PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Cruz especies asociación examen de UCN3 y CRHR2 como posibles objetivos farmacológicos para Antiobesity drogas

Biblioteca Pública de la Ciencia
Zhihua Jiang [*], Jennifer J. Michal, Galen A. Williams, Tyler F. Daniels, Tanja Kunej
Resumen
Fondo

La obesidad constituye actualmente un importante problema de salud pública mundial. Los estudios han demostrado que la resistencia a la insulina asociada con la obesidad se asocia con intramyocellular lípidos (IMCL) acumulación. Por lo tanto, la identificación de genes asociados con el fenotipo proporcionaría un objetivo claro para la intervención farmacéutica y la atención de la enfermedad. La hipótesis de que urocortin 3 (UCN3) corticotropina y la hormona liberadora de receptor 2 (CRHR2) se asocian con IMCL y profundidad de grasa subcutánea (FSD), debido a que la corticotropina hormona liberadora de la familia de péptidos son capaces de fuerte anorexígeno y termogénico efectos.

Metodología / Principales conclusiones

Hemos anotado tanto bovina UCN3 y CRHR2 genes e identificado 12 mutaciones genéticas en el gen antiguo y 5 marcadores genéticos en la región promotora de este último gen. Genotipos 17 de estos marcadores en Wagyu × Limousin F 2 progenie reveló asociaciones significativas entre el promotor y los polimorfismos Fondo Social para el Desarrollo (P = 0,0203-0,0685) y entre missense mutaciones del exón 2 y IMCL (P = 0.0055-0.0369) en las especies bovina UCN3 gen. El Fondo Social para el Desarrollo promotor SNPs asociados causado una ganancia / pérdida potencial de 12 de transcripción regulador sitios de unión, mientras que la codificación IMCL SNPs asociados afectado a la estructura secundaria de UCN3 mRNA. Sin embargo, ninguno de los cinco polimorfismos en el gen CRHR2 claramente co-segregados, ya sea con los rasgos de la población (P> 0,6000).

Conclusiones / Importancia

Porque UCN3 se encuentra en el cromosoma 10p15.1 humanos donde los rasgos cuantitativos loci de la obesidad se ha informado, nuestra cruz especies estudio proporciona una prueba más de que podría proponerse como un objetivo potencial para el desarrollo de antiobesity drogas. Ninguno de los marcadores en CRHR2 estuvo asociada con la obesidad de tipo rasgos en el ganado, lo cual es coherente con los resultados en humanos. Por lo tanto, CRHR2 no se presta al desarrollo de antiobesity drogas.

Introducción

La obesidad se ha incrementado a un ritmo acelerado en los últimos años y ahora es a nivel mundial problema de salud pública. La principal consecuencia del sobrepeso y la obesidad es que están asociados con más de 30 condiciones médicas, lo que causa alrededor de 300000 muertes y los gastos médicos totales (directos e indirectos) de $ 139 mil millones anuales en los EE.UU. por sí solas [1]. La resistencia a la insulina, una característica de la obesidad, previene la insulina de tomar el azúcar de los alimentos y la distribución en todo el cuerpo para la energía. Muchos estudios han indicado claramente que intramyocellular acumulación de triglicéridos es un importante contribuyente a la resistencia a la insulina [2]. Por lo tanto, la identificación de genes asociados con la acumulación de lípidos intramyocellular proporcionaría un objetivo claro para la intervención farmacéutica y la atención de la obesidad y sus condiciones, como la presión arterial alta, diabetes tipo 2, enfermedad coronaria, ciertos tipos de cáncer, la mala salud reproductiva femenina y trastornos psicológicos.

Urocortin 3 (UCN3) corticotropina y la hormona liberadora de receptor 2 (CRHR2) son miembros de la corticotropina-la hormona liberadora (CRH) la familia de péptidos. UCN3 se une selectivamente a CRHR2 [3] y ambos son co-expresados en todo el sistema nervioso central, como en el núcleo ventromedial hipotalámico, lateral septum y la cama núcleo de la stria terminalis [4], así como en el tracto gastrointestinal [5 ]. Ambos UCN3 y CRHR2 son, por tanto, cree que desempeñan un papel central en el apetito y la regulación gastrointestinal motor. De hecho, cuando se expone a una dieta con alto contenido en grasa, CRHR2 de ratones mutantes consumieron una cantidad significativamente más alimentos manteniendo el mismo peso corporal como de tipo salvaje littermates [6]. Intracerebroventricular inyecciones de UCN3 se encontraron para reducir el apetito por la supresión de la ingesta de alimentos en la libertad de ratas alimentadas [7].

Por otra parte, cada vez hay más pruebas que apoyan la participación de estos dos péptidos en la regulación de la homeostasis energética y en la mediación el efecto anoréxico de CRH en el nivel adiposo. Por ejemplo, Seres y colegas [8] determinó que ambos UCN3 y CRHR2 se expresan en humanos visceral y tejido adiposo subcutáneo. Obviamente, la producción local de estos dos péptidos en el tejido adiposo indica su participación directa en función de la célula grasa, además de sus efectos sobre la central de regulación de peso. En particular, Doyon y colegas [9] llegó a la conclusión de que CRHR2 podría ser un objetivo potencial para el desarrollo de una antiobesity de drogas. Por lo tanto, la hipótesis de que los polimorfismos genéticos de UCN3 y CRHR2 genes están asociadas con intramyocellular acumulación de lípidos (IMCL) y grasa subcutánea profunda (FSD) en los mamíferos. Con el fin de probar la hipótesis, se anotaron las especies bovina UCN3 y CRHR2 genes e identificado un total de 17 polimorfismos genéticos para una asociación de estudio. El análisis estadístico utilizando el modelo lineal general (GLM) de SAS procedimiento y cuantitativa de desequilibrio de transmisión de prueba (QTDT) ha puesto de manifiesto que UCN3 gen, pero no a su receptor CRHR2 gen, se asoció significativamente con ambos intramyocellular subcutáneo y la acumulación de lípidos en Wagyu × Limousin F 2 cruces.

Materiales y Métodos
Animales y rasgos fenotípicos

A Wagyu × Limousin población de referencia se desarrolló, entre ellos 6 toros F 1, 113 F 1 y presas ~ 250 F 2 progenie [10]. El japonés Wagyu raza de ganado ha sido tradicionalmente seleccionados para la alta acumulación IMCL (medido como jaspeado con una puntuación media de 8,52), mientras que la raza Limousin ha sido seleccionado para el músculo pesado, lo que conduce a la acumulación de bajas IMCL (jaspeado puntuación media inferior a 4,78 ) [11]. La diferencia en la acumulación IMCL entre estas dos razas son muy singular para trazar el mapa de QTL para el carácter. Jaspeado el sector de la carne es el término comúnmente utilizado para describir la aparición de manchas blancas o estrías de grasa entre las fibras musculares en la carne, que es esencialmente equivalente a IMCL acumulación medido en los seres humanos. Resultado jaspeado el sector de la carne era una medida subjetiva de la cantidad de IMCL en el músculo longissimus basado en las normas del USDA ( http://www.ams.usda.gov/ ). Profundidad de grasa subcutánea (SFD) se midió a los 12-13 º costilla interfaz perpendicular a la superficie exterior en un punto las tres cuartas partes la extensión del músculo longissimus de su chine hueso. El jaspeado partituras para IMCL osciló entre 4 a 9,5 y SFD varía de 0,1 a 1,3 pulgadas de la población.

Secuencia de anotación y primer diseño

Se determinó la organización genómica de las especies bovina UCN3 y CRHR2 través de la aproximación de una secuencia de cDNA bovina (BC114855), con una bovina ADN genómico contig (AAFC03043460) para la ex gen, y la alineación de la secuencia de ARNm humanos (NM_001883), con una bovina ADN genómico contig (AAFC03056271 ) Para este último gen. Tres pares de cebadores fueron diseñados para orientar el promotor (hacia el 5'GGG GCT CCA GCA AGC AAA CAA TGT C3 'e invertir-5'TCT CAC CTT CTT CCT GGA GCC AAC3'), no codificante del exón 1 (hacia adelante - 5 'TCT GGG AGG AGA GAA GGT GGG TAG3' e invertir - 5'AAA CAC AGA CAT TGA CGG TTC AGC3 ») y la codificación de exón 2 (hacia adelante - 5'CTG AAC TTG CAC AAA GCC TGG TAG3 'e invertir - 5'CCC AGC CTC CTC CTC TTC TAC TTC3 ') en el gen UCN3. Otros dos pares de cebadores fueron diseñados para ampliar los productos en el promotor (adelante - 5'TGA GAC TGG AGC ACA CAA ACA CAG3 'e invertir - 5'CAA GTG AGC TGG AGG TGA AAA CCT3') y el exón 1 región (hacia adelante -- 5'TCC TCT CTA CCG AGG AGA CTP CT3 'e invertir - 5' AGG AAC CAC ACT GGG TGT TAT3 TCG ») en las especies bovina CRHR2 gen, respectivamente.

El polimorfismo de detección y desarrollo de genotipos de ensayo

Aproximadamente el 50 ng de DNA genómico de cada seis toros F 1 fueron amplificados en un volumen final de 10 μ L que contenían 12,5 ng de cada primer, 150 μ M dNTPs, 1,5 mM de MgCl 2, 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl y 0,25 U Platinum de Taq polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las condiciones de PCR se llevaron a cabo como sigue: 94 ° C durante 2 min, 32 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 63 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos, seguido por otros 5 min de extensión a 72 ° C. Productos de PCR fueron secuenciados para detectar el polimorfismo en un secuenciador ABI 3730 en el Laboratorio de Biotecnología y Bioanalysis (Universidad del Estado de Washington), utilizando un protocolo estándar. El mismo producto de PCR secuenciación directa enfoque también se utilizó para el genotipo de los polimorfismos en todos los animales.

El análisis de los datos

Las estimaciones correspondientes a los grados de equilibrio de Hardy-Weinberg dentro de cada mutación y desequilibrio en el ligamiento genético entre mutaciones y selección de etiquetado de los polimorfismos genéticos en cada una de las especies bovina UCN3 y CRHR2 genes se realizaron con el programa HAPLOVIEW [12]. Los datos fenotípicos para ambos IMCL Fondo Social para el Desarrollo y las mediciones fueron previamente ajustados por año de nacimiento, sexo, edad (en días), peso vivo (kg), o grasa profundidad (pulgadas), según corresponda. El ajustado fenotipos fueron utilizadas en un análisis posterior asociación utilizando el GLM (modelo lineal general) procedimiento de SAS v9.1 (SAS Institute Inc, Cary, NC). Par-sabia comparaciones de los mínimos cuadrados medios se realizó con un protegidas t-test. Además, el desequilibrio cuantitativo de transmisión de prueba (QTDT) [13] se realizó para seguir examinando la asociación entre las mutaciones y el etiquetado ajustado relacionadas con la obesidad fenotipo de datos. Valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo tras la corrección de Bonferroni. Por significativamente mutaciones asociadas, la MatInspector servidor web [14] se utiliza para la inspección de regulación transcripcional potencial sitio de unión cambios provocados por el promotor polimorfismos, mientras que el Mfold servidor web [15] se utilizó para predecir la estructura secundaria del mRNA cambios causados por la codificación de polimorfismos.

Resultados
Organización genómica de las especies bovina y UCN3 genes CRHR2

BLAST búsquedas utilizando la secuencia de cDNA de la UCN3 de genes humanos (NM_053049) como punto de referencia recuperado tres bovina orthologous secuencias de cDNA a partir de la base de datos GenBank. La más larga secuencia de cDNA con BC114855 bp 1404 se utilizó y se recuperan una secuencia de ADN genómico (AAFC03043460) del mismo gen de 7,15 × la secuencia del genoma bovino base de datos. La alineación de cDNA y tanto las secuencias de ADN genómico se determinó la organización genómica de las especies bovina UCN3 gen. Al igual que los cuatro CRH paralogs humanos, las especies bovina UCN3 gen tiene dos exones y un intrón (Figura 1].

Para las especies bovina CRHR2 gen, una BLAST búsqueda usando la secuencia de ARNm humanos (NM_001883) recuperado tres bovina orthologous tecnologías ecológicamente racionales (BI849955, DV873120 y CK774717), pero no pudieron formar una larga duración de cDNA de la secuencia genética bovina. Afortunadamente, uno bovina ADN genómico contig (AAFC03056271) de 7,15 × la secuencia del genoma bovino base de datos se obtuvo utilizando la secuencia de cDNA humanos, y la alineación de la secuencia de cDNA humanos y las especies bovina ADN genómico descifrar la secuencia genómica organización de las especies bovina CRHR2 de genes, entre ellos la región promotora. La organización genómica de CRHR2 gen también se conserva en el ganado bovino, que consta de 12 exones y 11 intrones (Figura 2].

Únicas y múltiples polimorfismos de nucleótido

En las especies bovina UCN3 gen, el promotor de una región alberga múltiples polimorfismo de nucleótidos (MPF) y cinco polimorfismos de nucleótido único (SNP), mientras que los exones 1 y 2 contienen dos SNPs y cuatro, respectivamente (Figura 1]. El MPF tiene dos alelos homocigotos de 10 pb y 5 pb, es decir, AAFC03043460.1: g.8272-8281AATAATAAAT> GGAGC. Los restantes once SNPs son AAFC03043460.1: g.8208C> T, g.8265C> T, g.8287T> C, g.8412A> G, g.8426T> A, c.8786C> T, g.9074T> C , C.12609C> T, c.12621T> C, c.12667T> y c.12669C G> A, respectivamente (Figura 1). Entre estos cinco codificación de SNPs, dos (c.12667T> G y c.12669C> A) son mutaciones missense y ambos se producen en un codón (codón 59), el cambio de fenilalanina (TTC) para valina (GTA) en el preprohormone nivel de la UCN3 péptido. Una MPF SNPs y cuatro fueron detectados en la región promotora del gen CRHR2 bovina (Figura 2]. El MPF posee dos alelos homocigotos de AAFC03056271.1: g.33947-33964TGAATCCAGCCTGAGTTG> CTTTGTCTTGAG con 18 pb en un alelo y 12 pb en otros alelo. Cuatro SNP AAFC03056271.1 incluyen: g.33704A> G, g.33803C> T, g.34007C> A y g.34017G> C, respectivamente. No se detectó polimorfismo en el exón 1 región de las especies bovina CRHR2 gen.

Haplotipo análisis y selección de mutaciones de marcado

En las especies bovina UCN3 gen, la secuencia de 6 toros F 1 se indica que cuatro SNP en la región promotora: g.8208C> T, g.8287T> C, g.8412A> G y g.8426T> A formar dos haplotipos: CTAT y TCGA. Dos SNPs en el exón 1 y acompañamiento regiones c.8784C> T y g.9072T> C también aparecen en dos haplotipos: CC y TT en la población, mientras que los cuatro SNPs (c.12609C> T, c.12621T> C, c.12667T> G y c.12669C> A) en el exón 2 de codificación de la región no tienen histórico de recombinación, ya sea en TCGA CTTC o haplotipos. La falta histórica de la recombinación entre SNPs en cada una de estas regiones se ha descrito anteriormente se ve confirmado por el programa en HAPLOVIEW genotipo de datos de todos los F 2 progenie (Figura 1]. Por lo tanto, g.8208C> T, g.8265C> T, g.8272-8281AATAATAAAT> GGAGC, c.8784C> T, y c.12669C> A fueron elegidos como el etiquetado mutaciones para el análisis de asociación. Entre cinco mutaciones en la región promotora del gen bovino CRHR2, HAPLOVIEW indicó AAFC03056271.1: g.33704A> G, g.34007C> A y g.34017G> C-no han histórico de la recombinación formando dos haplotipos del GAC y ACG (Figura 2], y, por tanto, incluidos tres mutaciones AAFC03056271.1: g.33704A> G, g.33803C> T, y g.33947-33964TGAATCCAGCCTGAGTTG> CTTTGTCTTGAG fueron seleccionados como el etiquetado mutaciones para el análisis de asociación.

Asociación análisis de UCN3 y CRHR2 genes con IMCL y SFD

Dos enfoques estadísticos-el modelo lineal general (GLM) y el desequilibrio cuantitativo de transmisión de prueba (QTDT) fueron utilizados para detectar las asociaciones entre los polimorfismos genéticos en ambos UCN3 bovina y CRHR2 genes con IMCL Fondo Social para el Desarrollo y en una población de referencia de Wagyu × Limousin F 2 cruz bovinos (Cuadro 1]. En general, la población de referencia tuvo un promedio de 0,394 SFD pulgadas con una desviación estándar de 0,18 pulgadas. En las especies bovina UCN3 gen, GLM análisis indica una sugestiva asociación entre el genotipo a g.8208C> T y Fondo Social para el Desarrollo (P = 0.0685), mientras que la prueba QTDT indicó una asociación significativa entre el genotipo y el Fondo Social para el Desarrollo (P = 0.0203; Tabla 1]. Los animales con genotipos TT había 0,086 (P = 0.0045) y 0,056 pulgadas (P = 0.0259) menos grasa subcutánea que los animales con CC y genotipos CT, que representan el 0,48 y 0,31 desviaciones estándar para el rasgo, respectivamente (Cuadro 1).

En general, IMCL acumulación, descrito por jaspeado resultados, para todos los F 2 progenie promedio de 5,916 con una desviación estándar de 1 Resultado jaspeado. Es interesante señalar que el genotipo efectos sobre la acumulación IMCL aumentado en importancia con las mutaciones más cerca de las regiones codificantes del gen UCN3 (Cuadro 1]. El 12669C> Un marcador se asoció significativamente con IMCL (P = 0.0369 para el análisis GLM y P = 0.0055 para el QTDT prueba, respectivamente). AA animales fueron mucho más ágil, con 0,549 y 0,340 jaspeado puntuaciones más bajas, respectivamente, a más animales CC (P = 0.0045) y heterocigotos TC (P = 0,0164) (Tabla 1]. Lamentablemente, ninguno de los marcadores en las especies bovina CRHR2 gen se asocia con cualquiera de las dos o IMCL (P> 0.60) (Tabla 1].

Caracterización funcional de promotor y la codificación de polimorfismos asociados a la directiva y IMCL

Como se indicó anteriormente, sólo mutaciones en el gen bovino UCN3 se asociaron significativamente con el rasgo, ya sea en la población de referencia. Por lo tanto, podría ser interesante para caracterizar la forma en que el promotor polimorfismos de regulación transcripcional afectan a sitios de unión y la forma de codificación de polimorfismos tener un impacto en la estructura secundaria del mRNA. En la región promotora del gen bovino UCN3, cuatro polimorfismos, AAFC03043460.1: g.8208C> T, g.8287T> C, g.8412A> G y g.8426T> A formar dos haplotipos: CTAT y TCGA. MatInspector [14] detectó una diferencia notable en el número de posibilidades de regulación transcripcional sitios de unión entre estos haplotipos: diez para la ex haplotipo, mientras que sólo dos de estos últimos haplotipo (Figura 3]. Estos doce transcripcional sitios de unión fueron para TFCP2 (factor de transcripción CP2), NFAT5 (factor nuclear de activar las células T-5, tonicidad-sensible), NKX3-1 (NK3 relacionados con el factor de transcripción, locus 1), FOXD1 (forkhead cuadro D1), BAPX1 (gaita homeobox homólogo 1), ISL1 (ISL1 factor de transcripción, islote-1), PAD (D sitio promotor de la albúmina la proteína de unión), EGR2 (el crecimiento inicial de respuesta 2), CART1 (cartílago de clase en parejas homeoprotein 1), POU4F1 ( POU dominio, la clase 4, factor de transcripción 1), ARID3A (AT interactivo rico dominio 3A) y MSX1 (MSH homeobox homólogo 1) / MSX2 (MSH homeobox homólogo 2), respectivamente (Figura 3].

Cuatro de codificación de SNPs en el exón 2 del gen bovino UCN3: AAFC03043460.1: c.12609C> T, c.12621T> C, c.12667T> G y c.12669C> A también formar dos haplotipos: CTTC o TCGA. Se utilizó el programa Mfold [15] para predecir la forma en que estos dos haplotipos afectar a la estructura secundaria del mRNA. En el primer plazo, una completa secuencia de codificación de 501 pb para el preprohormone se utilizó en el análisis. Las secuencias con ambos haplotipos fueron plegados en Mfold con una forma automatizada a nivel local. La secuencia de codificación completa que contiene CTTC haplotipo arrojado un total de 13 estructuras secundarias, mientras que la secuencia con el haplotipo TCGA producido un total de 16 estructuras secundarias. Sin embargo, existe una diferencia en un solo strandedness cuenta (cuenta-ss) entre dos haplotipos. El SS-cuenta con medir el número de veces que cada nucleótido es unpaired en todas las estructuras secundarias predijo. Para el ex haplotipo, 122 de 501 bp había cero ss-cuenta, mientras que para el segundo haplotipo, 100 de 501 ss había cero-que cuenta en todas las estructuras secundarias predijo (prueba exacta de Fisher, P = 0,0150). En la segunda partida, se seleccionaron 81 pb de secuencia en torno a los SNPs para una más localizada análisis de la estructura. Como se mostró en la Figura 4, ambos haplotipos tenido un fuerte efecto sobre la estructura secundaria de las especies bovina UCN3 mRNA.

Discusión

Hay cuatro paralogous corticotropina hormona liberadora de genes en genomas de mamíferos: corticotropina-la hormona liberadora, urocortin, urocortin 2 y urocortin 3 [16]. En el presente estudio, nos reveló varias características interesantes sobre urocortin 3 en el genoma bovino. En primer lugar, las especies bovina UCN3 gen región parece altamente polimórficos. Hemos diseñado tres pares de cebadores que amplifican un total de 1679 pb. Un total de 12 mutaciones (cada uno aproximadamente 140 pb de secuencia) fueron detectados en esta región. En segundo lugar, un múltiplo polimorfismo se detectó en la región promotora del gen bovino UCN3. Un alelo tiene 10 nucleótidos de AATAATAAAT, mientras que otro tiene sólo cinco nucleótidos de GGAGC. No significativa similitud podría determinarse entre estos dos alelos. En tercer lugar, dos SNPs (c.12667T> G y c.12669C> A) se produjo en un codón (codón 59), dando lugar a un cambio de fenilalanina (TTC) para valina (GTA) en el preprohormone nivel de péptido UCN3. Ambos SNPs sólo forman dos haplotipos-TC y GA, no mostrando histórico recombinación en la población. Por último, HAPLOVIEW análisis reveló que tres regiones amplificadas haplotipo celebrar tres bloques (Figura 1); a pesar de que la región amplificada promotor y el exón 1 región son sólo 147 pb y aparte el exón 1 y el exón 2 regiones son sólo 3209 bp aparte. Estos datos podrían proporcionar una base para una investigación más a fondo sobre la formación y evolución de CRH paralogs en los mamíferos.

Más importante aún, nos dimos cuenta de que el gen UCN3 se asoció significativamente con la acumulación y IMCL Fondo Social para el Desarrollo (Tabla 1]. Sin embargo, cuatro promotor SNPs organizado en dos haplotyes había una fuerte asociación con el Fondo Social para el Desarrollo, mientras que cuatro SNPs que también formaron dos haplotipos en el exón 2 arrojó una fuerte asociación con IMCL acumulación. En el análisis de Fondo Social para el Desarrollo, los animales con genotipos TT de g.8208C> T había 0,086 (P = 0.0045) y 0,056 pulgadas (P = 0.0259) menos grasa subcutánea que los animales con CC y genotipos CT, que representan el 0,48 y 0,31 desviaciones estándar para el rasgo. En el análisis IMCL, AA animales en la posición c.12669C> A había 0,549 y 0,340 jaspeado puntajes más bajos que los animales CC (P = 0.0045) y heterocigotos TC (P = 0,0164). Por otra parte, la AA animales tienden a ser ágil con 0,047 y 0,046 pulgadas menos de SFD en comparación con los CC y CA genotipos (Cuadro 1], que se acercó al nivel de significación (P = 0.0982 para el análisis GLM y P = 0.0522 para QTDT la prueba cuando los valores de P fueron sin corregir). Estos datos indican que el aumento del Fondo Social para el Desarrollo con un polimorfismo promotor no necesariamente como resultado un aumento del IMCL acumulación. Sin embargo, es muy probable que el aumento de IMCL con el exón 2 polimorfismos también estimular la alta acumulación de SFD, y, por tanto, dar lugar a un aumento global de toda la deposición de grasa corporal. Como intramyocellular acumulación de lípidos en el músculo es uno de los principales contribuyentes a la vez la resistencia a la insulina y el conjunto del cuerpo de deposición de grasa, inhibiendo IMCL ganancia debe ser un objetivo a largo plazo para la prevención de la obesidad en humanos.

En el genoma humano, UCN3 se coloca en la posición 5,40 Mb en 10p15.1, donde dos estudios independientes sugirió rasgo cuantitativo loci (QTL) para el índice de masa corporal (IMC) en los indios Pima [17] y en los caucásicos [18]. Curiosamente, ambos grupos utilizan el mismo acompañamiento de los marcadores D10S1435 y D10S189, que abarca de 2,23 a 6,76 Mb Mb en el cromosoma humano 10. Obviamente, la UCN3 gen debe ser un fuerte candidato para el gen humano IMC QTL detectado en la región, como nuestro actual estudio proporcionó evidencia fuerte apoyo a su participación en la regulación de la lipogénesis. En el estudio, hemos desarrollado cinco marcadores genéticos en la región promotora de las especies bovina CRHR2 gen, pero ninguno de ellos se asociaron significativamente con cualquiera de las dos IMCL acumulación o el Fondo Social para el Desarrollo en Wagyu × Limousin F 2 cruz ganado (Cuadro 1].

Esto no era sorprendente, porque ninguna asociación de CRHR2 de genes se ha observado con la obesidad en los seres humanos. Challis y asociados [19] rigurosamente seleccionados 51 niños obesos (índice de masa corporal (IMC)> 4 kg / m 2 desviaciones estándar por encima de la relacionada con la edad media), Reino Unido población caucásica de base para la cohorte de polimorfismos genéticos en el gen humano CRHR2 . En sujetos con extrema temprana aparición de obesidad, tres missense se encontraron mutaciones en CRHR2 (Glu220Asp, Val240Ile y Val411Met). Sin embargo, ninguna de estas mutaciones missense claramente cosegregated con la obesidad en los estudios de la familia. Un común de un solo nucleótido polimorfismo G1047A (Ser349Ser) también fue detectado en CRHR2, pero no se asoció con cualquier relacionadas con la obesidad fenotipo. Los autores concluyeron que las mutaciones en la secuencia de codificación del gen CRHR2 es poco probable que se una monogénicas causa de la aparición temprana de la obesidad. Por lo tanto, los estudios de asociación realizados en el ganado bovino y en humanos no presentó ninguna prueba de apoyo CRHR2 como un blanco potencial para el desarrollo de una antiobesity de drogas, según lo propuesto por Doyon y colegas [9].

La notablemente diferentes patrones de expresión entre UCN3 y CRHR2 genes en el tejido adipocito y músculo esquelético podría proporcionar algunas pistas sobre por qué el primero, no el último gen, se asocia con la directiva y IMCL acumulación observada en el presente estudio. En los humanos tejido graso subcutáneo, expresión cuantitativa análisis reveló que UCN3 mRNA se expresa aproximadamente cuatro veces superior a su receptor, CRHR2 mRNA [8]. UCN3 ARNm se expresa en el músculo esquelético de mamíferos adultos y Xenopus laevis, pero nadie ha detectado cualquier expresión de mRNA CRHR2 en el tejido de cualquier especie [20]. Por lo tanto, la menor expresión o no expresión de mRNA CRHR2 en estos tejidos podría dar lugar a lo limitado de sus efectos sobre la función de la célula grasa y la termogénesis muscular. Por otro lado, la evidencia ha demostrado que UCN3 está directamente involucrado en la regulación de glucagons y la secreción de insulina [21]. La inyección de murino UcnIII sintético en ratas macho aumentó significativamente tanto la sangre y los niveles de insulina. UCN3 también estimulado glucagons liberación de insulina y de los islotes aislados de ratas. En el presente estudio, la alta SFD CTAT haplotipo asociado en la región promotora adquirido 10 nuevos regulador transcripcional sitios de unión en comparación con los demás haplotipo de TCAT en las especies bovina UCN3 gen. Entre estos 10 transcripcional reguladora sitios de unión, tres son para TFCP2 (factor de transcripción CP2), NKX3-1 (NK3 relacionados con el factor de transcripción, locus 1) y NFAT5 (factor nuclear de activar las células T-5, tonicidad de responder). Los estudios han demostrado que estos tres genes que pueden afectar el riesgo de la enfermedad de Alzheimer [22], el cáncer de próstata [23] y la nefropatía diabética [24], las condiciones a menudo asociada con la obesidad. Todos estos datos apoyan claramente que la UCN3 gen desempeña un papel importante en la regulación del metabolismo del adipocito a través de una amplia trayectoria.

En conclusión, se anotaron las especies bovina UCN3 y CRHR2 genes usando un enfoque comparativo y desarrollado un total de 17 marcadores genéticos en ambos genes. Genotipos estos marcadores en Wagyu ~ 250 × Limousin F 2 cruces reveló que las especies bovina UCN3, pero no a su receptor CRHR2 gen, se asoció significativamente con intramyocellular lípidos y la acumulación de grasa subcutánea a fondo en el ganado. El promotor polimorfismos de las especies bovina UCN3 gen altera la transcripción 12 posibles sitios de unión de reglamentación, algunas de las cuales están asociadas con la obesidad relacionados con las condiciones. La codificación de los polimorfismos del gen afecta a la estructura secundaria del ARNm UCN3 notablemente. Por lo tanto, proponemos UCN3 como un firme objetivo para el desarrollo de antiobesity drogas. Sin embargo, la candidatura de CRHR2 con el propósito necesita ser más evaluada.

Los autores agradecemos la asistencia del doctor Michael MacNeil, USDA-ARS, Miles City, MT, en la prestación de ADN y de datos para esta investigación. También damos las gracias al Dr Xio-Lin Wu, de la Universidad de Wisconsin-Madison, por su ayuda en el análisis estadístico.