BMC Structural Biology, 2006; 6: 26-26 (más artículos en esta revista)

Estructura de la levadura histonas H3-ASF1 interacción: implicaciones para chaperón mecanismo, las especies específicas de las interacciones, y epigenética

BioMed Central
Andrew J Antczak (antczaka@berkeley.edu) [1], Toshiaki Tsubota (Toshiaki.Tsubota @ umassmed.edu) [2], Paul D Kaufman (paul.kaufman1 @ umassmed.edu) [2], James M Berger (jmberger @ berkeley.edu) [1]
[1] Departamento de biología molecular y celular, Universidad de California, Berkeley, California 94720, EE.UU.
[2] Programa en función de genes y de Expresión, Universidad de Massachusetts Medical School, Worcester, Massachusetts 01605, EE.UU.

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Resumen
Fondo

La histona H3/H4 chaperón Asf1 (anti-silenciar función 1) es necesario para el establecimiento y mantenimiento de una adecuada estructura de la cromatina, así como para la estabilidad del genoma en eucariotas. Asf1 participa en la replicación del ADN acoplado (RC) y la replicación independiente (RI) histonas deposición reacciones in vitro e interactúa con los complejos responsables de ambas vías en vivo. Asf1 se conoce directamente a obligar histona H3, sin embargo, de alta resolución información estructural sobre la geometría de esta interacción era desconocido previamente.

Resultados

En este sentido, el informe de una estructura de las histonas o histonas chaperón interacción. Hemos resuelto el 2,2 Å estructura cristalina de la conservadas N-terminal de inmunoglobulina veces dominio de la levadura Asf1 (residuos 2-155), vinculado a la C-terminal de hélice de la levadura histonas H3 (residuos 121-134). La estructura define un histonas vinculante parche en Asf1 que consta de dos conservadas y levaduras específicas de los residuos; mutación de estos residuos abroga H3/H4 afinidad. La geometría de la interacción indica que Asf1 se une a las histonas H3/H4 de una manera que probablemente bloques sterically la H3/H3 interfaz nucleosomal de la hélice de cuatro paquetes.

Conclusión

Estos datos aclarar cómo Asf1 regula las histonas estequiometría de modular la herencia epigenética. La estructura sugiere, además, un modelo físico en el que Asf1 contribuye a la interpretación de un "código de barras de las histonas H3" para clasificar H3 isoformas en diferentes vías de deposición.

Fondo

Estructura de la cromatina desempeña un papel fundamental en todos los procesos relativos al genoma de organismos eucariotas. El primer paso en la cromatina establecimiento de novo es la deposición de un (H3/H4) 2 heterotetramer en el ADN de uno o más de varios histonas chaperones incluidos Asf1, CAF-1, y el Complejo Hir. El pre-nucleosomal (H3/H4) 2 intermedio luego se une a dos histonas H2A/H2B heterodimers, que completan el núcleo de histonas octamer y adecuada para permitir el embalaje de nucleosomal DNA (revisado en [1]].

Histonas H3/H4 chaperones participar en dos similares, pero funcionalmente distintas vías. El primero consiste en la repetición de acoplamiento (RC) durante la deposición de las histonas S-fase en la que CAF-1-histonas complejos son reclutados a los lugares de la replicación del ADN a través de una interacción con el ADN polimerasa processivity factor PCNA [2]. La segunda vía es una replicación independiente (RI) histonas proceso de deposición que ocurre durante todas las etapas en el ciclo celular e implica la Hir Complejo [3 - 5]. RI histonas deposición se ha relacionado con la cromatina reorginization durante tanto transcripción [6] y la embriogénesis [7, 8].

La mayoría multicelulares eucariotas, a diferencia de la fisión y levaduras en ciernes, contienen dos tipos principales de la histona H3 isoformas: la muy estrechamente relacionados H3.1/H3.2 proteínas, y las más distintas variantes H3.3 [9]. A pesar de que estas histonas se diferencian sólo por unos pocos aminoácidos, de expresión y la deposición de H3.1/H3.2 se limita a la fase S, si bien se expresa H3.3 y depositó en todo momento durante el ciclo celular [10]. De acuerdo con la CAF-1 el papel de la RC en la deposición, la CAF-1 ha sido purificado de células humanas en el complejo de extractos con las histonas H3.1, pero no H3.3 [11]. Por el contrario, Hira, el homólogo humano de la levadura Hir1 y Hir2, se pueden encontrar complejos con H3.3, pero no H3.1 [11].

Asf1 es la entidad común compartida por la RC y RI vías, ya que se une a las histonas y estimula la deposición por el CAF-1 y Hir complejos [4, 11 - 14]. Asf1 proteínas de todos los eucariotas comparten una muy conservado 155 residuo N-terminal-como la inmunoglobulina veces de dominio [15]. En contraste, la C-termini de Asf1 proteínas de diferentes organismos son muy divergentes. Curiosamente, Dm Asf1, Asf1a Hs, y Hs Asf1b cuota casi el 60% de identidad de secuencia conservados en el N-terminal de dominio, sin embargo, no todos para restablecer plenamente daño en el DNA o la cromatina resistencia mediada por silenciamiento de los genes de levadura en el momento de su puesta bajo el control de la endógena promotor [16]. Estos datos sugieren que las especies específicas de las interacciones dentro de este dominio son funcionalmente crucial. En particular, la levadura Asf1 N-terminal de dominio es completamente funcional como un truncamiento tanto in vitro [15, 17] e in vivo [15, 18, 19].

Hasta la fecha, información estructural sobre la forma de histonas chaperones asociado con histonas y / o sí ha sido escasa. Para obtener información sobre la deposición de las histonas, que hemos empleado estructural, bioquímica, genética y técnicas para estudiar la interacción entre Asf1 y histonas H3/H4. Se determinó la estructura de la conservadas N-terminal de levadura en ciernes Asf1 vinculado a la C-terminal α3 hélice de la levadura histonas H3 a 2,2 Å de resolución. Este péptido fue elegida porque se demostró interactuar con Asf1 a través de experimentos de RMN [20], así como de dos híbridos análisis [21]. Además, esta espiral es el conocido sitio de H3-H3 interacciones en el núcleo tetramer de la nucleosomal octamer, y lo más probable es que participan en la regulación de las histonas estequiometría. La estructura identifica varios residuos que son críticos para la interacción, y nos demuestran que la mutación de estos residuos afecta a las histonas H3/H4 vinculante in vitro y las causas característica silenciar fenotipos in vivo. Sorprendentemente, el modelado de esta estructura en el núcleo de histonas octamer del nucleosoma indica que la unión de la N-conservadas término de Asf1 a H3 directamente occludes H3/H3 homodimer interacciones. Este trabajo, por lo tanto, proporciona información detallada sobre la interacción entre un chaperón proteínas histonas e histonas cliente objetivo. Estos datos también proporcionan ideas sobre la manera en Asf1 afecta tanto a la herencia de estructuras de la cromatina y el depósito de las histonas H3 diferentes isoformas.

Resultados
Estructura de Asf1N obligado a H3 α3

El conservadas N-terminal de levadura Asf1 (residuos 2-155, en lo sucesivo denominadas Asf1N) es suficiente para el tipo salvaje función en vivo, y se une histonas H3/H4, RFC, y Rad53 in vitro [15, 17, 18]. Debido a que la interacción entre el C-terminal de la histona H3 α3 hélice (H3 α3) y Asf1 es modesta de afinidad (K micromolar d) [20], estabilizado por la asociación de fusión Asf1N a H3 α3 flexible con un enlazador péptido. La proteína de fusión fue overexpressed en E. coli, purificado a homogeneidad, y se utiliza para estudios de cristalización (ver Métodos).

Se determinó la estructura de Asf1N obligado a H3 α3 a 2,2 Å de resolución, utilizando una estructura resuelto previamente la levadura de Asf1N de reemplazo molecular [15]. Después de varias rondas de perfeccionamiento mediante un histona-modelo de libre Asf1, la densidad correspondiente a la histona hélice se convirtió en referencia clara y visible, lo que permite la construcción manual de la hélice H3. Recocido simulado omitir mapas [22] confirmó además la densidad de electrones y el modelo construido para esta región (Figura 1A]. Como se ha visto anteriormente, Asf1 solo adopta una conmutación de tipo inmunoglobulina-al igual que (Ig-like) que contiene dos veces más, a corto β-capítulos (denominado h y h ', Figura 1A].

El mundial de Asf1N veces en la estructura actual es casi idéntico al que previamente sin resolverse la histona hélice (Figura 1B]. Los únicos cambios significativos en la estructura son una rotación hacia adelante del bucle de conexión β-c capítulos y c ', así como una pequeña rotación del bucle y α-hélice β-la conexión de líneas e y f. Curiosamente, las posiciones de ambas regiones se asemejan a las que se encuentran en la RMN de la estructura humana homólogo Hs Asf1aN (Figura 1B] [20]. Estas observaciones sugieren que determinadas regiones del Asf1N puede adoptar múltiples conformaciones locales, dependiendo de su socio vinculante.

La histona vinculante de bolsillo en Asf1

RMN experimentos han demostrado que un corto C-terminal del péptido H3 (residuos 122-137) adopta su correcta estructura helicoidal en la presencia, pero no falta de Hs Asf1aN [20]. El mismo estudio identificó una mayor probabilidad de histonas vinculante parche en la parte frontal β-hoja de Asf1N utilizando genéticos y bioquímicos de análisis de proteínas mutantes. Estos estudios no identificó, sin embargo, la geometría de la interacción ni la completa séquito específicas de las histonas-Asf1 interacciones.

La estructura resolverse aquí demuestra que la histona hélice se une a Asf1 previsto en esta región, pero en una orientación imprevistos. Análisis mutacional de esta región [20] ha dado lugar a la predicción de que la hélice eje que ser perpendicular a la línea β-dirección de Asf1, en contraposición a la configuración paralela que ahora confirmar en nuestra estructura. El H3 α-hélice se encuentra en un bolsillo hidrofóbico definida por los residuos en una cara y una intrincada unión de hidrógeno-red en el otro (Figura 2]. En particular, a la forma adecuada de bolsillo, la β-c / β-c 'bucle de conexión descendente de pliegues (en comparación con la estructura de levadura Asf1N no encuadernado), con lo que los residuos Ser48 y Ser50 en la proximidad de contribuir a la unión de hidrógeno-red ( " ; bucle 1 "en la Figura 1B].

Los residuos que comprende la porción hidrofóbica de la interfaz entre ambos Asf1 y H3 son esencialmente idénticos en todas las especies eucariotas secuenciados hasta la fecha [9, 15]. La única excepción a esta regla es Leu130 de H3 en S. cerevisiae, que se cambia a la similar de aminoácidos isoleucina en todos los demás eucariotas. Leu130 hace van der Waals contactos para Asf1 aminoácidos Val94, Tyr112, Arg145, y Leu96 (Figura 3A]. Leu126 de las histonas H3 también hace que las interacciones hidrofóbicas con Val92 y Val94, que están bien conservados en Asf1 residuos.

Un solitario puente de la sal se forma entre la invariante residuos Asp54 en Asf1 y Arg129 en H3. El guanidinium carboxilato y grupos en estas cadenas laterales se sientan alrededor de 3Å aparte y seguir coordinando un par de moléculas de agua (Figura 2]. Curiosamente, estas aguas participar en un amplio lazo de hidrógeno-red (Figura 3A] que incluye un polar interacción entre la invariante Lys122 en H3 y la levadura específicos Asf1 de residuos Ser91, así como la principal cadena de carbonilo de sus vecinos de aminoácidos, Val92 . Las dos redes de abastecimiento de agua que coordinar las interacciones descritas anteriormente son un puente de una segunda levadura de residuos específicos, Ser48, que el hidrógeno bonos a las aguas en ambas redes. La levadura de residuos específicos a la central de hidrógeno-la servidumbre red sugieren que esta interacción puede comprender una especie de especificidad determinante (Figura 3B, véase la discusión). Por último, Asf1 de residuos Thr147 y la principal cadena de carbonilo H3-L130 interactuar indirectamente por el hidrógeno a una unión transitoria molécula de agua. Es importante destacar que la densidad no fue visto por los ocho aminoácidos enlazador péptido pasado los dos primeros residuos de alanina, lo que indica que la fusión no ha limitado la orientación de la H3/Asf1N interacción en un modo artificial.

El análisis genético de las histonas vinculante mutantes

Para evaluar in vivo la pertinencia de los identificados en contacto con los residuos de nuestra estructura, hemos examinado heterochromatic silenciamiento de los genes en las células mutantes Asf1, porque Asf1 es crucial para silenciar en células de levadura que carecen de genes que codifican CAC CAF-1 subunidades [12, 13]. Por lo tanto, expresó de tipo salvaje y ASF1 genes mutantes en un cac1 Δ Δ asf1 cepa y medido silenciamiento de un gen URA3 reportero a la izquierda telómero del cromosoma VII.

De acuerdo con informes anteriores [13], cac1 asf1 células transformadas con un peso Asf1-expresando plásmido fueron capaces de crecer en placas que contienen 5-FOA (un sustrato letal para las células que expresan la enzima Ura3, Figura 4], lo que indica que es silenciar telomérica estimulado por la proteína funcional Asf1. Como control negativo, las células que lleva el vector vacío no puede crecer a 5-FOA placas, con indicación de silenciar defectuoso. En otro control, las mutaciones H36A/D37A, residuos Asf1 importante para la interacción con Hira y Cac2 [15, 23], así como las mutaciones H39A/K41A proximal, causó la espera defectuoso silenciar fenotipos. En contraste, las células transformadas con plásmidos que contienen mutaciones en los residuos a proximal, pero fuera de la histona vinculante parche, como N114A/E116A y E142A/K143A doble mutantes, muestra un sólido crecimiento en 5-FOA placas que contienen. Por lo tanto, nuestro ensayo puede distinguir mutaciones puntuales que afectan específicamente a la función de silenciamiento Asf1.

En particular, las células transformadas con plásmidos portadores de mutaciones en los residuos que participan en el Asf1-H3 interacción identificadas por nuestra estructura no están en condiciones de crecer a 5-FOA que contienen los medios de comunicación. En concreto, V94D/L96D doble mutantes muestran silenciar pobres, al igual que R145A/T147A y H53A/D54A doble mutantes. Tyr112 mutaciones causadas similares defectuoso silenciar fenotipos. Otro residuo que es proximal a la interfaz es Val45; V45D mutantes también muestra defectuosa silenciar, lo que sugiere que la conserva hidrofóbicas parche que medie la Asf1/H3 interacción es intolerante para las cadenas de ácidos lado. Por lo tanto, concluir que los defectos en heterochromatic silenciamiento génico pueden surgir de la perturbación de la H3-Asf1 interfaz de contactos identificados por nuestra estructura.

Bioquímica de la caracterización de Asf1N-H3 interacciones

A fin de validar nuestra estructura, hemos probado mutantes Asf1 proteínas histonas vinculante para H3/H4 mediante un co-precipitación de las proteínas de ensayo co-expresada en bacterias. Como era de esperar, en peso Asf1 fue capaz de co-precipitado H3, mientras que tire de reducción de los extractos que contengan no Asf1 dado no H3 (Figura 5]. Asimismo, observó que Asf1 mutantes único punto que contiene los cambios implicados en los residuos de nuestra estructura (D54A, V94A, y Y112E), así como el doble mutantes R145A/T147A y V94D/L96D, no co-precipitado H3 (Figura 5A]. Es importante destacar que, Asf1 proteínas mutantes con alteraciones en los residuos que no participan en la interacción Asf1/H3, incluida la N114A/E116A, E39/K41A, y H36A/D37A doble mutantes, aún en condiciones de co-precipitado H3 (Figura 5B].

Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de que tanto el van der Waals y las interacciones iónicas en que aquí estructuralmente a afinidad y Asf1 función. Es importante destacar que la L96A y H53A mutaciones en Asf1, que sólo débilmente perturbar las histonas asociación (Figura 5A], se consideran sólo periféricamente H3 que participan en los contactos. En conjunto, estos datos indican que la Asf1-histonas interfaz puesto de manifiesto por los datos estructurales es fisiológicamente relevantes, aunque tomamos nota de que nuestro modelo no excluye la posibilidad de nuevos contactos más allá de los observados aquí que surjan entre Asf1 y otras regiones de las histonas H3 y / o H4.

Asf1 está lista para sterically bloque H3/H4 heterotetramerization

Varias líneas de evidencia sugieren que las histonas H3/H4 chaperones, incluidos Asf1, interactuar con dimeric y no tetrameric H3/H4 especies [11, 24, 25]. Sin embargo, las histonas H3/H4 forma tetramers espontáneamente en condiciones fisiológicas [26, 27]. Estos datos indican que las histonas chaperones pueda de alguna manera regular la propensión de los H3/H4 heterodimer a tetramerize. Para entender mejor este proceso, superpuestos los Asf1-H3 α3 interacción en el conocido (H3/H4) 2 estructura de la levadura nucleosoma (AP 1ID3 ID) [28] utilizando H3 α3 α-carbones de nuestra estructura como una guía. Curiosamente, la inspección de las dos estructuras revela que Asf1 se une a las histonas H3 en una orientación que, de forma directa occludes formación de la hélice de cuatro paquete formado en la interfaz H3/H3 dímero (Figura 6]. Se discuten las implicaciones de este modelo a continuación.

Discusión
Cada especie, las diferencias en la Asf1-H3 interacción

Aunque Asf1 histonas H3 y son todos muy altamente conservadas a través de Eukaryota, nos encontramos con que hay varias especies específicas de los residuos que participan en su interacción. Esta observación sugiere que S. cerevisiae Asf1 podrá coordinar sus histonas algo diferente a metazoan orthologs de Asf1. Dicho comportamiento podría ayudar a explicar por qué Dm Asf1, Asf1a Hs, y todos Hs Asf1b dejar de restablecer plenamente heterochromatic silenciamiento génico y la estabilidad del genoma de levadura que carecen de Asf1 [16].

La más obvia diferencia entre la levadura y metazoan Asf1 dentro de la histona vinculante-parche es la S. cerevisiae específicos de residuos, Ser91. Este aminoácido se define un extremo de una gran unión de hidrógeno y la red que corre a lo largo del borde exterior de la hidrofóbicas H3 vinculante de bolsillo hasta el puente de sal formada por Asf1-Asp54 y H3-Arg129. La pieza central de esta red es un segundo S. cerevisiae específicos de residuos, Ser48. Curiosamente, la comparación de secuencias sugieren que este vínculo de hidrógeno-red puede ser menos amplia en la mayoría de eucariotas: Ser48 es o glicina o alanina, mientras que Ser91 es siempre una glicina, la levadura de fisión para el hombre (Figura 3B].

Como queda de manifiesto por la falta de densidad de electrones observables para el lado de la cadena de átomos de Lys125 de H3 y Asf1-Arg49, nuestra estructura sugiere que estos S. cerevisiae específicos de residuos no participar en las histonas / chaperón complejo (Figura 1A]. Lys125 de H3 es un invariante de la glutamina en todas las demás especies secuenciado hasta la fecha, mientras que Arg49 de Asf1 se conserva, ya sea como treonina o ácido glutámico. Curiosamente, los estudios de RMN han identificado tanto Ala48 y Glu49 de Hs Asf1a como dos de los mayores variaciones químicas a cambio vinculante para el C-terminal de hélice H3 [20], estos residuos están implicados en la interacción humana. Es posible que la conformación de esta región puede ser sutilmente diferentes a los sujetos formas de metazoan Asf1, con los correspondientes aminoácidos de toma diferentes interacciones H3 a como se ha visto para serines 48 y 91. Además, Gly91 de Asf1 humanos también fue implicado en H3 vinculante, lo que sugiere que el metazoan Asf1/H3 interacción puede tener un carácter hidrofóbico más que visto para levaduras.

En conjunto, estos datos sugieren que tanto la levadura y las proteínas metazoan Asf1 utilizar un elemento de cada especie, para coordinar las interacciones histona H3, aunque la conservación de la interfaz indica firmemente que la posición global y la orientación de la hélice H3 α3 es probable que sean muy similares. Este hallazgo plantea una nota de advertencia sobre el uso de proteínas heterólogas de especies en los ensayos bioquímicos, debido a pequeñas diferencias en sus interacciones pueden causar misregulation de Asf1 mediada por la deposición de las histonas durante procesos como la replicación del ADN y la transcripción.

Implicaciones estructurales para la herencia epigenética

Una cuestión importante en la biología de las células es cómo transmitir la información epigenética en forma de modificaciones de las histonas durante el paso de la replicación del ADN tenedor. Los datos recientes han sugerido que las histonas chaperones, incluidos Asf1, se unen a H3/H4 dímeros y no tetramers. La existencia de dímeros H3/H4 intermedios como el montaje plantea la posibilidad de que los padres dímeros puede mezclarse con los nacientes durante su replicación, formando nucleosomas mixtos que contienen tetramers. Esto añadiría una capa adicional de complejidad para los patrones de herencia de las marcas epigenéticas en las histonas durante la duplicación del genoma [11, 24, 25].

Nuestra estructura sugiere un modelo físico para el control de la estequiometría de las histonas Asf1. Por vinculante y oclusión correcta formación de la hélice de cuatro bundle, Asf1 se coloca directamente a perturbar las histonas tetramerization (Figura 6]. De esta manera, Asf1 pueden ser capaces de modular la información epigenética de que participen en las histonas desalojo por delante de la horquilla de replicación, como se observa en la transcripción [29], promoviendo así la mezcla de los actuales y recién sintetizados H3/H4 dímeros. La deposición de tetramers mixto se asegurará de que algunos hija nucleosomas contener tanto los padres y de la naciente histonas modificaciones.

Se trata de un proceso potencialmente ventajosa, porque recién sintetizadas moléculas de histona H3 son acetilado en lisina 56, una modificación del genoma asociadas con la estabilidad y la resistencia a los agentes nocivos de ADN [18, 30, 31], mientras que los padres epigenéticos histonas contienen información crítica para el mantenimiento de un buen perfil transcripcional. Un reto en el futuro para el campo será definir los mecanismos que forman e interpretan las combinaciones de modificaciones en nucleosomas único resultante de la mezcla H3/H4 dímero.

Asf1 se une a las histonas H3/H4 con el fin de presentarlos a diversos complejos

Es cada vez más evidente que una de las principales facetas de la actividad de Asf1 es presentar las histonas a otras proteínas de forma específica. Por ejemplo, Asf1 es necesaria para acetilación de recién sintetizados H3 en K56 antes de la deposición de una enzima no identificados [18, 30]. En consonancia con este hallazgo, nuestro modelo predice que el H3-K56 es solvente cuando expuestos obligado a Asf1 (con la etiqueta K56 en la Figura 6B].

Por otra parte, la merluza y Allis han propuesto un "código de barras H3 hipótesis" [9], en el que distintas isoformas histonas son diferencialmente depositado en la cromatina de la interpretación de su "código de barras" a través de chaperones, como CAF-1 y Hir proteínas. Nuestro modelo estructural sugiere que Asf1 presenta H3/H4 dímeros a isoforma-específicos chaperones en una orientación que podría facilitar la descodificación, lo que permite la cooperación con chaperón Asf1 de aceptar o rechazar una determinada variante de la histona H3. En consonancia con esta idea, los residuos 87-90 de la histona H3, que confieren especificidad isoforma [6], siguen expuestos siguientes Asf1 vinculante (con la etiqueta "ID" en la Figura 6B]. Además, nuestro modelo indica que la Hira sitio de unión a Asf1 [23] sigue siendo expuestos a las histonas vinculante. Proponemos que Asf1 presenta H3 isoformas a otras proteínas incluyendo CAF-1 y Hira de la formación de una estructura ternaria en Asf1 que actúa como un puente para estabilizar los contactos entre la H3 y ayudar a chaperón. Además, nuestro modelo predice que Asf1 contribuiría a la histona de código de barras mediante la generación de la geometría adecuada entre las histonas H3/H4 y la asistencia a chaperón en el complejo ternario.

Conclusión

En resumen, hemos determinado la estructura cristalina de la histona chaperón Asf1 vinculado a la C-terminal de hélice H3. Apoyo a la validez fisiológicos de esta estructura es proporcionada por genéticos, así como análisis mutacional bioquímicos. Significativamente, el modelado de nuestra estructura en el nucleosoma levadura explica por qué Asf1 disocia histonas H3/H4 tetramers en dímeros y sugiere que la herencia epigenética puede ser modulada directamente por Asf1. Futuros estudios serán necesarios para comprender los detalles moleculares de la deposición de las histonas, las sinergias funcionales entre los diferentes histonas chaperones, y para determinar las histonas vinculantes de otros modos de chaperones.

Métodos
Construir el diseño y la depuración

Hemos diseñado un concepto que fusionados residuos 2-155 de Asf1 a la C-terminal de hélice alfa de la histona H3 (aminoácidos 121-134) utilizando ocho aminoácidos enlazador secuencia (AAGAATAA). Esta construcción fue clonado en un pET28b derivados que contengan la secuencia de un N-terminal, VET-cleavable Su 6-MBP etiqueta. El plásmido se han derivatizado de facilitar aún más la ligadura de clonación de seres independientes [32]. La proteína de fusión fue purificado a través de Ni-cromatografía (Poros-MC, Applied Biosystems), seguido por Su 6-VET división de la etiqueta y la recogida de la corriente-a través de un segundo Ni-cromatografía. La proteína fue nuevamente purificada por cromatografía de filtración en gel en un Sepharose S-200 la columna (Amersham Biosciences) y concentrados (Amicon Ultra15, 10 kDa MWCO, Millipore) con anterioridad a la fijación de las pantallas de cristalización.

Cristalización, la recogida de datos, y el perfeccionamiento

Concentración de proteína (10 mg / ml) fue dializados contra 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 1 mM y DTT. Los cristales se cultivaron en la horca soltar vapor de difusión mediante la mezcla de la proteína así 1:1 con solución (85 mM Tris-HCl (pH 8,5), 120 mM Li 2 SO 4, 25% PEG 4000, y el 15% de glicerol) a 18 ° C; embalse soluciones diluidas de dos veces con tampón de diálisis antes de sellar las cámaras de cristalización. Los cristales han sido recolectados y flash congelado en nitrógeno líquido directamente de la caída.

Los datos fueron recolectados a través de la avanzada fuente de luz en la Línea 8.3.1 Lawrence Berkeley National Laboratory [33]. Difracción datos fueron procesados mediante un sistema automatizado MOSFLM [34] procedimiento aplicado en Elfos [35]. Las fases se resolvieron mediante la sustitución molecular utilizando Phaser [36] y libre de histonas levadura Asf1 N-terminal de dominio como un modelo de búsqueda (AP 1ROC ID) [15]. Modelo de construcción se llevó a cabo utilizando O [37], y el refinamiento con REFMAC, ARP [38] y CNS [22]. El modelo final, que contiene aminoácidos 2-155 de Sc Asf1 y 121-131 de la histona H3 Sc, R tiene un trabajo de 19,6% y un R libre de 23,9%. No se observó la densidad de la fusión enlazador pasado los dos primeros residuos de alanina y el enlazador no se incluyó en el modelo final. No se encuentran los residuos rechazados en las regiones del espacio Ramachandran. Las coordenadas y la estructura, factores que se han depositado en el Banco de Datos de Proteínas (AP 2IDC ID).

E. coli extracto de las histonas vinculante ensayos

BL21 (DE3)-Rosetta células de E.coli fueron transformadas con dos vectores de expresión. La primera fue una expresión polycistronic vector [39] que alberga secuencias de larga duración, untagged levadura histonas H3 y H4. La segunda fue pET28 (Novagen) expresando su 6-etiquetas de tipo salvaje o mutante Asf1 [13, 18], o un vector vacío. Expresión de proteínas fue inducido a un 600 = 0.5-0.6 a 30 ° C durante 5 horas con 1 mM IPTG. Cell extractos fueron hechas por sonicación en un tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0,01% NP40, 10 mM imidazol y un cóctel de inhibidores de la proteasa. 4 mg de proteína soluble extracto se incubaron a 4 ° C durante 2 horas con ~ 20 μ l de Talon metal resina de afinidad (Clonetech). Las bolas fueron recuperadas por centrifugación y se lavan tres veces con 1 ml de amortiguador de lisis durante 10 minutos. Las proteínas se precipitaron eluye con SDS-PAGE muestra de amortiguación y visualizar de Coomassie G mancha de un 17% SDS-PAGE gel. Histona H3 se detectó por Western blot utilizando un α-H3 anticuerpo policlonal (AbCam).

Telomérica silenciamiento de ensayo

El silenciamiento de ensayo y la cepa que contiene asf1 Δ, cac1 Δ, y URA3-VIIL alelos se ha descrito anteriormente [13].

Autores de las contribuciones

AJA preparado Asf1/H3 la proteína de fusión, genera cristales, y la recogida de datos de difracción. AJA resuelto la estructura, y junto con JMB inspeccionó el modelo final y los parámetros para comprobar su exactitud. TT realizado el Asf1 mutagénesis, histonas vinculante y silenciar a los experimentos. AJA, PDK y JMB diseñado e iniciado los experimentos. AJA escribió el manuscrito con las revisiones de JMB y el PDK. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a James Holton, George Meigs y Jane Tanamachi de asistencia a la Línea ALS 8.3.1. También damos las gracias a Emmanuel Skordalakes y Kevin Corbett por su inestimable ayuda y los conocimientos técnicos. Esta labor fue apoyada por subvenciones de la NSF (MCB-0549131, PDK) y el Instituto Nacional de Cáncer (CA077373, JMB). Los datos y las coordenadas se han presentado al Banco de Datos de Proteínas como AP ID 2IDC.

Nota: Aunque este documento fue objeto de examen, un documento de Tyler y sus colegas fue publicado que describe la interacción de las histonas Asf1 con H3/H4 (Inglés et al., Cell, 2006). Este trabajo confirma que la orientación de nuestro péptido H3 es correcta y valida nuestro modelado para Asf1 que dependen de la regulación de H3/H4 estequiometría.