PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Molecular adaptación durante radiación adaptativa en el hawaiano género endémico Schiedea

Biblioteca Pública de la Ciencia
Maxim V. Kapralov, Dmitry A. Filatov [*]
Resumen
Fondo

"Explosivo" radiaciones adaptativas en las islas siguen siendo uno de los más desconcertante fenómeno evolutivo. La tasa de fenotípicas y adaptaciones ecológicas es extremadamente rápido durante esos incidentes, lo que sugiere que muchos genes pueden estar bastante fuerte selección. Sin embargo, no hay pruebas para la adaptación a nivel de genes de codificación de la proteína se encontró, por lo que se ha sugerido que la selección puede trabajar principalmente en elementos reguladores. Aquí mostramos las primeras pruebas de selección positiva que hace funcionar a nivel de genes de codificación de proteína durante la rápida adaptación de radiaciones. Se estudió la adaptación molecular en hawaiano género de plantas endémicas Schiedea (Caryophyllaceae), que incluye especies estrechamente emparentadas con una sorprendente variedad de características morfológicas y ecológicas formas, que van desde la selva a la vid arbustos leñosos que crecen en el desierto-al igual que las condiciones en los acantilados. Dada la notable diferencia en rendimiento entre fotosintética Schiedea especies de diferentes hábitats, nos centramos en el "fotosintética" enzima rubisco, la eficiencia del que se sabe que es un paso limitante en la fotosíntesis vegetal.

Resultados

Nos demuestran que el gen rbcL cloroplasto, la codificación de la subunidad grande de la enzima rubisco, evolucionado bajo la selección positiva fuerte en Schiedea. Adaptive aminoácidos cambios ocurridos en las regiones funcionalmente importantes de RuBisCO que interactúan con rubisco activase, un chaperón que promueve y mantiene la actividad catalítica de RuBisCO. Es interesante señalar que la selección positiva que actúa en el rbcL podría haber causado cytotypes favorables para difundir a través de varias especies Schiedea.

Importancia

Se presenta la primera evidencia de adaptación a los cambios del ADN y la secuencia de proteínas que pueden nivel se han asociado con la evolución de la fotosíntesis y el rendimiento de la colonización de nuevos hábitats durante una reciente radiación adaptativa en una isla planta de género. Esto ilustra cómo pequeños cambios a nivel molecular puede cambiar el rendimiento ecológico de especies y nos ayuda a entender las bases moleculares de velocidad extremadamente rápida de adaptación durante la isla radiaciones adaptativas.

Introducción

La más dramática "ráfagas" de radiación adaptativa a menudo ocurren dentro de las regiones geográficas se limita (por ejemplo, las islas oceánicas o por vía lagos de agua dulce, por ejemplo [1]]. Aunque la isla de adaptación radiaciones pueden ser vistos como ejemplos extremos de diversificación evolutiva, se piensa que las grandes radiaciones adaptativas en la historia de nuestro planeta han seguido los mismos procesos evolutivos como la isla endémicas radiaciones. De este modo, las islas puede considerarse como evolutivo laboratorios se puede utilizar para comprender los procesos generales de la adaptación y la especiación [1], [2].

"Explosivo" isla de adaptación radiaciones son acompañadas por enormes manifestaciones fenotípicas y los cambios ecológicos sugieren que muchos genes podrían estar bajo bastante fuerte selección positiva. Sin embargo, no sabemos cómo funciona la selección natural a nivel molecular durante radiación adaptativa. Isla de hábitats son siempre limitados en el área, por lo que las poblaciones insulares son limitadas en tamaño. Además, muchas especies de la isla se cree que evolucionará a través de la colonización de nuevos hábitats o las islas ( "las islas especiación", [3]]. Esa colonización acontecimientos deberían dar lugar a una drástica reducción en el tamaño de la población. A medida que la eficacia de la selección es proporcional al producto del coeficiente selectivo y el tamaño efectivo de la población [4], el relativamente pequeño tamaño efectivo de la población de las especies insulares debería dar como resultado una reducción de la eficacia de la selección natural. En poblaciones pequeñas (por ejemplo, en especies endémicas de la isla), la dinámica de no-sinónimo mutaciones está dominado por la deriva y la fijación de probabilidades deletéreos mutaciones ventajosas y se espera que sean aproximadamente iguales [5]. Pocos estudios han investigado la acción de selección a nivel molecular durante la isla de adaptación radiaciones [6], [7]. Estos estudios indicaron un aumento en la no-sinónimo (d N) a sinónimo (S d) las tasas de sustitución en el hawaiano silversword alianza, lo que puede reflejar la ligera relajación de la depuración de selección en los pequeños Estados insulares en la población, pero ninguna prueba convincente de selección positiva se ha informado .

El pequeño tamaño de las poblaciones insulares también puede limitar la variabilidad genética necesaria para la selección natural al trabajo, por lo que el rápido ritmo de la diversificación fenotípica en las islas es bastante sorprendente. Hibridación interespecífica puede ser una posible fuente de variación genética dentro de cada especie [2], [8], [9]. Muy relacionado a menudo son especies cruzadas compatibles, y hay numerosos ejemplos de hibridación interespecífica en las plantas y los animales [10]. Incluso con bajas tasas de introgresión positivamente seleccionados alelos se puede propagar a través de varias especies [11]. Ocasionales eventos de hibridación interespecífica permitir radiaciones adaptativas a ser considerado como metapoblaciones, donde las mutaciones adaptativas pueden propagarse a través de varias especies significativamente acelerando el proceso de adaptación [12]. Sin embargo, no se sabe cómo común el intercambio de tales mutaciones de adaptación de varias especies podría ser.

En este trabajo presentamos el análisis positivo de selección a nivel molecular y la propagación de adaptación de alelos a través de varias especies de plantas endémicas hawaiano género Schiedea (Caryophyllaceae), lo que representa una de las mayores plantas de adaptación radiaciones en Hawai. Schiedea comprende 32 que viven ( y al menos dos extintas) especies adaptadas a una amplia gama de hábitats de bosque tropical húmedo a seco desierto-al igual que las condiciones de acantilados costeros [13]. Entre Schiedea 's más destacados transiciones evolutivas han producido cambios notables en su hábito de crecimiento, que van desde la selva viñedos y hierbas perennes a través de mésico y bosque seco subshrubs y arbustos para acantilado-vivienda arbustos [13] (véase el cuadro S1]. Estos últimos son especialmente notables para un linaje dentro de la familia Caryophyllaceae que contiene principalmente herbáceas anuales y perennes.

Schiedea especies de ambientes contrastantes (por ejemplo, la selva tropical vs acantilados costeros) son radicalmente diferentes unos de otros en muchos rasgos fisiológicos [13]. En particular, hay diferencias sustanciales en el rendimiento fotosintético en Schiedea, lo que sugiere que algunas de las proteínas de codificación de genes implicados en la fotosíntesis podría estar bajo la selección positiva. Esto nos motivó a elegir dos cloroplasto "fotosintética" genes, psbA y rbcL, de filogenia basados en el análisis positivo de selección. El primer gen, psbA, codifica photosystem II reacción centro proteína D1. Photosystem II es el primer eslabón de la cadena de la fotosíntesis, los fotones que capta y utiliza la energía para extraer electrones de las moléculas de agua [14]. El segundo gen, rbcL, codifica las grandes subunidades de ribulosa-1 ,5-bisphospate (RuBP) carboxylase / oxigenase (RuBisCO; EC 4.1.1.39) que cataliza el primer paso en la fotosíntesis neta de CO 2 y la asimilación de carbono photorespiratory oxidación [15]. "La proteína más abundante en el mundo", RuBisCO comprende alrededor de 40-50% de todas las proteínas solubles en los tejidos de las plantas verdes y es responsable de casi todos fijación de carbono en la Tierra. A pesar de su importancia crítica para la vida en nuestro planeta, esta proteína es muy ineficiente en su función, creando un cuello de botella, lo que limita el crecimiento de las plantas [15]. Esto hace que rbcL probablemente objeto de selección positiva, como una mejora en su función puede cambiar drásticamente el crecimiento de las plantas. Para la comparación también estudió un no photosyntetic gen del cloroplasto, matK, que codifica una proteína de función desconocida que es la hipótesis de participar en empalme en el genoma del cloroplasto [16], [17].

A continuación nos demuestran que uno de los genes estudiados fotosintética, rbcL, evolucionado bajo la selección positiva durante radiación adaptativa en Schiedea. Las diferencias en la secuencia de aminoácidos entre las diferentes especies Schiedea podría cuenta de las diferencias observadas en el rendimiento y la fotosíntesis puede haber ayudado al género de colonizar un nuevo hábitat-seco y soleado laderas y acantilados. Es interesante señalar que la selección positiva en Schiedea rbcL pueden haber causado adaptación del cloroplasto haplotipos para difundir a través de varios Schiedea las especies, lo que se sabe que en ocasiones forman híbridos en la naturaleza [13]. Esto apoya la opinión de que el intercambio de mutaciones de adaptación de varias especies pueden desempeñar un papel importante en la evolución de adaptación de plantas [2], [9], [12].

Resultados
Selección positiva en Schiedea rbcL

Filogenético de máxima verosimilitud análisis de selección a nivel molecular supone que la filogenia de un gen analizado es correcta [18]. El publicada filogenia del género Schiedea se basa en la morfología y sus secuencias y ETS y está relativamente bien establecido [13]. Sin embargo, los genes pueden tener los árboles de genes que difieren de las especies de árboles debido a la transferencia horizontal de genes y el linaje de clasificación [2], [19], [20]. Por lo tanto, con el fin de llevar a cabo filogenético de máxima verosimilitud análisis de selección en los genes del cloroplasto es esencial para construir un robusto árbol de genes del ADN del cloroplasto Schiedea. Con este fin hemos secuenciado fragmentos de psbA, rbcL y matK codificación de los genes de proteínas, así como noncoding trnL intron, psbA-trnK y trnL-trnF intergénicas separadores y RRT-trnG región (en total, 5,3 kb por persona, Tabla 1] de 27 Schiedea todas las especies utilizadas en este estudio (Fig. 1 y el cuadro complementario S1]. Como era de esperar para un no-recombinación del genoma del cloroplasto, el phylogenies sobre la base de cada cloroplasto regiones eran compatibles entre sí, lo que nos permite concatenar las bases de datos, que se tradujo en un resuelto bastante bien la filogenia de arranque con un alto apoyo (25 haplotipos para el conjunto de datos concatenados, Fig . 1]. Curiosamente, el gen del cloroplasto Schiedea árbol (Fig. 1] difiere sustancialmente de los aceptado su HTA + + morfología basada en la filogenia del género [13]. La explicación plausible para la observó discordancia de los phylogenies, así como en vez de "superficial" clados III y IV en la cpDNA árbol (Fig. 1] podría ser la transición de cytotypes a través de hibridación interespecífica y más favorable la fijación de haplotipos dentro de múltiples especies. De hecho, todas las especies Schiedea de cpDNA clado III vivir en la misma isla, Kaua'i, mientras que las especies de cpDNA clade IV habitan varias islas más jóvenes (O'ahu, Maui, Moloka'i, Lana'i, Hawai'i) que estaban conectados entre sí en diversos puntos en la historia del archipiélago. Por lo tanto, parece probable que el cpDNA clados III y IV representan cloroplasto hapoltypes que se han propagado a través de varias especies en Kaua'i, jóvenes o islas. Positivo fuerte selección en la Schiedea gen rbcL fotosintética se describen a continuación pueden haber causado la cytotypes para difundir a través de varias especies.

Uno de los tres investigados codificación de los genes de proteínas-psbA-parecía ser sometido a una fuerte selección en la depuración de Schiedea, no mostrando no sinónimos y sólo ocho sinónimo sustituciones (Cuadro 2]. Por otra parte, cuando se compararon Schiedea 's psbA con homólogos de Silene latifolia (Caryophyllaceae, Caryophyllales; GenBank AB189069) y Chenopodium rubrum (Chenopodiaceae, Caryophyllales; GenBank Y14732) observó las 47 mutaciones de nuevo parecen ser sinónimos.

Ambos matK y rbcL mostró relativamente alta d n / d S promedio en toda la Schiedea filogenia-0,72 y 0,50, respectivamente (Cuadro 2]. Sin embargo, la distribución de la no-sinónimo sustituciones en el árbol filogenético de rbcL y todas las demás regiones fue notablemente diferente (Tabla 2]. Mientras que los diez no es sinónimo sustituciones en rbcL se produjo en el interior de las sucursales, no es sinónimo sustituciones en matK, así como mutaciones en sinónimo rbcL, matK y psbA y mutaciones en todos los no-regiones codificantes apareció principalmente en las ramas terminales (Tabla 2; Fig 1]. 2 × 2 de contingencia pruebas demuestran que un número inusualmente grande de sustituciones de aminoácidos en la Schiedea rbcL ocurrido en el interior de las ramas del árbol en comparación con las mutaciones en sinónimo rbcL, así como a los no-sinónimo y sinónimo mutaciones en matK y psbA y mutaciones no en regiones codificantes (Cuadro 3].

Para probar la presencia de codones en virtud de selección positiva en matK y rbcL hemos utilizado las pruebas probabilidad ratio (LRTs) para comparar los modelos anidados para permitir variación en la letra d n / d S ratio a través de los codones [21]. En este análisis se compararon los siguientes pares de modelos aplicado en codeml programa [18]: M1a/M2a [22], M7/M8 [21] y M8a/M8 [23]. Modelo M1a permite dos clases de lugares: una clase con la letra d n / d S variables libremente entre 0 y 1, y otro con la letra d n / d S = 1 [22]. Modelo 2 bis tiene una clase adicional de los sitios a los que puede acomodar los codones con la letra d n / d S & gt; 1 [21]. El modelo M2a encaja rbcL datos significativamente mejor que el modelo de M1a (χ 2 = 12,88, P = 0.0016, df = 2), si bien no existe una diferencia significativa en el ajuste de los dos modelos a matK datos (χ 2 = 1,82, P = 0.4025 , Df = 2). En otro anidado par de modelos M7 asume que todos los codones han d n / d S distribuidas de acuerdo con la distribución beta discreta entre 0 y 1, mientras que el modelo M8 permite una clase adicional de codones con la letra d n / d S & gt; 1 [21]. La comparación de estos dos modelos en una LRT es una prueba para detectar la presencia de una clase de codones con la letra d n / d S & gt; 1 [21]. El modelo M8 encaja rbcL datos significativamente mejor que el modelo M7 (χ 2 = 13,25, P = 0.0013, df = 2), si bien no existe una diferencia significativa en el ajuste de dos modelos de datos matK2 = 1,87, P = 0.3926 , Df = 2). En el marco del modelo M8 cerca de un 4% de los codones en rbcL caer en la clase seleccionada positivamente, que ha d n / d S = 13,92. Una prueba más severa para la selección positiva compara modelos M8 y M8a, que es el mismo modelo M8, pero la clase de codones con la letra d n / d S & gt 1; en M8 se ve obligado a tener d n / d S = 1 en M8a. Esta LRT específicamente si las pruebas d n / d S codones para caer en esta clase es significativamente mayor que la unidad [23]. Mientras que en M8-M8a comparación no hubo diferencias significativas en matK apropiado para los datos (χ 2 = 1,82, P = 0.1773, df = 1), la aplicación de esta prueba para Schiedea rbcL demostrado que este gen tiene con los codones d n / d S significativamente mayor que la unidad (χ 2 = 12,87, P = 0.0003, df = 1), que prevé fuertes indicios positivos para la selección.

Las sustituciones de aminoácidos en Schiedea RbcL

El resumen de las sustituciones de aminoácidos en Schiedea rbcL y sus posibles efectos se presentan en el cuadro 4. A lo largo del texto de aminoácidos posiciones están numeradas de acuerdo a las espinacas rbcL para que la estructura de proteínas cristal está disponible [24]. Nueve de cada diez sustituciones de aminoácidos se produjo en las ramas de la filogenia anterior a la división de los clados III y IV o que conduzcan a la clados III y IV (Fig. 1].

Para cuatro de cada diez sustituciones de aminoácidos en Schiedea rbcL (residuos 86, 230, 326 y 449) una probabilidad Bayesiana posterior de selección positiva de más de 0,99 fue mostrado por la Bayes Bayes análisis empírico aplicado a las PAML paquete [25]. Tres de estos residuos (posiciones 230, 326 y 86) residen en las regiones que desempeñan papel clave en el funcionamiento de la enzima rubisco.

Sustitución Ala230 ⇒ Thr230 ocurrió en la sucursal que conduzcan a la clados III y IV del gen del cloroplasto Schiedea árbol (Fig. 1]. Residuos 230 interactúa con la A-β β B bucle de la subunidad pequeña [26]. Este residuo 230 es muy solvente accesible (alrededor del 60% de la superficie total; Tabla 4] y tiene un vínculo con hidrógeno de residuos 10 de la subunidad pequeña de RuBisCO. Sustitución Ala230 ⇒ Thr230 disminuye significativamente hidrofobicidad del residuo que tiene un efecto estabilizador en esta situación (Cuadro 4].

Sustitución Ile326 ⇒ Val326 ocurrido en la sucursal que conduzcan a la clados III y IV del gen de árboles (Fig. 1]. 326 de residuos cuenta con seis contactos internos y situado dentro de la molécula de proteína en la β-capítulo 6 bucle de acompañamiento, un elemento flexible que se pliega sobre el sustrato durante la catálisis y desempeña un papel clave en la discriminación entre el CO 2 y el O 2 compiten en RuBP carboxilación y oxigenación reacciones de RuBisCO [15], [26]. Aunque Ile y Val han propiedades similares, Val es más pequeño y tal sustitución debe aumentar la estabilidad general de la molécula (Cuadro 4].

Curiosamente, la sustitución His86 ⇒ Tyr86 ocurrido dos veces en forma independiente Schiedea filogenia-en las ramas principales a la clado II y para el clado III (Fig. 1]. 86 de residuos teniendo una gran solvencia accesible (alrededor del 50% de la superficie total; Tabla 4] y puede ser una parte de la rubisco activase reconocimiento región situada en la carretera N-terminal de dominio [15], [27]. El reconocimiento activase región proporciona un contacto físico entre RuBisCO y rubisco activase, un ATP-dependientes de la enzima que libera apretado vinculante de azúcar en los fosfatos de la RuBisCO sitio activo y facilita la conversión de RuBisCO de la privada a la conformación abierta. Rubisco activase desempeña un papel fundamental en la respuesta de la fotosíntesis a la temperatura [27]. Casas de Su y Tyr son muy diferentes: después de His86 ⇒ Tyr86 sustitución hydrophobicy y el volumen de residuos y el aumento de la polaridad se redujo drásticamente la molécula hacer más estrictos, mientras que menos solubles (Cuadro 4]. A pesar de que esta se prevé que disminuya la estabilidad de la molécula (Cuadro 4], este análisis se hizo sin tener interacción con rubisco activase en cuenta (para los que no la estructura de proteínas está disponible). Disminución de la polaridad y el aumento de hydrophobicy de los residuos que interactúan con rubisco activase puede resultar en más estrictas vinculante. Por lo tanto, His86 ⇒ Tyr86 sustitución pueda afectar a la interacción física de RuBisCO con rubisco activase. Aunque 86 de residuos es uno de los más variable en las posiciones de la subunidad grande (hasta 11 aminoácidos diferentes a través de los 499 especies de plantas; [26]], His86 ⇒ Tyr86 sustitución es muy raro, teniendo en cuenta que alrededor del 76% de 491 especies de floración His86, pero sólo dos especies (<1%) han Tyr86 [15].

Por otra parte, 86 de residuos no es el único de Schiedea rbcL sustituciones que pudieran estar implicados en RuBisCO-rubisco activase interacciones. La crítica residuos de estas interacciones identificados hasta ahora son inmediatamente adyacente al sitio activo (Fig. 2, [27]], así como los residuos en el capítulo G (en particular el capítulo 6)-H capítulo región y carboxilo terminal [15]. Sobre la base de datos publicados [15], [27] y la creación de modelos estructurales que encontramos que, aparte de residuos de 86 residuos de otros seis de cada diez sustituciones en Schiedea rbcL podrían estar involucrados en RuBisCO-rubisco activase interacciones (residuos 23 y 326 están cerca de la activa sitio; residuos 354, 363, 367 pertenecen a la línea G-H capítulo región y el residuo 470 está cerca del carboxilo terminal). Seis de cada diez detectado mutaciones de aminoácidos, mientras que residen lejos unos de otros en la secuencia de aminoácidos parece relativamente estrecha en la estructura terciaria y podrían influir en los demás: en la estructura terciaria la distancia media entre los residuos 86, 145, 326, 354 , 363 y 367 es 15.1Å, entre los residuos 145, 326, 354 y 363 es 12.2Å, y entre los residuos 145, 354 y 363 es 9.2Å). La proximidad de estas sustituciones en la estructura terciaria de proteínas sugiere que varias mutaciones pueden tener un efecto acumulativo que afecta a las propiedades globales de interacción rubisco activase región en Schiedea 's RuBisCO (Fig. 2].

Discusión

Hemos demostrado que el gen rbcL, codificación de la subunidad grande de la enzima rubisco, podrían haber sido sometido a una fuerte selección positiva en los últimos radiación adaptativa en hawaiano Schiedea. RuBisCO cataliza el primer paso en la fotosíntesis neta de CO 2 y la asimilación de carbono photorespiratory oxidación. La enzima está sujeto a la inhibición competitiva de O 2, inactivación por la pérdida de carbamylation, y el callejón sin salida inhibición de RuBP, que hace ineficiente RuBisCO como un catalizador para la carboxilación de RuBP y la limitación de la fotosíntesis y el crecimiento de las plantas [15]. Por lo tanto, incluso pequeñas mejoras en la eficiencia de esta enzima puede proporcionar importantes ventajas fisiológicas.

En la tierra las plantas RuBisCO se compone de ocho grandes subunidades (LSUs) codificada por el gen rbcL cloroplasto y ocho pequeñas subunidades (SSUs) codificadas por una familia de genes rbcS nuclear [28], [29]. Por mutagénesis dirigida en Rhodospirillum rubrum, Synechococcus, Chlamydomonas, y el tabaco se ha demostrado que, incluso mutaciones solo puede positiva o negativamente el cambio o la estabilidad de la especificidad por el sustrato RuBisCO [15], [30]. Los cambios más drásticos en el rendimiento son RuBisCO inducida por reemplazos en el sitio activo y en las regiones proporcionar interacciones entre LSUs y SSUs, y entre RuBisCO y rubisco activase [15], [30].

La mayoría de las sustituciones de aminoácidos en Schiedea rbcL (residuos 23, 86, 326, 354, 363, 367 y 470) residen en las regiones en las que influyen en las interacciones con rubisco activase, un chaperón que promueve y mantiene la actividad catalítica de RuBisCO [15], [27] . Rubisco activase desempeña un papel fundamental en la respuesta de la fotosíntesis a la temperatura [27], así molecular adaptación de RuBisCO-rubisco activase interacciones pueden haber desempeñado un papel importante en la adaptación de especies a Schiedea seco y soleado. Por otra parte, cinco de los residuos sustituido (86, 326, 354, 363 y 367) se acercan el uno al otro (distancias <20Å) en la RuBisCO estructura terciaria, lo que sugiere posible efecto acumulativo. Secuenciación e investigación de Schiedea 's rubisco activase podría ser de gran interés para futuros estudios de posibles coevolution de RuBisCO y rubisco activase en Schiedea.

La distribución de rbcL sustituciones de aminoácidos en la filogenia Schiedea cpDNA corrobora su importancia funcional posible. No sinónimo mutaciones favorecido por la selección positiva se espera que sean más comunes en el interior de las sucursales en relación con ramas terminales [31]. De hecho todas las sustituciones de aminoácidos en Schiedea apareció en el interior de las ramas (Fig. 1], un patrón diferente de significally los rbcL sinónimo de sustituciones, así como de no-sinónimo y sinónimo mutaciones en otras regiones investigadas cpDNA (Cuadro 3].

Los posibles cambios de propiedades en RuBisCO Schiedea previsto de modelado estructural adaptan bien a la diferencia observada en las tasas de fotosíntesis [13] entre "basal" y "avanzadas" las especies (aproximadamente correspondientes a clados I + II + III y IV, respectivamente) como así como con una amplia distribución de "avanzado" dentro de rbcL haplotipos Schiedea. El "basal" Schiedea especies habitan mésico o sombreados bosques húmedos, mientras que la mayoría de las especies en la "avanzada" clados (sección Schiedea) colonizados seco y soleado hábitats, tales como acantilados costeros. Dada la importancia de la enzima RuBisCO rendimiento para el crecimiento de las plantas y el efecto significativo de las mutaciones que afectan a los contactos con rubisco activase [15], [30], la His86 ⇒ Tyr86 y otros reemplazos en Schiedea rbcL pueden haber desempeñado un papel importante en la colonización de las zonas secas hábitats en los últimos radiación adaptativa en Schiedea. Molecular adaptación a fotosintética enzima RuBisCO representa el primer caso conocido de la adaptación a nivel de la proteína durante una reciente radiación adaptativa y revela bases moleculares de fisiológicos y ecológicos rápida evolución durante radiaciones en la isla endémicas.

Selección positiva en rbcL posiblemente ser la causa de la fijación de dos haplotipos del cloroplasto en prácticamente todas las especies de Schiedea sensu stricto (CLADES III y IV en la Fig. 1] y, por ende, la razón principal de cytonuclear discordancia. Esta hipótesis se ve corroborada por el patrón geográfico de Schiedea cpDNA haplotipo distribución, que representan clados islas, en lugar de reconocido Schiedea secciones (Fig. 1].

Pese a los notables morfológico y ecológico divergencia, natural de híbridos interespecíficos se han encontrado a muchos Schiedea especies y la capacidad de hibridación cruzada entre sí se ha demostrado la casi totalidad de las especies en Schiedea verde-casa experimentos [13]. Sin embargo, la fuerte aislamiento geográfico entre y dentro de las islas hace interspecies contactos bastante raro. De hecho, un anterior estudio de la diversidad del ADN ha demostrado que el aislamiento entre las poblaciones de S. globosa de diferentes islas es mucho más fuerte que entre las poblaciones de la misma isla [32]. Por lo tanto, es muy probable que sólo los genes en virtud de fuerte selección positiva se puede propagar a través de Schiedea especies.

Positivos en la selección no recombinación del ADN del cloroplasto se espera lleve a un diferencial de los seleccionados del cloroplasto haplotipo a través de varias especies, causando filogenética cytonuclear discordancia. Cytonuclear discordancia promovido por hibridación interespecífica se ha encontrado en muchas radiaciones adaptativas incluidos los pinzones de Darwin, cíclidos africanos, el lago Baikal sculpins y hawaiano silversword alianza (revisado en [2]]. Complete plastom mitocondria y reemplazos a través de la introgresión interespecíficas han sido documentados por diversas plantas y animales grupos (revisado en [33]]. La mayoría de los autores suelen atribuir la ocurrencia de introgresión de los acontecimientos demográficos y la fijación de oportunidad, mientras que un número relativamente reducido de selección positiva sugieren como una posible causa [34], [35]. La adaptación sustituciones de aminoácidos en Schiedea rbcL se produjo en las ramas principales a los clados III y IV del gen del cloroplasto árbol. La propagación del ventajosa rbcL alelos a través de muchos Schiedea especies que habitan la misma isla (o un grupo de islas conectada con anterioridad) argumenta a favor de la selección positiva como la principal causa de la discordancia cytonuclear y sugiere que el intercambio de mutaciones de adaptación de varias especies estrechamente emparentadas puede ser un factor importante en la evolución de adaptación de las pequeñas poblaciones confinadas dentro de las regiones geográficas, tales como las islas oceánicas o grandes lagos.

Materiales y Métodos
Aislamiento y secuenciación de genes Schiedea

Morfología, ecología y Schiedea origen de las especies utilizadas en este estudio se presentan en la Tabla S1. ADN genómico fue aislado de hojas frescas de material magnetico utilizando bolas a base de ADN Vegetal Encargado Switch Kit (Invitrogen), de conformidad con el fabricante de protocolo. Los primers utilizados para la amplificación y secuenciación se enumeran en el cuadro S2. Para amplificación por PCR de todas las regiones, excepto RRT-trnG hemos utilizado BIOMIX Roja (Bioline) con las siguientes condiciones de PCR: un ciclo de 95 ° C, 2 min, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 4 min seguido de 36 ciclos de 93 ° C, 30 s, 53 ° C, 30 s, 72 ° C, 3,5 min. Para amplificación por PCR de RRT-trnG región hemos utilizado el Protocolo n ° 1 de [36]. Los productos de PCR fueron extraídos de los geles de agarosa utilizando el Qiagen kit de extracción de gel. La secuenciación se realizó mediante ABI BigDye v3.1 en un sistema automatizado de secuenciación ABI3700 máquina. Secuencia de cromatogramas fueron verificados y corregidos, y los contigs estaban reunidos y alineados ProSeq3 utilizando software [37]. Todos los sitios polimórficos se verificaron contra la secuencia original cromatogramas y dudoso regiones se resequenced; secuencias obtenidas se compararon con homólogos de GenBank y la integridad ORFs fue confirmado para la codificación de secuencias de proteínas; indeles todos se retiraron antes de nuevos análisis. Novela secuencias se han presentado al GenBank bajo los números de adhesión DQ907721-DQ907909.

Pruebas estadísticas para la selección positiva

El vecino a participar en los árboles para todos los investigados cloroplasto región, así como por tres conjuntos de datos concatenados (noncoding regiones, regiones codificantes, todas las regiones) fueron creados usando MEGA v3.1 [38]. Las topologías de todos los árboles obtenidos fueron similares y para seguir los análisis filogenéticos de selección positiva en Schiedea 's del cloroplasto de codificación de los genes de proteínas que utiliza el árbol unrooted concatenados sobre la base de datos de todas las regiones.

Se utilizó el programa codeml en la PAML v.3.14 [18] paquete para estimar la no-sinónimo divergencia (d N), sinónimo divergencia (S d), y su proporción (d n / d S) en el modelo 0, que permite para un solo d n / d S valor a lo largo de todo árbol filogenético. Además, codeml se utilizó para realizar pruebas de coeficiente de riesgo (LRTs) para la tasa de heterogeneidad y positiva entre la selección de aminoácidos sitios. Se aplicaron modelos de evolución codón que permiten la variación en la letra d n / d S entre los codones, pero asumir la misma distribución en todas las ramas de la filogenia. Se realizó tres LRTs positivo para la selección: M1a, M2a LRT, M7-M8 LRT y M8a-M8 LRT [21] - [23]. Para todos los LRTs, el primer modelo es una versión simplificada de la segunda, con un menor número de parámetros, y, por tanto, espera un ajuste más pobres a los datos (menor de máxima verosimilitud). El M1, M7 y M8a modelos son nulos los modelos positivos, sin selección (no con los codones d n / d S &amp; gt; 1) y el M2 y M8 modelos son los modelos alternativos con la selección positiva. La importancia de la LRTs se calculó suponiendo que el doble de la diferencia en el registro de máxima verosimilitud entre los dos modelos se distribuye como una chi-cuadrado de distribución con los grados de libertad (df) dado por la diferencia en el número de parámetros en los dos modelos anidados. Por tanto M1a, M2a y M7-M8 comparaciones usamos df = 2 [21], [22]. Se argumentó que para M8a-M8 comparaciones las pruebas adecuadas, podría utilizar una mezcla 50:50 de df = 0 y df = 1 [23], sin embargo asumimos df = 1 para esta prueba, que es conservador [22].

Para identificar los aminoácidos sitios potencialmente positivo en virtud de selección, los parámetros estimados del modelo M8 se utilizaron para calcular la parte posterior probabilidades de que un amino ácido pertenece a una clase con la letra d n / d S &amp; gt; 1 con el Bayes enfoques empíricos de Bayes aplicado en PAML [25].

Análisis estructural de rubisco

Se utilizó la espinaca RuBisCO estructura de la proteína [24] a deducir el posible efecto (s) de mutaciones en los residuos identificados como estar bajo la selección positiva en Schiedea. La divergencia entre rbcL s de espinacas y Schiedea en el nivel de aminoácidos es de entre 3,2% y 4,4%, dependiendo de la especie Schiedea. Por otra parte, los estados ancestrales de ocho de cada diez se encuentran en las sustituciones Schiedea rbcL son idénticos a los residuos correspondientes a las espinacas, por lo que es apropiado utilizar la estructura de proteínas obtenidas de las espinacas. RuBisCO datos estructurales de espinacas (1RBO) se obtuvieron a partir de la RCB Protein Data Bank ( http://www.rcsb.org/pdb ). El disolvente superficies accesibles para los distintos aminoácidos en la estructura y el impacto de un solo reemplazos en general la estabilidad estructural fueron analizados mediante el software CUPSAT [39; http://cupsat.uni-koeln.de ]. El estructurales contactos para aminoácidos individuales en la estructura fueron analizados mediante el DeepView-Swiss-PdbViewer v. 3,7 [40; http://www.expasy.org/spdbv/ ] Y STING Informe [41; http://trantor.bioc.columbia.edu/SMS/ ].

Apoyo a la Información

Estamos agradecidos al Dr S. Weller por proporcionarnos Schiedea material foliar, al Dr Z. Yang y el Dr M. Anisimova de asesoramiento sobre PAML, al Dr K. Futterrer de ayuda y asesoramiento con el análisis de la estructura de proteínas y al Dr G. Muir para sugerencias y corrección del manuscrito.