pH 6,9, 10 mM EGTA, 2 mM de MgCl 2) que contienen 4% de paraformaldehído, y posteriormente lavadas con PBS y permeabilized durante 5 min usando un 0,2% Tritón X-100 en PBS. Aspecific sitios fueron bloqueados por incubación durante 30 minutos con el 4% de BSA en PBS antes de que las células fueron incubadas por 1 h con una dilución 1:500 de conejo policlonal α-SL antisuero [24] en PBS que contenía 0,4% BSA. Después de tres lavados con PBS, las células fueron incubadas durante 1 h en una dilución 1:300 de Alexa568-conjugado de cabra anti-conejo IgG (Molecular Probes) en PBS, 0,4% BSA. A raíz de PBS se lava la deshidratación y el metanol, cubreobjetos fueron montados en portaobjetos de cristal utilizando Mowiol (Sigma-Aldrich), y las imágenes fueron obtenidos mediante láser confocal de microscopía de barrido (MRC1024, Bio-Rad).

Lista de abreviaturas

DUSP: doble especificidad de la fosfatasa; EGF: factor de crecimiento epidérmico; ERK: señal extracelular-quinasa regulada; KIM: quinasa interacción motivo; MAPK: mitogen-activated proteína quinasa; MKP: MAP quinasa fosfatasa; NGF: factor de crecimiento nervioso; Senderos de la Paz: la proteína tirosina fosfatasa; PASO; estriatal enriquecido fosfatasa

Declaración de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

YN llevaron a cabo los experimentos y ayudó a redactar el manuscrito. PJ asistida en RNAi experimentos. WH concebido y coordinado el estudio y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Aswin Menke de la prestación de los ecotropic Phoenix células, Joop van Zoelen para la donación de la EGF, Rafael Pulido de la prestación de los pRK5 basada mutante PTP-SL construye expresión y derick Wansink para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por una subvención (III.120201) de la Radboud University Nijmegen Medical Centre.