PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Strong HIV-1-T específicas en las respuestas de células VIH-1-Exposed no infectada Infantes y neonatos después de Revelado de regulación de las células T de eliminación

Biblioteca Pública de la Ciencia
Fatema A. Legrand [1], Douglas F. Nixon [2], Christopher P. Loo [2], Erika Ono [3], Joan M. Chapman [2], Maristela Miyamoto [3], Ricardo Díaz S. [3 ], Amélia MN Santos [3], Regina CM Succi [3], Jacob Abadi [4], Michael G. Rosenberg [4], María Isabel de Moraes-Pinto [3], G. Esper Kallas [3]
[1] Instituto Gladstone de Virología e Inmunología de la Universidad de California San Francisco, San Francisco, California, Estados Unidos de América
[2] División de Medicina Experimental de la Universidad de California San Francisco, San Francisco, California, Estados Unidos de América
[3] Universidad Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil
[4] Jacobi Medical Center, Albert Einstein School of Medicine, del Bronx, Nueva York, Estados Unidos de América
Resumen
Fondo

En el útero la transmisión del VIH-1 se produce por término medio en sólo el 3% -15% de VIH-1 expuestos los recién nacidos que nacen de madres no a la terapia con medicamentos antirretrovirales. Así, a pesar de la exposición potencial, la mayoría de los niños siguen siendo no infectada. La debilidad de VIH-1 específica de células T respuestas se han detectado en los niños expuestos al VIH-1, y potencialmente contribuir a la protección contra la infección. Nosotros, y otros, han demostrado recientemente que la eliminación de CD4 + CD25 + T-reguladoras (TREG) las células pueden revelar fuerte VIH-1 específica de células T respuestas en algunos infectados por VIH-1 adultos. En este sentido, la hipótesis de que las células TREG podría suprimir el VIH-1 respuesta inmunitaria específica a los niños pequeños.

Metodología / Principales conclusiones

Se estudiaron dos cohortes de niños. El primer grupo incluyó por VIH-1-expuestos no infectados (UE), así como no expuestos (UNEX) los recién nacidos. El segundo grupo compuesto infectadas por VIH-1 y HIV-1-UE niños. Hemos cuantificado la frecuencia de células TREG, T-activación de las células, y mediada por células respuesta inmune. Hemos detectado altos niveles de CD4 + CD25 + CD127 - TREG las células y los bajos niveles de CD4 + y CD8 + T activación de las células en la sangre del cordón umbilical de recién nacidos de la UE. Hemos observado por VIH-1 específica de células T en la respuesta inmune de todos los niños expuestos al virus. Estas células T respuestas no fueron vistos en la sangre del cordón umbilical de control del VIH-1 no expuestos los recién nacidos. Por otra parte, el agotamiento de CD4 + CD25 + TREG células de la sangre del cordón umbilical de los recién nacidos UE notablemente aumentada, tanto CD4 + y CD8 + HIV-1 respuesta inmunitaria específica.

Conclusiones / Importancia

Este estudio proporciona nuevas pruebas de que la UE puede montar lactantes fuerte por VIH-1 específica de células T respuestas, y que en el útero CD4 + CD25 + T reguladoras pueden ser las células que contribuyen a la falta de transmisión vertical mediante la reducción de la activación de las células T.

Introducción

La transmisión vertical del VIH-1 puede ocurrir en el útero, durante el parto, o después del parto. En ausencia de profilaxis antirretroviral y no en una población de la lactancia materna, la transmisión en el útero se produce por término medio en sólo 3-15% de VIH-1 en niños expuestos al [1]. Múltiples factores aumentan el riesgo en el útero de la transmisión vertical, e incluir bajo la maternidad de linfocitos CD4 + o contar con una elevada carga viral, parto prematuro, corioamnionitis y [2] - [5]. Curiosamente, a pesar de la posible exposición al VIH-1, incluido el periparto y a través de la lactancia materna, la mayoría de los bebés nacidos de madres no tratadas siguen siendo no infectada. Varios potencial genético, virológica, inmunológica y explicaciones han sido siempre para explicar la falta de transmisión (revisado en [6]], pero ninguno de ellos se han definido claramente como contribuyendo activamente a tasas más bajas de infección por VIH-1 en el recién nacido.

Varias líneas de evidencia demuestran que el VIH-1 específica de CD8 + T cell respuestas contener y reprimir la viremia. Esas respuestas se correlacionan con principios de control de la replicación viral durante la infección primaria [7] - [8], y su pérdida se ha vinculado a la rápida progresión de la enfermedad [9]. En la Macaca mulatta-virus de inmunodeficiencia símico (SIV) modelo, el agotamiento de los linfocitos T CD8 + conduce a un aumento de la replicación viral [10], lo que se invierte con la con la reaparición de SIV específicos de linfocitos T CD8 + [11]. Los altos niveles de anti-VIH-1 CD8 + T cell respuestas han sido relacionadas con la falta de enfermedad a largo plazo no progresa los pacientes [9], [12] - [15]. Por último, en tanto aguda como crónica, VIH-1 infecciones, la aparición de CTL mutantes de escape se destaca la función inmunológica de la presión sobre la replicación viral [7], [16] - [17].

VIH-1 específicos CD8 + T mediada por células cytolysis es detectable en niños infectados [18] - [27], sin embargo, estas respuestas son menos frecuentes y más débiles en magnitud que en los adultos y no siempre aparecen antes de seis meses de edad [ 28]. La edad desempeña un papel importante en la determinación de la calidad de la pandemia del VIH-1 específica de la respuesta inmune celular. En infectadas por VIH-1 los niños menores de cuatro años de edad, linfocitos T CD8 + de secretar IFN-γ en respuesta al VIH-1 péptidos son bajos en la frecuencia y la falta amplitud [27]. Los investigadores han atribuido esto a la falta de eficaces contra el VIH-1 específica de CD4 + T-helper respuestas (anormal se tuerza la diferenciación de células CD4 superior a un Th2: Th1 ratio) y las deficiencias en las células T cebado y funciones efectoras [19], [27 ] - [29].

VIH-1 respuesta inmunitaria específica se han reportado en niños que han estado expuestos al virus todavía no infectada se mantuvo. CD8 + la respuesta inmune al VIH-1 Env, Gag, y las proteínas Nef se han mostrado en la sangre periférica de estos recién nacidos poco después de su nacimiento [19]. Además, el VIH-1 específica de CD8 + IFN-γ respuestas se han detectado en la sangre periférica de 25% de los lactantes expuestos no infectados entre los 15 a 50 meses de edad [23], así como en una pareja no infectada infantil utilizando virus específicos de estimulación [20]. Recientemente, se demostró que en un mes de edad, el 58% de lactantes infectados en el útero y el 29% de los infectados periparto exhibidos por VIH-1 específica la respuesta inmune celular de ELISPOT [28].

La capacidad de los niños pequeños a montar las respuestas de células T ha sido apoyada por algunos estudios recientes que sugieren que los ratones recién nacidos son capaces de generar sólidos CD8 + T cell respuestas [30]. La respuesta de células T son capaces de producir una gama similar de citoquinas y avidities que la de adultos. A raíz de la infección congénita, recién nacidos desarrollar un maduro CD8 + T cell respuesta citomegalovirus humano (HCMV) [31] - [32]. Esta respuesta es similar a la detectada en los adultos y el HCMV específicos de linfocitos T CD8 + expresan un fenotipo maduro de memoria, tienen funciones efectoras antivirales, producción de IFN-γ, y han perforin dependientes actividad citolítica (revisado en [33]]. En un estudio neonatal de sangre del cordón-células T congénita infectadas con el Trypanosoma cruzi, protozoario el agente de la enfermedad de Chagas, se demostró que las células fetales tienen la posibilidad de generar potentes y "adulto-como" CD8 + T cell respuestas [34].

El papel de las células T CD4 ayudar a inducir funcional de células T CD8 respuestas nuevas necesidades de investigación, sin embargo, CD4 + T cell respuestas han sido enumerados en primeras etapas de la vida. Los niños pequeños son capaces de montar maduro de células T CD4 respuestas a Bordetella pertussis vacuna [35], herpes simplex virus de la infección [36], y en el útero a la exposición a antígenos de helmintos [37]. En la infección por HCMV, los niños pequeños maduros desarrollar las células T CD8 respuestas en el contexto de los bajos de células T CD4 la respuesta inmune, mientras que en infección por VIH-1 de células T CD4 ayuda es integral en el control de infección por VIH-1.

A raíz de la hipótesis de que los jóvenes pueden infantil, en algunos casos, montar la respuesta inmune robusto, que tiene por objeto evaluar la resistencia del VIH-1 respuesta inmunitaria específica para todo el tiempo de exposición al virus y el impacto potencial de estas respuestas en materno-infantil de transmisión . La hipótesis de que estas respuestas inmunes pueden ser desenmascarado a la eliminación de los CD4 + CD25 + Tregulatory (TREG) células. Nosotros, y otros, han demostrado que este fenómeno tiene lugar en infectados por VIH-1 los adultos [38]. Se midió el VIH-1 respuesta inmunitaria específica y determina la frecuencia y la supresión de la actividad Tregs en la sangre del cordón umbilical del VIH-1-expuestas no infectadas (UE) recién nacidos, así como en el de sangre periférica infectadas por VIH-1 y de la UE lactantes y niños de corta edad. Hemos detectado por VIH-1 específica de células T en la respuesta inmune de todos los niños expuestos al virus, incluyendo las respuestas vigorosas a la UE niños de dos años después de su nacimiento. Además, el agotamiento de los CD4 + CD25 + TREG células de la sangre del cordón umbilical de recién nacidos UE ampliada, tanto CD4 y CD8 por VIH-1 respuesta inmunitaria específica.

Materiales y Métodos
Las muestras de paciente y mediciones de carga viral

Infectadas por VIH-1 no infectadas y el control de las madres y sus hijos fueron seguidos y tratados en la Universidad Federal de São Paulo hospital (São Paulo, Brasil). Perinatal por VIH-1 infectadas y no infectadas pediátricos expuestos los sujetos fueron seguidos y tratados en el Jacobi Medical Center (Bronx, Nueva York). EDTA tratada con toda la sangre del cordón umbilical y muestras de sangre periférica (2-5 ml) se recogieron en el momento del nacimiento o durante programado visitas mensuales después de obtener el consentimiento informado local basada en la Junta de Revisión Institucional de los protocolos aprobados. Un infante fue clasificada como no infectada si el bebé tiene 2 negativos del VIH-1 DNA resultados el ensayo de PCR en diferentes visitas de 1 mes después de su nacimiento, el segundo después de 4 meses de edad. Los lactantes que no se ajusten a estos criterios fueron clasificados como teniendo un estado de infección indeterminada y se excluyeron de este estudio. Los resultados positivos de VIH-1 DNA ensayo de PCR fueron confirmados por el VIH-1 ensayo de PCR RNA VIH o la cultura. La sangre del cordón umbilical células mononucleares (CBMCs) y PBMCs fueron aisladas de Ficoll-Paque PLUS gradiente de densidad de centrifugación (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y criopreservados. El sesgo de selección se evita el deslumbramiento de muestras de todos los ensayos realizados. Las muestras de paciente fueron seleccionados por tener un celular de viabilidad> 80%. Esas muestras no cumplan con este criterio no fueron ensayados. Todas las muestras ensayadas paciente están representados. Plasma HIV-1 RNA se midió con Amplicor HIV-1 Monitor (versión 1.5) con un límite inferior de cuantificación de 400 copias de RNA / ml (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ). Los niveles absolutos de CD4 + T, las células se determinaron por citometría de flujo con la BD múltiple CD3/CD4/CD8/CD45 Kit de reactivos y analizadas en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

Immunophenotyping

Criopreservados CBMCs y PBMCs fueron descongelado, lavado, y la noche a la mañana incubadas a 37 ° C en el 5% de CO 2. CBMCs y PBMCs (2 × 10 5) se resuspendido en PBS (Media Tech, Herndon, VA) y el 1% BSA (Sigma, St Louis, MO). CBMCs y PBMCs se colorearon de marcadores de activación con cada uno de los siguientes anticuerpos monoclonales (BD Biosciences): PerCP-CD3, CD4-allophycocyanin (APC), HLA-DR-FITC, y QuantiBRITE CD38-PE. CBMCs y PBMCs También se tiñen de TREG marcadores fenotípicos con cada uno de los siguientes anticuerpos monoclonales (BD Biosciences): CD3-PE-Cy7, CD4-allophycocyanin-Cy7 (APC-Cy7), APC-CD25, CD127-PE (Beckman Coulter Biosciences ), Y CD45RA-PE-Cy5. Las células fueron incubadas durante 30 min a 4 ° C, lavado, y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur, de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Calibrada QuantiBRITE bolas fluorescentes se utilizaron para construir una curva estándar para la cuantificación de CD38. FlowJo software (TreeStar, Ashland, OR) fue empleado para convertir la muestra mide la intensidad media de fluorescencia de anticuerpos obligado por célula (ABC).

El agotamiento de CD4 + CD25 + Células TREG

CD4 + CD25 + TREG células fueron purificadas con MACS CD25 microbolas (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). En pocas palabras, CBMCs y PBMCs se lavaron dos veces en PBS que contenía 0,5% BSA y 2 mM EDTA, resuspendido en PBS que contenía 0,5% BSA, 2 mM EDTA y 20 μ l de Mac CD25 microbolas por 10 7 CBMC total o PBMC, y se incubarán durante 15 minutos a los 6 hasta los 12 ° C. CBMCs y PBMCs se lavaron dos veces en PBS que contenía 0,5% BSA y 2 mM EDTA y aplicado a una columna magnetico en una unidad de separación MiniMACS (Miltenyi Biotec). - CD25 y CD25 que contienen-agotadas las células T fracciones fueron recogidos. El CD25-que contengan fracción de células que figuran 90% CD4 + T cells.

Citometría de flujo de citocinas

Criopreservados CBMCs y PBMCs fueron descongelados, lavarse en RPMI-1640 medio (Media Tech), complementado con un 15% de SFB (Géminis, Woodland, CA) y se incubaron durante la noche a 37 ° C en el 5% de CO 2. VIH-1 respuestas concretas se determinarán mediante el uso de piscinas de la superposición de VIH-1 clade B 15-mer péptidos que abarca el Gag (123 péptidos, BD Biosciences) y Nef regiones (49 péptidos; investigación sobre el SIDA y de reactivos de referencia del Programa, NIAID, NIH). Staphylococcus enterotoxina B (SEB, 5 μ g / ml; Sigma) sirvió como control positivo de antígenos. En resumen, 2 × 10 5 CBMCs y PBMCs se resuspendido en RPMI-15% de SFB y se incubaron con cada péptido piscina (5 μ g / ml para cada péptido) a 37 ° C en el 5% de CO 2 durante 18 h. Brefeldin A (10 μ g / ml; Sigma) se añadió, y las células fueron incubadas por un período adicional de 5 horas a 37 ° C en el 5% de CO 2. Las células fueron lavadas en PBS con 0,02% y EDTA 1% BSA y transferido a un 96-V-así placa inferior, y permeabilized con un 0,1% saponina solución, y de superficie manchada con los siguientes anticuerpos monoclonales (BD Biosciences): CD3 - PerCP, CD4-APC-Cy7, IL-2-PE, TNF-α-APC, y IFN-γ-PE-Cy7 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Por último, las células fueron lavadas, fijado con un 1% de paraformaldehído, y analizar en un FACSCanto o LSRII citómetro de flujo (BD Biosciences). Los datos fueron analizados con FlowJo software. Las muestras fueron cerrada en CD3 + CD4 + o CD4 + CD3 - (CD8 +) y linfocitos analizados para IL-2, TNF-α y IFN-γ expresión (Figura 1]. Los resultados se expresaron como el porcentaje de CD4 + CD3 + o CD4 + CD3 - (CD8 +) que expresan IL-2, TNF-α y IFN-γ. VIH-respuestas concretas se considera positiva cuando la respuesta fue de 2 SD por encima de la media de fondo de todas las piscinas péptido, el valor de corte fue 0,13% IFN-γ-CD3 + que producen las células T.

Microchimerism de ensayo

Se investigaron la presencia de células madres a cada niño la circulación utilizando un PCR múltiplex para cuatro Short Tandem Repite loci (SVA, D8S1179, TPOX, FGA) y una identificación de sexo marcador (Amelogenin locus) discriminado por los fragmentos de análisis. La sensibilidad del método incluye la detección de un 1% de mezcla de ADN de diferentes personas (datos no presentados). Los resultados mostraron diferentes materna e infantil como los perfiles no hemos podido encontrar pruebas de células microchimerism en los niños muestras.

El análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism (4,0 liberación, GraphPad Software, San Diego, CA). Las comparaciones de los parámetros inmunes se realizaron mediante métodos no paramétrico, el de Mann-Whitney test para muestras independientes y acompañada de pares de Wilcoxon test para muestras apareadas. Las diferencias se consideraron significativas si p <0,05.

Resultados
Temas

Nuestro objetivo fue medir el VIH-1-T específicas de la respuesta inmune celular en el momento del parto y durante el primer año de vida. Por otra parte, hemos querido establecer si esas respuestas fueron sostenidas y si TREG células reprimidas virus respuestas concretas a una edad dependientes. Se evaluó neonatal muestras de sangre del cordón de una cohorte de niños en Sao Paulo, Brasil. Se realizó un estudio retrospectivo criopreservados utilizando muestras de sangre de cordón de seis VIH-1-UE (UE-CB) y cuatro no expuestos los recién nacidos (CB-UNEX). Todas las madres recibieron atención prenatal y todos infectadas por VIH-1 las madres se pusieron en triple terapia antirretroviral durante el embarazo (Tabla 1]. Cinco de los 6 madres habían plasma HIV-1 RNA niveles por debajo de 400 copias / ml en el último mes de embarazo; el sexto madre tenía una carga viral de 3,64 log copias / mL.

Además, se examinaron muestras de sangre periférica de los niños pequeños en el primer año de vida, así como un momento posterior de punto. Estos niños fueron seguidos en el Jacobi Medical Center en el Bronx, NY. Se analizaron criopreservados de sangre periférica de células mononucleares de cinco infectadas por VIH-1 (PB-INF-7mo; edad media 7,4 meses) y nueve lactantes UE (UE-PB-7mo; edad media 6,5 meses), así como cinco por VIH-1 infectados (PB-INF-25mo; edad media 24,8 meses) y siete niños pequeños UE (UE-PB-20mo; edad mediana 20 meses; Cuadro 2]. Todos los infectados por VIH-1 madres tratadas en el Jacobi Medical Center recibieron atención prenatal y fueron en triple terapia antirretroviral durante el embarazo. La carga viral materna no estaban disponibles para la cohorte Jacobi.

Los niveles más elevados de CD4 + CD25 + CD127 - TREG neonatal en las células de sangre de cordón

La actual definición fenotípica de las células TREG se basa principalmente en la expresión de CD4 y CD25, así como la expresión selectiva del factor de transcripción Foxp3 [39] - [41]. En el momento de este estudio FoxP3 un anticuerpo humano para citometría de flujo no estaba disponible. Sin embargo, investigaciones recientes han demostrado que CD127 expresión es inversamente correlacionada con FoxP3 expresión y función de supresión de las células humanas TREG [42] - [43]. CD127 es parte de la heterodimeric IL-7 receptor que juega un papel importante en la proliferación y diferenciación de células T maduras, y los experimentos in vitro demuestran que la expresión de CD127 es el siguiente reguladas activación de las células T [44]. Por lo tanto cuantificado la frecuencia de células TREG mediante la utilización de una combinación de moléculas de superficie celular CD4, CD25 y CD127. El uso de la citometría de flujo, que hemos detectado el más alto nivel de CD4 + CD25 + CD127 - TREG células en la sangre del cordón umbilical de recién nacidos UE (1,55%, Mann-Whitney test; Cuadro 2] en comparación con los recién nacidos no expuestos (0,62%, p = 0.0947) y infectadas por VIH-1 (0,16%, p = 0.0193) y de la UE lactantes (0,27%, p = 0,0062).

Disminución en los niveles de activación por VIH-1-expuestas no infectadas neonatal de sangre de cordón

T-activación de las células en infectadas por VIH-1 individuos se midió con los marcadores HLA-DR y CD38 en linfocitos CD4 + y CD8 + T cells. Como era de esperar, CD4 + y CD8 + activación de los niveles más altos en infectadas por VIH-1 lactantes (Mann-Whitney test, p = 0.0732; Cuadro 3]. T-activación de las células como los niveles medidos por el porcentaje de células que expresan tanto HLA-DR y CD38 no difirió significativamente en la UE o sin impresionar neonatal muestras de sangre de cordón (Mann-Whitney test, p = 0.9015 y p = 0.8048, respectivamente).

VIH-1 específica de la respuesta inmune en los expuestos no infectados de recién nacidos y los lactantes

Hemos medido por VIH-1 específica superantigen así como una respuesta inmunitaria específica en la UE sin impresionar y neonatal de sangre de cordón, el VIH-1-UE lactantes y niños de corta edad, así como infectadas por VIH-1 lactantes y niños de corta edad. A medida que fueron limitadas por el número de células, hemos elegido la más inmunogénica proteínas Gag y Nef. Hemos seleccionado una estructurales VIH (Gag) y uno no estructurales de proteínas (Nef) para nuestros ensayos inmunológicos. Como se trataba de un estudio retrospectivo, sólo dos infantes expuestos no infectados (PB-UE-2 y PB-UE-5) se han seguido en las dos primeras, así como una hora tarde. En total, 9 infantes no infectados expuestos fueron analizados en una primera vez el punto (7 meses de edad) y 7 lactantes expuestos no infectados en un momento posterior el punto (20 meses de edad). La fuerza de los CD4 + y CD8 + de células T mediada por la respuesta inmune al VIH-1 Gag y proteínas Nef se mide por la producción de citoquinas intracelulares usando citometría de flujo. Hemos utilizado las piscinas de 15-mer superposición de péptidos para medir la producción de IFN-γ en la sangre del cordón umbilical y sangre periférica de células mononucleares.

Significativo IFN-γ la producción de linfocitos T CD8 + en respuesta a las Gag y Nef péptido piscinas se detectó en la UE recién nacidos, lactantes y niños de corta edad, así como infectados lactantes y niños de corta edad (Figura 2A, 2B]. Curiosamente, ambos Gag y Nef específicos CD8 + T cell IFN-γ respuestas fueron sostenidos en la mayoría de los niños no infectados expuestos hasta bien entrado el segundo año de vida, y la fuerza de estas respuestas es comparable a emparejados por edad infectadas por VIH-1 jóvenes niños pequeños. Por otra parte, la magnitud de IFN-γ la respuesta inmune en la sangre del cordón umbilical UE fue mayor que en la sangre periférica. Sustancial a la producción de citocinas el VIH-1 antígenos no era evidente en el control sin impresionar por la sangre del cordón umbilical o bien CD4 + o linfocitos T CD8 + (datos no presentados y Fig. 2, respectivamente). Todos los grupos, incluidos los recién nacidos sin impresionar, suscitó una fuerte CD8 + T cell IFN-γ respuesta a Staphylococcus enterotoxina B (SEB) (Figura 2C].

Polyfunctional Gag-CD8 + específicas de células T en la respuesta inmune expuestos-no infectada niños pequeños

La presencia de células de secretar IL-2, IFN-γ y TNF-α se ha relacionado con la falta de progresión de la enfermedad en humanos a largo plazo no progressors (LTNPs) [45]. VIH-1 específica de linfocitos T CD8 + que producir simultáneamente dos IFN-γ y TNF-α a la estimulación se han correlacionado con la actividad citolítica [46]. Hemos detectado doble IFN-γ y TNF-α la secreción de citoquinas en la sangre del cordón umbilical de recién nacidos UE, así como en infectadas por VIH-1 niños de corta edad (Figura 3A]. IFN-γ / IL-2-secretora de linfocitos T CD8 + se ha demostrado que promover CD8 + T proliferación celular a través de la secreción de IL-2, incluso en ausencia de Ag-específica de ayuda CD4 + células T [47]. Estos polyfunctional IFN-γ / IL-2 CD8 + T de la respuesta inmune celular se detectaron en la sangre del cordón umbilical de recién nacidos y la UE en la sangre periférica de la UE, así como infectados por VIH-1 los lactantes y los niños (Figura 3B]. IFN-γ / IL-2 respuestas CD8 + aumentaron significativamente en el segundo año de vida, tanto en el VIH-1 y UE-infectadas por VIH-1 los niños pequeños. (Wilcoxon corresponde par-test, p = 0.0115 y p = 0.0303, respectivamente) (Figura 3B].

Aumentada Gag CD8 + IFN-γ y CD4 + IL-2 la respuesta inmune en los expuestos no infectados-neonatal de sangre de cordón a la eliminación de las células TREG

A continuación, pretendemos determinar la supresión de la actividad TREG células en la sangre del cordón umbilical del VIH-1-UE recién nacidos y en la sangre periférica del VIH-1 y UE-infectados lactantes y niños pequeños. Las células fueron contados antes de que el agotamiento y, a continuación, los CD4 + CD25 + TREG células fueron agotadas. El TREG agotado PBMCs se relató entonces y 2 × 10 5 células se analizaron para la respuesta inmune. El agotamiento de los CD4 + CD25 + células T significativamente aumentada Gag-CD8 + específicas de células T respuestas de la sangre del cordón umbilical de recién nacidos UE (Figura 4A], el aumento de hasta 3,37 veces (p = 0,0152). En el paciente 30, los CD8 + T de células IFN-γ respuesta es particularmente robusto, llegando a 2,59% a CD4 + CD25 + células T agotamiento (Figura 4B].

También mide CD4 + T cell respuestas al VIH-1 péptidos en presencia y en ausencia de células TREG. Significativo IL-2 (Mann-Whitney test, p = 0.0158, Figura 5A] la producción de citoquinas por CD4 + células T en respuesta a las Gag péptidos fueron observados en la UE neonatal sangre del cordón umbilical en comparación con la sangre del cordón umbilical sin impresionar. Por otra parte, tras el agotamiento de CD4 + CD25 + TREG células, IL-2 respuestas a Gag se aumentaron significativamente, con un incremento del máximo de 2,87 veces (Wilcoxon corresponde par-test, p = 0,0411). En una Unión Europea recién nacido (paciente 63), CD4 + IL-2 la producción en respuesta al VIH-1 antígenos en todo el cordón de células mononucleares de sangre población, así como en CD25-agotadas las células de sangre de cordón fue sorprendente, con respuestas llegar a 5,77% después de CD25 - agotamiento (Figura 5B]. No significativa a la producción de citocinas el VIH-1 antígenos de células CD4 + o linfocitos T CD8 + se puso de manifiesto en su conjunto sin impresionar control o CD25-agotado la sangre del cordón umbilical. En general, tanto CD8 + IFN-γ y CD4 + IL-2 respuestas inmunes fueron menores en la sangre periférica que en la sangre del cordón umbilical. En la sangre periférica, el agotamiento de CD4 + CD25 + TREG células no inciden significativamente en la magnitud de los CD4 + o CD8 + T cell respuesta inmune, ya sea en el VIH-1-UE o infectadas por VIH-1 los lactantes y los niños.

Discusión

Hemos detectado fuerte, sostenido por VIH-1 respuesta inmunitaria específica para la UE en los recién nacidos, lactantes y niños pequeños de hasta dos años de edad. A diferencia de grupos anteriores, se evaluó el VIH-1 respuesta inmunitaria específica en neonatos nacidos de mujeres que reciben lo que ahora se considera adecuado para la atención prenatal infectadas por VIH-1 las mujeres embarazadas, que incluye la terapia antirretroviral para alcanzar cargas virales indetectables antes de la entrega y la prestación de cesárea electiva entrega independiente de los niveles de carga viral [4]. Algunos estudios la medición de respuestas de VIH-1 en niños expuestos se llevaron a cabo con anterioridad a la utilización generalizada de TARGA en mujeres embarazadas como medio para prevenir la madre al hijo [19] - [20], [22] - [23]. Por lo tanto, es probable que estos niños estuvieron expuestos a altos niveles de viremia materna. Nuestros datos apoyan la idea de que en el útero de exposición al VIH-1 o sus productos induce viral VIH-1 específica mediada por células, incluso las respuestas inmunes en la fijación de baja la carga viral materna y lo hace dentro de un entorno de un bajo nivel de activación inmune . Por otra parte, estas respuestas pueden persistir al menos hasta bien entrado el segundo año de vida.

La magnitud de estos por VIH-1 específica de memoria las respuestas de células T en ausencia de infección productiva es sorprendente. Es posible los niños están expuestos a grandes cantidades de la no infecciosa del VIH-1 partículas en el útero, o, alternativamente, los linfocitos infectados por la madre o activar células presentadoras de antígenos pueden tener microtransfused a través de la placenta, estimulando el sistema inmune fetal. Sin embargo, no detectó ninguna madre derivadas de células mononucleares en la neonatal muestras de sangre de cordón. Aunque la sensibilidad de este método es de aproximadamente el 1%, no podemos excluir la posibilidad de la presencia de células madres en compartimentos distintos de la sangre. Aunque muy poco probable [48], tampoco podemos descartar la hipótesis de que el feto de una vacuna contra el VIH-1 positivos madre puede llegar a ser transitoriamente con infección por VIH-1 y borra eficazmente el virus antes de su nacimiento. Por otra parte, postula que la prolongada bajo nivel de antígeno en el útero de exposición durante la gestación puede permitir la diferenciación de las células de memoria sin una transición completa a través de un efector fase. Tal vez, los bajos niveles de antígeno en la cima de la respuesta desencadenar un nivel nominal de activación para permitir la proliferación sin la inducción completa de funciones efectoras, lo que a su vez favorecer el desarrollo de los precursores de larga vida de memoria T-células.

Infección por VIH-1 se asocia con CD4 + T cell pérdida progresiva y disfunción inmune, dando lugar a problemas de VIH-1 respuestas poco después de la infección. Ha sido la hipótesis de que la base para la pronta disminución de las respuestas al VIH-1 se refiere a la actividad de las células TREG. Una teoría es que las células TREG influencia infección por VIH-1 de forma selectiva la inducción de antígenos específicos de represión en una etapa temprana de la infección, lo que a su vez impiden la adaptación de respuesta de células T contra el virus y tal vez la libre antígenos y / u otros agentes patógenos. Esa supresión del VIH-1 de células T específicas de las respuestas de las células TREG ha informado a crónicamente infectadas por VIH-1 los adultos [38]. Por otra parte, se ha propuesto que Tregs puede ayudar a combatir el VIH-1 la enfermedad a través de la supresión de CD4 + T activación de las células. Oswald-Richter et al. TREG mostró que las células se agotan en etapas posteriores de la infección por el VIH, que se correlacionaban con la mayor células T activadas, y por lo tanto, propone que TREG células podría ayudar a reducir la carga viral de la supresión de la activación de las células T [49]. Esto puede efectivamente reducir el índice de VIH-1 disminuye la replicación de la piscina dispone de CD4 + activan las células diana [49] - [50]. En su apoyo, se ha demostrado que los sanos infectadas por VIH-1 individuos tienen un alto TREG frecuencias [51]. Por otra parte, los pacientes con Tregs exhibiendo fuertes ex vivo de células T represión han significativamente más bajos niveles de viremia plasmática y el aumento de CD4 + a CD8 + T cell ratios que los pacientes sin actividad de células TREG [50].

TREG células han demostrado poseer una edad que dependen de la pérdida de supresión de la actividad, donde TREG células son más altos los niveles de principios de la vida en gestación y disminuir con la edad [52]. Un número cada vez mayor de circulante fetal TREG células han demostrado durante las primeras etapas del embarazo, en horas pico durante el segundo trimestre y, a continuación, la disminución de posparto [53]. En la sangre del cordón umbilical de recién nacidos UE, hemos observado los niveles más altos de TREG células y los niveles más bajos de T-activación de las células. Por otra parte, exhibió CBMCs plena capacidad funcional incluyendo polyfunctional IFN-γ y TNF-α y IFN-γ / IL-2 CD8 + la respuesta inmune (Figura 3]. Similares respuestas no se detectaron en PBMCs infantil y sólo surgió en el segundo año de vida. Tenemos que afirmar, en el útero, TREG células tienen un papel importante en la disminución de los niveles de activación, y en un entorno de baja activación, polyfunctional por VIH-1 respuesta inmunitaria específica, aunque menor debido a TREG actividad, son suficientes para subvertir la transmisión vertical. Tras el período neonatal, en la que TREG disminución de las células naturalmente, el residual TREG células en la UE infantil puede jugar un papel mínimo en la reducción de los niveles de activación y en la represión de la respuesta inmune. Sólo con el tiempo, como la infantil el sistema inmunológico de madura, ¿polyfunctional la respuesta inmune reemerge. Alternativamente, puede ser la hipótesis de que las células TREG supresión del VIH-1 específica de las células T, en lugar de la presencia de dichas respuestas, pueden impedir la activación inmune y la susceptibilidad a la transmisión del VIH.

Se midió significativamente menor por VIH-1 respuesta inmunitaria específica en la sangre periférica que en la sangre del cordón neonatal. Esto puede ser un reflejo del hecho de que estas se tomen las muestras más tarde después de que el VIH-1 la exposición, donde la frecuencia de distribución de células efectoras de memoria, naturalmente, ha disminuido. Se puede seguir conjectured que la presentación de antígenos y activan las células maduras microtransfused materna a través de la placenta puede contribuir a la activación y el aumento de la respuesta inmune en el útero. Considerando que el posparto, en el primer año de vida, presentación de antígenos por el infante inmaduro sistema inmunológico es incapaz de inducir fuertes polyfunctional la respuesta inmune.

En general, hay un número limitado de la respuesta inmune neonatal estudios en humanos recién nacidos y los lactantes, sin embargo, se cree que cualitativa y cuantitativa diferencias cuando se compara con la respuesta inmune de adultos existen. El dogma en inmunología neonatal ha sido que los recién nacidos tienen un sistema inmunológico incompetente, el desarrollo sólo débiles o incluso tolerogenic respuestas (revisado en [33]]. Varias líneas de evidencia, incluido el nuestro, sugieren que este concepto tiene que ser reconsiderada. Pareja respuestas a determinadas vacunas y agentes patógenos infecciosos se han observado durante el período postnatal, e incluso durante la vida fetal (revisado en [33]]. Es evidente que una serie diversa de la respuesta inmune celular puede ser desarrollado a principios de la vida, y estas células pueden ser capaces de combatir de manera eficaz y clara los agentes patógenos como el VIH-1. Estas respuestas no obstante pueden ser enmascaradas ni ocultas por la presencia de antígeno-específicos supresor de las células, como células TREG u otras aún no identificadas como las poblaciones de células.

En resumen, nuestros datos muestran la fuerte presencia de VIH-1 específica de células T en las respuestas de la sangre del cordón umbilical y en la sangre periférica de los expuestos no infectados de recién nacidos y lactantes, respectivamente. La magnitud de la respuesta inmune es más alta en la sangre del cordón umbilical y la más baja en la sangre periférica. ¿Qué papel estas células pueden desempeñar en la protección de y / o liquidación de transmisión vertical del VIH-1 es todavía la infección no se conoce. En la sangre del cordón umbilical, CD4 + CD25 + TREG células reducir significativamente los niveles de activación y puede proporcionar un mecanismo para impedir la transmisión vertical. La caracterización de estos por VIH-1 específica de células T respuestas tendrá importantes implicaciones para la comprensión materna y fetal inmunidad contra el VIH-1 durante el embarazo y el trabajo de parto y neonatal desarrollo de una vacuna.

La investigación sobre el SIDA y de reactivos de referencia del Programa, NIAID, NIH generosamente donado péptidos. Estamos agradecidos por la experiencia técnica proporcionada por el Departamento de Servicios Sociales y K. Rodrigues Carvalho Salmazi. Damos las gracias a Jennifer Snyder-Cappione útil para los debates.