PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Triosa fosfato isomerasa deficiencia es causada por la dimerización alterados-no-la falta de actividad catalítica de los enzimas mutantes

Biblioteca Pública de la Ciencia
Markus Ralser [1], Gino Heeren [2], Michael Breitenbach [2], Hans Lehrach [1], Sylvia Krobitsch [1]
[1] Berlin, Alemania
[2] Salzburgo, Austria
Resumen

Triosephosphate isomerasa (TPI) es una enfermedad autosómica recesiva causada por diferentes mutaciones en el gen que codifica la enzima clave glicolítico TPI. Una caída drástica en la actividad de TPI y un aumento del nivel de su sustrato, dihydroxyacetone fosfato, se han medido en unpurified extractos de células de los individuos afectados. Estas observaciones permitieron concluir que las diferentes mutaciones en los alelos TPI resultado en catalíticamente inactiva las enzimas. Sin embargo, a pesar de una alta ocurrencia de TPI nulo dentro de varios alelos poblaciones humanas, la frecuencia de este trastorno es excepcionalmente raros. Para hacer frente a esta aparente discrepancia, hemos generado una levadura modelo que nos permite realizar comparativas en vivo de los análisis enzimáticos y propiedades funcionales de las diferentes variantes de la enzima. Hemos descubierto que la mayoría de estas variantes no exposición reducida actividad catalítica per se. En lugar de ello, observó, la dimerización de comportamiento de TPI se ve influida por las mutaciones particulares investigados, y por el uso de una alternativa potencial para la traducción del sitio de iniciación a la TPI de genes. Además, hemos demostrado que la sobreexpresión de los más frecuentes TPI variante, Glu104Asp, que muestra alterado la dimerización de las características, los resultados en disminución de los niveles endógenos TPI en células de mamífero. Por lo tanto, nuestros resultados ponen de manifiesto que la desregulación enzima atribuibles a aberrantes de la dimerización de TPI, en lugar de directa catalítico inactivación de la enzima, la base de la patogénesis de la deficiencia de TPI. Por último, descubrimos que las células de levadura TPI expresar una variante que exhiben actividad catalítica reducido son más resistentes contra el estrés oxidativo causado por el tiol-oxidantes reactivos diamide. Esta ventaja observada podría servir para explicar la alta frecuencia alélica de alelos null TPI detectado entre las poblaciones humanas.

Introducción

Triosephosphate isomerasa deficiencia ha sido descrita inicialmente en 1965 [1]. Se trata de un único glicolítico enzymopathy con herencia autosómica recesiva que se caracteriza por una anemia hemolítica crónica, cardiomiopatía, la susceptibilidad a las infecciones, disfunción neurológica grave, y, en la mayoría de los casos, la muerte en la primera infancia [2]. Trece diferentes mutaciones en el gen respectivo, que está ubicado en el cromosoma 12p13 y codifica la enzima ubicua limpieza triosephosphate isomerasa (TPI), se han descubierto hasta la fecha [2], [3]. TPI es un elemento crucial y glicolítico enzima cataliza la interconversión de dihydroxyacetone fosfato (DHAP) y glyceraldehyde-3-fosfato. Una marcada disminución en la actividad TPI y una acumulación de DHAP se han detectado en extractos de eritrocitos homocigotos y heterocigotos compuestos TPI deficiencia de los pacientes. Sorprendentemente, los individuos heterocigotos son clínicamente no afectados, aunque su actividad residual de TPI se reduce a alrededor del 50% en comparación con la actividad normal [2], [4], [5]. Por otra parte, la frecuencia de heterocigotos no afecta a las personas en todas las poblaciones humanas investigado es significativamente más alto que el esperado de la rara incidencia de homocigotos o heterocigotos compuestos TPI deficiencia de los pacientes [5] - [9]. Curiosamente, los ratones, se demostró que las mutaciones lo que catalíticamente inactiva TPI variantes (alelos null) llevó a prenatal temprano de letalidad en los homocigotos estado, una incidencia que pudiera surgir también en los seres humanos [7], [10] - [12].

Análisis bioinformáticas han predicho que el ser humano mutaciones patógenas, que no se limitan a un determinado dominio o región dentro de la enzima, podría afectar el sitio de unión del substrato o la dimerización de la interfaz de TPI [2], [13]. El más prominente missense mutación detectada en los pacientes deficiencia de TPI se produce en el codón 104 en el gen que codifica TPI ácido aspártico en lugar de ácido glutámico dentro de la enzima (Glu104Asp variante) y representa aproximadamente el 80% de los alelos mutantes en el norte de Europa kindreds con deficiencia clínica TPI [ 14], [15]. Sorprendentemente, esta variante es el único que se observó entre los homocigotos TPI deficiencia de los pacientes. Otros intercambios de aminoácidos en la proteína TPI, como Cys41Tyr y Ile170Val, se han previsto para interferir con el sustrato de carácter vinculante y la dimerización sitio posiblemente afectan a la actividad catalítica además de la estabilidad molecular de TPI, ambas variantes patógenas TPI se han identificado en no vinculados Europea kindreds [2], [13], [15]. Por otra parte, otras mutaciones missense como una mutación en el codón 240 TPI en el gen que codifica la leucina en lugar de fenilalanina dentro de la enzima (Phe240Leu variante) podría tener un efecto en el sitio de unión del substrato. Otras mutaciones, por ejemplo, las variantes patógenas TPI Gly122Arg o Val154Met no puede ser asignado a determinados dominios. Sin embargo, Perry y Mohrenweiser puso de manifiesto que la variante Gly122Arg TPI, que se identificó como una variante de electromorphic cribado 3400 personas en una población caucásica, es una enzima posiblemente thermolabile indicando impropio plegable [14], [16]. Por otra parte, un codón de inicio mutación ha sido identificada en una familia francesa (Met1_AAG mutación, TPI París), así como un marco de cambio mutación en el codón 28 o mutaciones en la región río arriba del gen TPI [3], [17].

Hasta la fecha, la mejor estudiados familia afectada con la deficiencia de TPI es una familia húngara en la que dos germinal idénticos heterocigotos compuestos hermanos han heredado una mutación missense en el codón 240 de codificación de la variante Phe240Leu TPI y un disparate mutación en el codón 145 (Glu145TER) líder a una proteína truncada TPI [18], [19]. Es interesante señalar que estos hermanos están sufriendo de una forma atípica moderada deficiencia de TPI, aunque ambos tienen una muy reducida actividad de TPI, con menos del 5% de actividad enzimática normal y un nivel especialmente elevado de celulares DHAP. Sorprendentemente, sólo uno de los hermanos ha desarrollado síntomas neurológicos que indican que las dos mutaciones por sí sola no puede explicar la diferencia en los síntomas clínicos [18], [19]. Con el fin de conocer los procesos moleculares de causar los distintos fenotipos de los dos hermanos, se han realizado estudios que demuestran las variaciones en los niveles de antioxidantes [20], en la actividad de linfocitos TPI [19], en glóbulos rojos y la fluidez de membrana enzima actividades y en la composición molecular de fosfolípido subclases entre los dos hermanos [21], [22]. Por otra parte, se ha descubierto que la variante Phe240Leu TPI se une con mayor afinidad a una aún no identificada componente de los glóbulos rojos y para la membrana microtúbulos en comparación con los de tipo salvaje TPI, dando lugar a la suposición de que este proceso podría contribuir a la extremadamente baja TPI actividad de la enfermedad en estado [23].

De acuerdo con la mencionada información, es bastante obvio que además el análisis funcional de las diferentes variantes TPI es obligatorio para comprender los mecanismos moleculares que subyacen en la patogénesis del TPI deficiencia.

Métodos
Plásmido construcción y mutagénesis

Se utilizó el cDNA clones pOTB7-MGC14348 (IRALp962K2120 (RZPD); número BC007812) y el plásmido pACT2-NTint5, que fue aislado de un cerebro humano fetal biblioteca de cDNA (Clontech) para la generación de los diferentes TPI expresión plásmidos se describe en este estudio . Constructores de la codificación TPI variantes Met1_AAG TPI (TPI París) o TPI Phe240Leu, respectivamente, fueron producidos por PCR utilizando oligonucleótidos introducción de las respectivas mutación, tal como se indica en la información de apoyo. Para construir la expresión de codificación de los plásmidos TPI variantes Cys41Tyr, Glu104Asp, Gly122Arg y Ile170Val, las diversas mutaciones se introdujeron a través de PCR usando los respectivos pares de oligonucleótidos, que se superponen en el 5 'a 3' dirección, así como en 3 'a 5' dirección. A continuación, los dos fragmentos resultantes de PCR se utilizaron como las plantillas de ADN, para una posterior aplicación de PCR oligonucleótidos diseñados para la amplificación de la secuencia de codificación completa de TPI (por favor refiérase a la información de apoyo para las secuencias de ADN). Posteriormente, los fragmentos de ADN se purificaron y subcloned en el Bam HI y Xho I sitios de la expresión centroméricas p416GPD vector (número de genes DQ269148, [24]] o en el Bam HI y Xho I sitios de la copia de alta expresión vector p426GPD , Respectivamente (DQ019861, [24]].

Para los dirigidos por levaduras de dos híbridos de análisis, generamos las respectivas carnadas y presa de codificación construye los diversos serie LEXA-TPI o AD-TPI proteínas de fusión de ligar los diferentes fragmentos de ADN amplificado por PCR en la Sal y yo no me los sitios de cebo plásmido pBTM117c o la presa plásmido pACT4-1b.

Para crear la expresión de mamíferos plásmidos codificar una N-terminal del fragmento de TPI humanos fundido a la proteína verde fluorescente (GFP), los primeros 200 pb del TPI de codificación de secuencias fueron amplificados a través de PCR utilizando el par de oligonucleótidos TPI-pEGFPN1-s-y Sal1 TPI-pEGFPN1-como-BamH1, TPI Met1_AAG-pEGFPN1-s-Sal1 y TPI-pEGFPN1-como-BamH1 para la introducción de una mutación en el codón de inicio o TPI Ser3_TER-pEGFPN1-s-Sal1 y TPI-pEGFPN1-como-para BamH1 la introducción de un codón de parada artificial. Posteriormente, los fragmentos de PCR fueron purificados y subcloned en la Sal I y Bam HI sitios de la expresión del vector pEGFP-N1 (Clontech, U55762).

La expresión de mamíferos plásmidos PTL-Bandera-TPI-PTL y WT-Bandera-TPI-Glu104Asp fueron generados por el correspondiente subcloning fragmentos de ADN de pacto-TPI-WT o pacto-TPI-Glu104Asp en el Xho I / No me sitios del vector PTL-FlagC, respectivamente. PCR se realizó en las condiciones descritas anteriormente [25] y todos los productos resultantes fueron verificadas por la secuencia.

Y cepas de levadura de cultivo

Wild cepas de tipo BY4741 (MAT his3 un 1 leu2 Δ Δ 0 met15 Δ 0 ura3 Δ 0) [26] y L40ccua (MAT una his3 Δ 200 trp1-901 leu2-3, 11 gal8 canR cyh2R) [27] fueron cultivadas en medio rico (YPD), complementado con un 2% de glucosa. Para la generación de la cepa tpi1 Δ MR100 (MAT his3 un 1 leu2 Δ Δ 0 met15 Δ 0 ura3 Δ 0 LEU2:: tpi1) LEU2 la secuencia de codificación se amplificó a través de PCR utilizando el plásmido pACT2 (Clontech) como plantilla de ADN y los oligonucleótidos LEU2:: TPI-s y LEU2:: TPI-como que cada uno abarca una región de 35 nucleótidos homólogas a la secuencia de codificación TPI1. Después de BY4741 transformación de las células a través del acetato de litio método [28], transformantes fueron seleccionados en SC-leu medio (sintéticas completo medio sin leucina) con 3% (v / v) ethanol/0.1% (v / v) de glucosa, ya que células de levadura deficiente de la enzima Tpi1 no están en condiciones de crecer por medio únicamente complementada con la glucosa como fuente de carbono [29] - [31]. Para verificar la sustitución de genes de la secuencia de codificación TPI1, clones de levaduras no exhibir el crecimiento en los medios de comunicación complementado con glucosa como fuente de carbono han sido seleccionados y la correcta inserción de los fragmentos de ADN fue confirmada por PCR y Western blot utilizando un suero policlonal TPI ( 1:4000, [32]]. La preparación de ADN genómico de levadura, el etanol lisados, SDS-PAGE immunoblotting y se realizaron utilizando protocolos estándar como se describe anteriormente [33], [34]. A fin de excluir una segunda integración de la LEU2 gen marcador en el genoma de los generados Δ tpi1 cepa, la naturaleza de tipo levadura TPI1 genética recombinada fue de nuevo en el locus TPI1 y transformantes fueron probados por la pérdida de leucina prototrophy. Δ tpi1 un clon de levadura que ha sido verificado por esta serie de experimentos fue nombrado MR100 y se utiliza para nuestros enfoques experimentales. Si no se indique lo contrario, todos Δ tpi1 células fueron cultivadas en medios de comunicación con 3% de etanol y 0,1% de glucosa.

Para el análisis de complementación, que transformó el Δ tpi1 cepa MR100 centromérica con plásmidos para la expresión del ser humano TPI variantes (Met1_AAG, Cys41Tyr, Glu104Asp, Gly122Arg, Ile170Val y Phe240Leu), como se indica y solo las colonias seleccionadas en SC-leu-ura sintéticas complementado los medios de comunicación con el 3% ethanol/0.1% de glucosa. A continuación, los transformantes obtenidos fueron trasladados a los medios de comunicación placas que contengan glucosa como fuente de carbono que permite sólo en células de levadura funcional con TPI a crecer, así como en las placas que contienen 3% ethanol/0.1% de glucosa como control. Para este análisis, centroméricas plásmidos fueron utilizados para la clonación, ya que estos plásmidos son conocidos por ser muy estable en la levadura y generalmente se presente como una sola copia por células de levadura [24]. Para evitar efectos no deseados de reglamentación en nuestro análisis, el promotor GPD constitutiva se eligió para la expresión de TPI exógenos. Por otra parte, para evaluar la fiabilidad biológica de nuestro sistema, hemos expresado levadura Tpi1 centroméricas de un plásmido en la cepa MR100 también. TPI actividad enzimática se determinó como se describe a continuación y en comparación con la actividad de la enzima de tipo silvestre-BY4741 cepa de levadura. No se observaron diferencias significativas en la actividad de TPI se observaron en caso de que el Tpi1 enzima se expresó de la centromérica de plásmido o el genoma (datos no presentados).

Resistencia de Δ tpi1 expresar levadura de tipo salvaje o las diferentes variantes patógenas TPI a oxidantes se analizó como se describe anteriormente [35]. En pocas palabras, las respectivas culturas de levadura se cultiva a fase estacionaria y diluido en serie OD 600 a valores de 3,0, 1,0, 0,3 y 0,1. A continuación, 10 μ l alícuotas de cada cultura fueron avistados en SC placas que contienen diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (1-4 mM; en 0,5 mM pasos) terc-butilo hidroperóxidos (0.6-2 mM; 0,2 mm de pasos), Hidroperóxido de cumeno (0,05 - 0,25 mm, 0,05 mm pasos) y diamide (1.2-1.9 mM; 0,1 mm pasos). La sensibilidad se determinó mediante la comparación del crecimiento entre las diferentes cepas después de placas fueron incubadas durante 3 días a 28 ° C. Aberrante enriquecimiento de especies reactivas del oxígeno se determinó mediante la tinción de dihydroethidium levadura tal y como se describe anteriormente [35].

Dirigido por levaduras de dos híbridos análisis

Para investigar el comportamiento de la dimerización de las diferentes variantes patógenas TPI, que explota la levadura de dos sistema híbrido. Hemos generado una serie de cebo y presa plásmidos como se ha descrito anteriormente y en la información de apoyo. Estos plásmidos se utilizan para transformar la cepa de levadura L40ccua para expresar los diferentes cebos y presa proteínas en diversas combinaciones, como se indica en las cifras correspondientes. Transformantes fueron seleccionados en SC medios de comunicación carecen de triptófano y leucina. Para analizar la actividad de los genes reportero, levadura clones fueron avistados en SC medio que carecen de triptófano, leucina, histidina y uracilo. El crecimiento de la levadura en medios selectivos se analizó después de una incubación de las placas de 48-72 horas a 30 ° C. El reportero lacZ la actividad de los genes se analizó utilizando un ensayo sobre la base de o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (Applichem), tal como se describe anteriormente [36]. Para la detección de la presa de cebo y proteínas en el análisis de inmunoblot, la Gal4AD de anticuerpos (Sigma, 1:5000) o la serie LEXA suero policlonal ([36], 1:5000) se utilizó.

TPI actividad ensayo

Para medir la actividad catalítica del ser humano TPI variantes en la levadura, una enzima-junto ensayo basado en un protocolo elaborado por Maitra y Lobo se llevó a cabo [37]. En pocas palabras, los mismos números de células de levadura de logarítmicamente crecido culturas han sido recogidos. Luego, las células fueron lavadas y congelado a -80 ° C. Después de la descongelación, las células fueron resuspendido en PBS, pH 7,4 que contiene un cóctel de inhibidores de la proteasa ( "Complete", Roche) y zadas utilizando perlas de vidrio (425-600 μ m, Sigma). La concentración total de proteínas de levadura para cada lisado se determinó mediante un ensayo de Bradford (BioRad). Entonces, la igualdad de las concentraciones de proteínas se han añadido a PBS una solución tampón que contiene 1 U de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y NADH 0,3 mM (Sigma). Posteriormente, la reacción enzimática se inició mediante la adición de 10 μ l 40 mm glyceraldehyde-3-fosfato (Sigma). La oxidación del NADH fue seguida medir la densidad óptica 340, en intervalos de 5 s de 3 min usando un espectrofotómetro (Ultrospec Amersham). Posteriormente, la actividad enzimática de TPI bajo el estado de condiciones se ha calculado como promedio de conversión de sustrato por minuto y la actividad de las variantes patógenas TPI se comparó con la actividad de la naturaleza del tipo de enzima.

Cultivo de células de mamíferos y transfección

COS1 células fueron cultivadas en Dulbecco modificado del medio Eagle (DMEM, Gibco) suplementado con 5% suero bovino fetal, 50 U / ml penicilina y 50 μ g / ml estreptomicina (Biochrom) en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 a 37 ° C. Transfección se realizó a través Polyfect (Qiagen) según lo recomendado por el fabricante. Para preparar lisados celulares, las células fueron lavadas en PBS y zadas en un buffer compuesto por 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, pH 8,8, 25 U / ml benzonase ( Merck) y el 2,5% inhibidores de la proteasa ( "completo", Roche). SDS-PAGE immunoblotting y se realizaron como se describe [34]. GFP proteínas de fusión fueron detectados utilizando un anticuerpo monoclonal GFP (Roche, 1:2000) y la bandera de etiquetado proteínas de fusión se visualizaron mediante la utilización de un anticuerpo policlonal dirigido contra la etiqueta FLAG (Sigma, 1:5000). Tubulina se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal (Sigma, 1:2000) y endógenos TPI se detectó mediante el uso de un suero policlonal ([32], 1:5000).

Estructurales de visualización

TPI estructurales se obtuvieron las coordenadas de Kinoshita et al (MMDB: 32814, [38]] y visualizar Cn3D utilizando el paquete de software (NCBI), versión 4,1.

Resultados
Humanos de tipo silvestre y variantes patógenas TPI complementar la pérdida de levadura Tpi1 en vivo

Estructura función relación investigaciones han predicho que las mutaciones identificadas para ser responsable de TPI deficiencia puede afectar el terciario o cuaternario estructura de TPI, por lo tanto, lo que supone una fuerte reducción en la actividad catalítica de la enzima tal como se determina en los individuos afectados, sin embargo, son no se limita a un determinado dominio o región dentro de la enzima ([2], [13], [14] y Fig. 1]. Sin embargo, los metabolitos del paciente hacer muy dependerá de los antecedentes genéticos y factores ambientales. Por lo tanto, un modelo de sistema que permita el estudio de la enzimática y propiedades funcionales de tipo silvestre y variantes patógenas TPI sin efectos secundarios adicionales por las diferencias entre el medio ambiente y el fondo genético es necesario para obtener conocimientos sobre el mecanismo molecular implicado en la deficiencia de TPI.

Dado que no es posible medir la actividad enzimática de una enzima particular TPI en líneas celulares de mamíferos, sin más endógeno TPI, decidimos aprovechar la levadura como un modelo de sistema que permita esto, desde este enfoque inicial dará información sobre posibles variaciones en los enzimática funcionalidad de las diferentes variantes TPI. Como se describe en los métodos sección, hemos generado la Δ tpi1 cepa MR100 suprime la levadura TPI1 genética en haploides BY4741 la tensión de fondo de un solo gen método de sustitución. Para abordar la cuestión de si los humanos de tipo salvaje y el TPI variantes patógenas pueden servir de complemento a la pérdida de la proteína de levadura Tpi1, transformado esta cepa centromérica con plásmidos para la expresión de la naturaleza humana de tipo representativo o seis variantes patógenas TPI, tal como se indica. Hemos observado que en células de levadura expresar humanos de tipo salvaje TPI son viables en los medios de comunicación de glucosa, mientras que en células de levadura que contiene el vector vacío no crecen en los medios de comunicación indicando la glucosa que el ser humano de tipo salvaje enzima complementa la pérdida de la levadura TPI1 genética (Fig. 2A ). Cabe destacar que, con la excepción de la variante Met1_AAG TPI, todas las variantes patógenas TPI son viables a la glucosa placas de demostración de actividad funcional de estas enzimas.

Teniendo en cuenta que una mutación missense en la levadura TPI1 genética, que elimina la actividad catalítica de la proteína Tpi1, conduce a la inhibición de la síntesis de inositol vías resultantes de la sensibilidad a las drogas de litio [39], se redujo 5 veces diluciones seriadas de la Δ tpi1 cepa MR100 expresar las diversas variantes de TPI en los medios de comunicación de glucosa suplementado con diferentes concentraciones de cloruro de litio (Figura 2B]. Como era de esperar, no se observan importantes diferencias de crecimiento entre las distintas cepas de levadura incluso a altas concentraciones de cloruro de litio glicolítico que confirma aún más la funcionalidad de los patógenos TPI variantes.

Por último, se determinó la actividad catalítica de los de tipo salvaje y las variantes patógenas TPI MR100 en células de levadura. El Δ tpi1 células que expresan las variantes patógenas TPI Cys41Tyr, Glu104Asp, Gly122Arg o Phe240Leu, respectivamente, exhiben actividad catalítica en vivo que es comparable a la actividad catalítica de la naturaleza del tipo de proteína (Fig. 3]. Sin embargo, en células de levadura que expresa la variante Ile170Val TPI mostró una fuerte reducción de la actividad catalítica en comparación con la de tipo salvaje y las proteínas de otros patógenos TPI variantes. Para descartar que el bajo nivel de proteínas intracelulares de la variante Ile170Val TPI causa esta actividad disminuyó en la levadura, se analizaron los niveles de expresión de las diferentes variantes en TPI levadura análisis de inmunoblot. No se detectaron diferencias que se demuestre que la disminución de la actividad enzimática de la variante Ile170Val TPI se basa en la reducción de actividad enzimática per se (datos no presentados). Sin embargo, esta actividad residual de aproximadamente el 30% es suficiente para suprimir el crecimiento defecto de Δ tpi1 células de levadura en medio de glucosa en como se presenta en la Fig. 2.

Indicaciones para una alternativa de traducción inicio sitio web inicial en el TPI mRNA

La evidente discrepancia entre las mediciones del paciente y datos in vitro [40] y nuestras conclusiones en apoyo de levadura claramente la hipótesis de que otros procesos celulares están obligados a causar la extremadamente baja TPI mide la actividad en los pacientes. Por un lado, una proteína de la función y la actividad depende de la asociación con sus diversos socios de la interacción se producen en los distintos compartimentos celulares. Por otra parte, la diversidad funcional de las proteínas también puede ser regulado a nivel de la traducción debido a otros sitios de iniciación de traducción dentro de una transcripción del mRNA probablemente en la proteína resultante, con nuevas variantes propiedades funcionales [41]. Alternativa traslacional empezar sitios se producen con una mayor frecuencia en los primeros 20 codones en comparación con la frecuencia en las regiones río abajo [42], [43]. Curiosamente, hemos observado que la predicción NetSTART servidor ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetStart ), Que se basa en un algoritmo para la predicción de los sitios de inicio de traducción [44], ofrece una excepcional confianza alta puntuación de 0,700 para el codón ATG codificación MET14 en el TPI de proteínas en comparación con el valor de 0,741 para el primer codón de inicio (Fig . 4A]. Por lo tanto, si analizamos el segundo codón ATG podría funcionar como una alternativa de traducción del sitio de iniciación en el ARNm TPI. Para probar esto, hemos generado levadura plásmidos en los que (i) el primer codón ATG del gen TPI fue sustituido por un TCA (como se observa en la familia París TPI), (ii) un codón de parada artificial fue colocada en el codón posición 3, y codificación de los plásmidos (iii) de tipo salvaje TPI o (iv) TPI 2ndATG tal como se presenta en la Fig. 4A. Después de la transformación de estos plásmidos en la Δ tpi1 cepa de levadura, transformantes se chapada en SC-ura medio suplementado con 3% ethanol/0.1% de glucosa. Posteriormente, el etanol lisados de las levaduras de diferentes culturas se prepararon y el nivel de expresión de las diferentes proteínas de TPI se analizaron por immunoblotting. De tipo salvaje y TPI TPI 2ndATG son altamente expresada en la levadura tal y como se muestra en la Fig. 4B. Es interesante señalar que la variante TPI TPI Met1_AAG También se expresó en la levadura que demuestra que el segundo codón ATG en el TPI gen puede ser utilizado como sitio de inicio de traducción. Sin embargo, no la expresión de TPI Ser3_TER variante se observó en la levadura, por lo tanto, esta observación podría basarse en la alta actividad de tonterías ARNm mediada por la decadencia en la levadura [45]. Para confirmar la utilización del segundo codón ATG en el TPI gen como alternativa la traducción sitio web inicial en las líneas celulares de mamíferos, nos genera proteínas de fusión que comprende los primeros 200 nucleótidos de TPI gen humano que contengan las mutaciones descritas anteriormente fusionados a las buenas prácticas agrarias. Posteriormente, las células COS1 fueron transfectadas con los respectivos plásmidos o expresión con el vacío plásmido pEGFP-N1 y se incubaron durante dos días para permitir la expresión de proteínas recombinantes. Lisados de células se prepararon y posteriormente analizados por inmunotransferencia (Fig. 4C]. Ambas proteínas de fusión TPI Met1_AAG-GFP y TPI Ser3_TER-GFP se expresó en similares niveles en comparación con el TPI WT-proteína GFP demostrando que el segundo codón ATG TPI en el gen se puede utilizar también como un sitio de iniciación de traducción en células de mamífero.

Con este fin, hemos abordado la cuestión de si el TPI 2ndATG variante muestra glicolítico pruebas de funcionalidad. Una vez más, hemos creado para explotar nuestro modelo de levadura y se transforma Δ tpi1 células de levadura con el plásmido p416GPD-TPI 2ndATG para expresar esta variante en la levadura. Sin embargo, en células de levadura expresar TPI 2ndATG fueron incapaces de crecer en medio de glucosa lo que indica que esta proteína variante no tiene actividad catalítica (Fig. 4D].

Dimerización comportamiento de TPI se ve afectada por las diferentes mutaciones

Dimerización de comportamiento anormal de las variantes patógenas TPI ha sido discutido a menudo como una función en la patogénesis de la deficiencia de TPI debido al hecho de que varias mutaciones en el gen TPI podría influir en la dimerización de las propiedades de la enzima [2], por ejemplo, bioinformáticas predicciones basadas en cesiones de dominio sugiere que la mutación más común en la posición 104 en el TPI gen, que está situado en las proximidades de la interfaz de la dimerización de TPI, podría afectar a la dimerización de propiedad de TPI ([2], [14] y Fig. 1]. Sin embargo, experimental apoyo a esta hipótesis es insuficiente. Para abordar este aspecto, hemos explotado la levadura de dos sistema híbrido, ya que este sistema permite no sólo la investigación de la interacción directa entre las proteínas, sino también la cuantificación relativa de las interacciones proteína alterada [36], [46], [47]. En primer lugar, las construcciones de codificación generado la proteína de fusión cebo serie LEXA-TPI o la presa proteína de fusión AD-TPI para analizar si la dimerización de TPI puede ser controlada en un dirigidas levadura de dos híbridos de estudio y transformó la cepa de levadura L40ccua con los respectivos plásmidos. Transformantes fueron aislados y la actividad de los genes reportero se vigila el crecimiento a través de SC medio que carecen de histidina y uracilo. Hemos observado que en células de levadura co-expresando la serie LEXA-TPI y AD-TPI crecieron en SC-PRT-leu-su-ura medio que demuestra la actividad de los respectivos genes reportero (Fig. 5A, panel izquierdo]. Además, la expresión del gen reportero lacZ se indica mediante un cambio de color azul en una membrana a base de β-galactosidasa de ensayo. No activación de los genes reportero se observó en células de levadura que expresa la proteína de fusión serie LEXA-TPI AD y el dominio por sí solo demuestra que la formación de complejos de TPI se produce en la levadura de dos sistema híbrido. Por otra parte, si analizamos de tipo salvaje y el TPI TPI 2ndATG variante interactúan en este sistema. Células de levadura co-expresión de proteínas de fusión la serie LEXA-TPI y AD-TPI 2ndATG exhibió actividad de todos los genes reportero que se demuestre que la glicolítico inactivos TPI 2ndATG variante se asocia a la de tipo salvaje TPI. Sin embargo, observó la β-galactosidasa actividad resultante de la interacción entre los de tipo silvestre y el TPI TPI 2ndATG variante fue menor en comparación con la β-galactosidasa actividad medido en la levadura co-expresando de tipo salvaje TPI proteínas (Fig. 5A, panel central] . Para confirmar que las diferencias en reportero lacZ la actividad de los genes no se debían a diferentes niveles de expresión de las diversas cebo o presa proteínas, analizamos los niveles intracelulares de inmunotransferencia y no observó diferencias significativas en las concentraciones de proteínas intracelulares (Fig. 5A, panel derecho].

En el siguiente paso, hemos investigado si las mutaciones en el gen TPI podría afectar el comportamiento de la dimerización de la proteína de la medición relativa de la actividad de reportero lacZ gen, lo cual indica la fuerza relativa de una proteína-proteína interacción [47]. La cepa de levadura L40ccua se transformó con el cebo de codificación de construir la serie LEXA-TPI en combinación con las construcciones de presas de codificación de las variantes TPI AD-Cys41Tyr, AD-Glu104Asp, AD-Gly122Arg, AD-Ile170Val o AD-Phe240Leu, respectivamente. La actividad relativa de los genes reportero lacZ medido en la levadura co-expresando la serie LEXA-TPI en combinación con AD-Gly122Arg o AD-Phe240Leu, respectivamente, no fue significativamente alterada en comparación con la levadura co-expresando la serie LEXA-TPI y AD-lo que sugiere que TPI estas mutaciones no se afectan a la conducta con la dimerización de tipo salvaje TPI (Fig. 5B, panel superior]. Curiosamente, un ligero aumento de β-galactosidasa actividad fue observada en levaduras co-expresando la serie LEXA-TPI y AD-Ile170Val, mientras que una fuerte mejora se midió en la levadura expresar proteínas de fusión serie LEXA-TPI y AD-Cys41Tyr. Además, la interacción entre la serie LEXA-TPI y AD-Glu104Asp fue reducido en gran medida como un seguimiento de la fuerte reducción en la actividad del gen reportero lacZ. Una vez más, el análisis de los niveles intracelulares de cebo y la presa de inmunotransferencia proteínas demostrado que todas las proteínas de fusión fueron expresadas en la levadura en niveles similares (Fig. 5B, panel inferior]. Por lo tanto, estos resultados demuestran claramente que algunas mutaciones en el gen TPI en efecto, dar lugar a un comportamiento alterado la dimerización de la enzima TPI.

Desde el Glu104Asp TPI es la variante más común TPI variante patógena lo que representa aproximadamente el 80% de TPI y la deficiencia de los casos es la única variante identificado a ocurrir en un estado homocigotos [2], seguir estudiando las propiedades de interacción entre esta variante y los otros patógenos TPI proteínas. Hemos generado un cebo plásmido codificación serie LEXA-Glu104Asp y expresó esta proteína de fusión en combinación con las distintas AD proteínas de fusión, tal como se indica (Fig. 5C]. Como era de esperar de los resultados presentados en la Fig. 5B, la β-galactosidasa actividad medida en los respectivos clones de levaduras fue considerablemente menor en comparación con la correspondiente expresión de clones de levaduras salvajes de tipo TPI como cebo. Por otra parte, no una alteración importante en la dimerización de propiedades entre la proteína de fusión serie LEXA-Glu104Asp y el AD-TPI variantes Cys41Tyr, Glu104Asp, Gly122Arg, o Phe240Leu, respectivamente, se han detectado. Curiosamente, la levadura co-expresando la serie LEXA-Glu104Asp y AD-Ile170Val mostraron una significativamente mayor β-galactosidasa actividad. Con este fin, también se analizó la conducta de la dimerización de tipo salvaje y el TPI TPI 2ndATG variante llevar las diferentes mutaciones (Fig. 5D]. Levadura co-expresando de tipo salvaje TPI y las diferentes variantes TPI 2ndATG todos mostraron una reducción de la dimerización de comportamiento en comparación con células de levadura expresar de tipo salvaje y TPI TPI 2ndATG proteínas. Incluso aquí, la dimerización fue más afectados por la variante Glu104Asp TPI. En resumen, nuestros resultados indican que las diferentes mutaciones altamente patógena influir en el comportamiento de la dimerización humana recombinante TPI bajo condiciones in vivo.

Sobreexpresión de la variante Glu104Asp TPI resultados en la reducción de los niveles de expresión endógena TPI

La más frecuente variante TPI, Glu104Asp, muestra fuerte defectos en la dimerización de propiedades en comparación con el de tipo salvaje TPI. Esto sugiere que los procesos normativos, debido a la dimerización de proteínas aberrantes podría contribuir a la patogénesis de la deficiencia de TPI, y por lo tanto, directamente investigó si la sobreexpresión de esta variante podría tener un impacto en la regulación endógena de TPI. Por lo tanto, las células COS1 transfectadas con plásmidos para la expresión de la bandera-con etiquetas de tipo salvaje o patógenos TPI enzima. A continuación, lisados celulares se prepararon y analizaron por immunoblotting (Fig. 6]. Sorprendentemente, en comparación con overexpressed de tipo salvaje TPI, una fuerte reducción en el nivel endógeno TPI se detectó en caso de que la variante Glu104Asp se overexpressed (panel superior). Por lo tanto, este resultado demuestra claramente que endógeno de tipo salvaje TPI está desregulado en la presencia de una variante patógena TPI exhibiendo alterado la dimerización de propiedades y, por lo tanto, uno podría concluir que este aparente mecanismo de retroalimentación es potencialmente responsable de la reducción de actividad de TPI medido en la celda extractos de TPI deficiencia de los pacientes.

La reducción de actividad de TPI resultados en el aumento de la resistencia celular contra el tiol-oxidante de drogas diamide

La acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y las influencias cronológico replicativa envejecimiento en la levadura y desempeña un papel importante en la patogénesis de trastornos relacionados con la edad en los seres humanos [48] - [50]. Curiosamente, el aumento de estrés oxidativo crónico se ha detectado en una gravemente afectados TPI deficiencia del paciente así como [20]. A la luz de esta observación se investigó si los patógenos diferentes mutaciones en el gen TPI podría causar la acumulación intracelular de ROS en forma exponencial creciente Δ tpi1 levadura culturas supervisado por dihydroethidium tinción. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en rojo flurorescence entre las cepas de levadura que expresa la naturaleza o el tipo de patógenos TPI se observaron variantes (datos no presentados). Por último, se analizaron la resistencia de las diferentes cepas de levadura de oxidantes como el peróxido de hidrógeno, terc-butilo hidroperóxidos, Hidroperóxido de cumeno y diamide. No se observaron diferencias en las tasas de crecimiento entre las diferentes cepas de levadura se vigila en medio que contiene diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno, terc-butilo o Hidroperóxido de cumeno hidroperóxidos, respectivamente (datos no presentados). Sin embargo, hemos descubierto que el tratamiento de las diferentes cepas de levadura con el tiol-oxidante de drogas diamide tenido un efecto. Sorprendentemente, en células de levadura expresar Ile170Val TPI, la variante que muestran una reducción de actividad catalítica como se muestra en la Fig. 3, fueron resistentes a diamide tratamiento en comparación con las cepas que expresan de tipo silvestre o los demás variantes patógenas TPI (Fig. 7]. Sólo en células de levadura TPI expresar esta variante fueron capaces de crecer en medio que contiene 1,7 mm diamide. Por lo tanto, este resultado indica que una disminución en la actividad catalítica de la enzima TPI mediar resistencia celular contra el estrés oxidativo causado por el tratamiento diamide.

Discusión

Metabólicas estudios demostraron que la actividad de la enzima de TPI se reduce a un 3-20% de los de tipo salvaje como el valor medido en unpurified eritrocitos o músculo extractos de TPI deficiencia de los pacientes [2], [13], [51]. Sin embargo, algunas discrepancias entre las mediciones realizadas con los pacientes y los eritrocitos una serie de observaciones formuladas en sistemas experimentales y análisis teóricos se han reportado en los últimos años. Tal como se ha mencionado, la frecuencia de los alelos null TPI es mucho más alto como la rara incidencia de deficiencia de TPI [5] - [9], y las mediciones in vitro de un mutante TPI variante purificada de E. coli demostrado que la proteína purificada TPI llevan la mutación Phe240Leu expuesto a 6 veces mayor de lo esperado la actividad de las mediciones realizadas con el paciente extracto de eritrocitos [40]. Por otra parte, cálculos teóricos demostraron que la DHAP muy alto nivel observado en los pacientes eritrocitos no se correlaciona con las mediciones de actividad residual TPI [13]. Dado que los pacientes metabolitos altamente dependerá de los antecedentes genéticos y factores ambientales, hemos generado un sistema vivo que permite el análisis de la actividad enzimática de tipo silvestre o patógenos TPI variantes dentro de una celda sin efectos secundarios adicionales. Utilizando la genética de levadura, generó una cepa de levadura suprime la TPI1 genética que nos permita investigar el enzimática y propiedades funcionales de una serie de variantes TPI humanos in vivo. Nos mostró que el hombre de tipo silvestre, así como las variantes patógenas TPI Cys41Tyr, Glu104Asp, Gly122Arg, Ile170Val y Phe240Leu, respectivamente, todos reprimir el crecimiento defecto de Δ tpi1 levadura en medio de glucosa en proporcionar la primera evidencia in vivo de que estas variantes patógenas exhiben actividad catalítica . Hemos corroborado por este resultado que demuestra que los respectivos clones de levaduras no son hipersensibles a cloruro de litio, un fenotipo causado por la inactivación de la enzima Tpi1 debido a la inhibición de la biosíntesis inositol vía [39]. Por último, presentó pruebas de que la actividad catalítica en sí de todas menos una variante patógena TPI investigado no se ve afectada como consecuencia de la mutación en el gen TPI. Es interesante señalar que la variante patógena TPI Ile170Val muestra sólo alrededor del 30% de los de tipo salvaje actividad catalítica, por lo que esta actividad es suficiente para suprimir el crecimiento defecto de Δ tpi1 levadura en medio de glucosa.

Dado que nuestros resultados parecen estar en agudo contraste con el TPI mide la actividad en unpurified eritrocitos extractos de TPI deficiencia de la enfermedad en pacientes etapa, que claramente hacen evidente que los acontecimientos de reglamentación en lugar de la falta de actividad de enzimas son la base de esta enorme reducción de la actividad de TPI. De hecho se ha reportado que la unión de TPI a un componente aún no identificado de color rojo las membranas celulares pueden disminuir la actividad de TPI [23]. En esta línea, Jung y compañeros de trabajo identificados como humanos cofilin interacción socio de TPI y demostró que la Rho activador lysophosphatidic ácido conduce a la translocación de cofilin junto con TPI a la membrana plasmática. Este cofilin-TPI complejo entonces interactúa con Na / K-ATPasa [52]. En consecuencia, para dilucidar la patogénesis de la deficiencia de TPI, es de enorme importancia para identificar los factores celulares que interactúan con el TPI, que investiguen si su asociación tiene un efecto sobre la actividad catalítica de TPI, y, obviamente, si la unión se ve afectada por las diversas mutaciones .

Por lo menos tres diferentes variantes isoeléctrico TPI codificada por el gen único TPI se han observado en humanos glóbulos rojos [53], [54] o del cerebro del ratón las células endoteliales capilares [32]. Por otra parte, la Base de Datos de splicing alternativo (TEA, [55]] predice tres variantes alternativas de empalme a la alimentación humana TPI, pero ninguno de ellos ha sido identificado experimentalmente hasta la fecha. En este sentido, la diversidad de proteínas es a menudo generados por la utilización de otros sitios de iniciación de traducción [41], [43], sobre todo si iniciar un segundo sitio se encuentra dentro de los primeros 20 codones [41], [42]. El uso alternativo de iniciación de traducción sitios han sido objeto de debate para que causan enfermedades tales como las proteínas parkin [56], la proteína del prión [57] y el cáncer de mama BRCA1 antígeno [58]. En este sentido, presentó pruebas de que el segundo marco en el codón ATG TPI en el gen que codifica MET14 puede utilizarse como alternativa la traducción del sitio de iniciación a la levadura, así como en células de mamífero. Sin embargo, la proteína resultante no reprimir el crecimiento defecto de Δ tpi1 levadura en medio de glucosa lo que indica que esta variante carece de actividad catalítica. Este resultado no es inesperado, ya que esta variante TPI carece de catalizadores de la lisina y al menos tres residuos de la intersubunit interfaz. Es interesante señalar que la deficiencia de TPI un paciente que ha heredado una mutación codón de inicio en combinación con la mutación en la posición 104, tiene una mayor patología en comparación con Glu104Asp homocigosis [17].

Alteraciones estructurales de las variantes patógenas TPI a menudo se han especulado contribuir a la deficiencia de TPI como una serie de mutaciones parecen afectar a la dimerización de la interfaz de TPI que forma un dímero estable en la mayoría de los organismos investigados [2], [13], [54]. Para abordar esta cuestión, hemos analizado las propiedades entre la dimerización de tipo salvaje y las variantes patógenas TPI por un ensayo cuantitativo que se basa en el gen lacZ como reportero. Esto permite determinar la fuerza relativa de proteína-proteína en las interacciones de levadura, sin embargo, estos valores no pueden estar directamente correlacionada con fuerza de obligar constantes (por ejemplo, K, D) determinada por mediciones in vitro [46], [47]. Hemos descubierto que el comportamiento entre la dimerización de tipo salvaje TPI y las dos variantes patógenas Cys41Tyr y Glu104Asp está fuertemente alterada en comparación con el comportamiento entre la dimerización de tipo salvaje proteínas. Asimismo, observó que la glycolytically inactivos 2ndATG TPI dimerizes con la variante de tipo salvaje TPI, aunque a niveles reducidos en comparación con el de la dimerización de tipo salvaje TPI proteínas. Por último, hemos demostrado que la dimerización de patógenos entre las variantes también se produjeron con menor rigor según lo indicado por la relativa actividad de los genes reportero lacZ. A la luz de estos resultados, es bastante notable que la variante Glu104Asp TPI, que está representada la mayoría de modificar la dimerización de comportamiento, es la variante más común observado entre las personas afectadas. Por otra parte, esta variante es la única variante TPI encontrado homocigotos entre los individuos afectados, y todos los demás sólo se producen mutaciones en los heterocigotos compuestos estado junto con la variante Glu104Asp o con un evidente TPI alelo nulo ([2] y Fig. 1]. Por ejemplo, en el TPI París familia, el comienzo codón mutante (ATG a AAG) se ha detectado en los heterocigotos estado con la variante Glu104Asp [17], la variante Phe240Leu observado en la familia húngaro se encuentra junto con el alelo nulo Glu145TER [ 18]. En general, entre la dimerización de proteínas es un proceso para generar y regular funciones celulares de las proteínas [59]. Sorprendentemente, descubrimos que la sobreexpresión de la variante Glu104Asp resultados en reducción de los niveles endógenos de TPI en células de mamífero. Este hallazgo es emocionante ya que recientes estudios demostraron que ambos hermanos heterocigotos compuestos de la familia húngaro TPI han reducido los niveles de mRNA en comparación con sus padres y controles sanos [60] sugiere que las alteraciones en la formación de dímero resultando en una retroalimentación modificado la regulación de la enzima TPI podría subyacen a la patogénesis de la deficiencia de TPI.

Sorprendentemente, TPI es altamente regulado hasta bajo condiciones de estrés en células de mamífero ([32] y Ralser, observaciones no publicadas). En cuanto a este tema, es importante que la expresión de la Ile170Val TPI variante con la reducción de actividad catalítica en los resultados de mayor resistencia de levaduras a diamide. Diamide es un oxidante que se conoce a oxidar stoichiometrically incluyendo pequeñas moléculas glutation (GSH) dentro de los glóbulos rojos, pero es menos eficaz en la oxidación de proteínas-integrado cysteines [61]. Por lo tanto, diamide los resultados del tratamiento en una rápida disminución de GSH intracelular, por lo tanto, lo que el estrés oxidativo [62]. Curiosamente, los mecanismos de respuesta de las células eucariotas con el estrés oxidativo son estrictamente dependientes de los compuestos y sus efectos aguas abajo [63]. Esto podría explicar por qué la levadura células que expresan el TPI variante con la reducción de actividad catalítica no eran resistentes a los oxidantes todos los examinados. Es de destacar mencionar que en contraste con diamide, todos los otros oxidantes utilizados en este estudio son hidroperóxidos. El tratamiento con hidroperóxidos conduce a la inactivación de la proteína Tdh3, la más abundante de los tres glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en las enzimas de levadura, de S-thiolation, carbonlyation o ADP-ribosylation [64] - [67]. GAPDH cataliza la primera reacción abajo después de TPI en glycolysis y notablemente, mutantes que carecen de TDH3 fueron sensibles a un reto con una dosis letal de H 2 O 2 [67]. Es probable que la inactivación de GAPDH después de peróxido de tratamiento de células de levadura es prevenir el efecto protector de TPI variantes que presentan reducción de actividad catalítica. En este contexto, es destacable mencionar que el bloqueo de glycolysis puede obligar a una mayor afluencia de metabolitos en la vía pentosa fosfato resulta en una elevada concentración de NADPH celular [68], [69] y viceversa que las diferentes mutaciones introducidas en las enzimas implicadas en este itinerario están llevando a oxidante-hipersensible células [70]. Alto NADPH los niveles intracelulares son beneficiosos en condiciones de estrés oxidativo, debido a NADPH proporciona la base para varias enzimas antioxidantes incluyendo el thioredoxins o glutaredoxin el sistema [71], [72]. Tal como se ha mencionado, la primera enzima abajo de TPI en glycolysis, GAPDH, está específicamente inactivada después de peróxido de tratamiento de células de levadura [64], [66] y este tema es, curiosamente, se refleja en células de mamíferos así como [65], [68] .

A la luz de los resultados previamente mencionados es bastante intrigante que la frecuencia de heterocigotos las personas que transporten a uno inactivo TPI alelo es bastante alto. Varios estudios demostraron una frecuencia alélica de aproximadamente 0.002 (de raza caucásica y japoneses población) a 0,02 (African American población) [5] - [9]. De hecho este número implica que 1 de cada 2000 recién nacidos a personas de esta última población sufre de este trastorno tremendo, pero menos de 100 personas han sido diagnosticados con deficiencia de TPI en todo el mundo [6]. Una pantalla de mutagénesis en ratones identificaron cuatro heterocigotos TPI mutaciones que dan lugar a una reducción del 50% en TPI actividad catalítica en varios tejidos examinados [12]. Sin embargo, cada homocigotos o heterocigotos compuestos descendencia de estos ratones que carecían de cualquier fenotípicos anormalidades detectables en los heterocigotos estado, dio lugar a principios de letalidad embrionaria [12]. Estos resultados demostraron que mutaciones en el gen TPI resultante en un catalizador inactivo TPI enzima homocigoto causa letalidad embrionaria en ratones. La población humana estudios realizados indican que esta situación se refleja en los seres humanos así como [5], [6]. En consecuencia, se producen las mutaciones en los alelos de TPI TPI deficiencia de los pacientes no pueden codificar catalíticamente inactiva las enzimas TPI. Como se ilustra y se demuestra en la Fig. 8, homocigoto TPI null alelos son letales, ya que no homocigosis el desempeño TPI alelos null puede ser detectada en ratones y seres humanos [5], [12]. Por otra parte, TPI variantes alterado con la dimerización y que exhiben propiedades casi normal actividad catalítica específica como la variante Glu104Asp, se producen en homocigotos los estados que causan la deficiencia de TPI [14] o en combinación con TPI null alelos, por ejemplo, el TPI París (Met1_AAG; heterocigotos con Glu104Asp ) O TPI Alfortwille (frameshift en el codón 29; heterocigotos con Glu104Asp) [17] que representan el estado heterocigotos compuestos, mientras que los heterocigotos las personas que han heredado un alelo nulo heterocigotos en combinación con la naturaleza del tipo de alelo está sano y podría tener una ventaja heterocigótica. En relación con esta cuestión, hay que tener en cuenta que la ventaja de heterocigotos estado se ha demostrado para la anemia de células falciformes y la fibrosis quística, otras dos trastornos genéticos. Sorprendentemente, la frecuencia alélica de mutaciones que causan la fibrosis quística es comparable a la frecuencia de heterocigotos TPI mutaciones en el examinado afro-americanos población [6], [73]. El hecho de que la cepa de levadura que alberga el TPI variante con la reducción de actividad catalítica es más resistente a determinados estrés oxidativo es un primer indicio de que las mutaciones en los alelos TPI resultante en catalíticamente afectada enzimas podría conferir una ventaja a ciertos estímulos de estrés u otras condiciones ambientales.

Apoyo a la Información

Los autores desean dar las gracias a Ryoichi Yamaji (Prefectura de la Universidad de Osaka, Japón) para la prestación del TPI antisuero y Daniel Shenton y Chris Grant (Universidad de Manchester, Reino Unido) para ayudar con el TPI ensayos de actividad. También damos las gracias a Miriam Greenberg (Wayne State University, Detroit, EE.UU.), Mario Albrecht (Instituto Max Planck de Informática, Saarbruecken, Alemania), Ian Dawes (Universidad de Nueva Gales del Sur, Sydney, Australia), Michel Cohen-Solal ( Academie des Sciences, París, Francia), y los miembros de nuestro laboratorio Josmar Langner y Ute Nonhoff por su ayuda, apoyo y debates críticos.