PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

A corto y largo plazo los efectos de hVEGF A-165 en la creación de ratones transgénicos Activado

Biblioteca Pública de la Ciencia
Leppänen Pia [1], Ivana Kholová [1], Anssi J. Mähönen [1], Kari Airenne [1], Suvi Koota [1], Hannu Mansukoski [2], Johanna Närväinen [3], Maria Wirzenius [4], Leena Alhonen [1], Juhani Jänne [1], Kari Alitalo [4], Seppo Ylä-Herttuala [1]
[1] Kuopio, Finlandia
[2] Dresden, Alemania
[3] Manchester, Reino Unido
[4] Helsinki, Finlandia
[5] Kuopio, Finlandia
Resumen

Hemos generado un ratón transgénico que hVEGF-A 165 expresión ha sido silenciada con loxP-STOP fragmento, y hemos utilizado este modelo para estudiar los efectos de hVEGF-A lo largo de 165-expresión en ratones después de adenovirus sistémica mediada por la creación de la transferencia de genes. A diferencia de anteriores modelos convencionales de transgénicos, este modelo conduce a la expresión de hVEGF-A 165 en sólo un bajo número de células en los tejidos diana en los ratones adultos. Los niveles de hVEGF-A 165 expresión moderada y cambios morfológicos se encontraron principalmente en el hígado, mostrando signos típicos de la angiogénesis activa. La mayoría de los ratones sanos fueron sin mayores consecuencias hasta 18 meses después de la activación de hVEGF-A 165 expresión. Sin embargo, un ratón con un alto plasma hVEGF-A nivel de 165 murieron espontáneamente a causa de sangrado en cavidad abdominal, y teniendo en hemangioma hepático, hemorrágica paratubarian lesiones quísticas y el bazo peliosis. Asimismo, dos ratones desarrollaron tumores malignos (carcinoma hepatocelular y el adenocarcinoma de pulmón), que no fueron vistos en ratones control. Llegamos a la conclusión de que a largo plazo incontrolada hVEGF-A 165 expresión en sólo un número limitado de las células diana en ratones adultos puede estar asociada con cambios patológicos, incluida la posible formación de tumores malignos y la hemorragia no en tejidos diana. Estas conclusiones tienen implicaciones para el diseño de ensayos clínicos a largo plazo utilizando hVEGF-A 165 genes y proteínas.

Introducción

Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) fue el primer miembro identificado de la familia que incluye ahora del factor de crecimiento placentario (PIGF) y varios otros VEGFs (VEGF-B,-C,-D,-E) [1], [2 ]. Desde entonces la familia VEGF se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la permeabilidad vascular, la angiogénesis y linfangiogénesis tanto durante el desarrollo embrionario y en los adultos. VEGFs también se han utilizado en aplicaciones clínicas como proteínas recombinantes o la terapia génica [3], [4]. Sin embargo, los efectos a largo plazo de VEGF moderado de expresión en los adultos no se han caracterizado en el contexto de la proteína recombinante o la terapia génica.

Debido a la exigencia fundamental de la VEGF-A en el desarrollo embrional no ha sido posible crear modelos viables knockout para VEGF-A. Incluso de eliminatorias de una sola VEGF-A alelo ratones fueron incapaces de sobrevivir [5] - [7]. Además, los ratones que expresan sólo VEGF-A 120, pero ya no isoformas morir dentro de dos semanas después del nacimiento debido a la insuficiencia cardiaca [8]. VEGF-C ratones knockout mueren debido a la falta de los vasos linfáticos, mientras que VEGF-C + / - ratones sobreviven a pesar de los defectos en los vasos linfáticos [9,10]. En contraste con VEGF-A y VEGF-C ratones knockout VEGF-B, VEGF-D y PIGF ratones deficientes son viables, y PIGF y VEGF-B-doble ratones knockout no mostraron significativos fenotipo vascular [11] - [13]. Varios modelos de ratones transgénicos que se han generado utilizando los miembros de la familia VEGF. Transgénicos VEGF-A se ha expresado en la piel, ojos, pulmones, corazón o hígado en virtud de los promotores de tejidos específicos [14] - [18]. Por otra parte, PIGF ratones transgénicos han sido descritas [19]. Resultados similares se han registrado en estos modelos, lo que demuestra que todos los ratones han aumentado vascularización y la permeabilidad vascular. En contraste, los estudios con ratones transgénicos que expresan un exceso de VEGF-Cy VEGF-D en virtud del páncreas o los queratinocitos específicos promotores han demostrado el papel de estos factores de crecimiento, principalmente en LI [20] - [22]. Sin embargo, en todos estos modelos VEGFs suelen ser expresadas en cada una de las células del tejido diana y los modelos no pueden predecir totalmente los resultados después de la terapia génica de transducción de aplicaciones en las que la eficiencia suele ser <1-5% de las células en el órgano diana [23], [24].

Hemos generado un modelo de ratón transgénico que contiene en su genoma una loxP-STOP inactivada hVEGF-A 165 cassette de expresión, que pueden ser activadas por Cre la transferencia de genes en cualquier tejido en cualquier momento durante la vida [25]. La razón principal para la generación del actual modelo de transgénicos a evaluar los posibles efectos secundarios a largo plazo de hVEGF terapéutico 165-A la transferencia de genes. En esta construcción se ha utilizado el mismo tipo de potenciador como hemos utilizado en nuestros anteriores estudios de la transferencia de genes, sino que empleó una metilación más resistentes a los promotores a fin de lograr un compromiso a largo plazo expresión (CMV inmediata principios de potenciador de pollo y la β-actina promotor) [23], [26]. En el presente estudio hemos utilizado este modelo de ratón para estudiar a corto y largo plazo los efectos de hVEGF-A-165 más de expresión en la patología del hígado y otros tejidos. Sistémico AdCre la transferencia de genes fue elegida para el estudio ya que esto conduce principalmente a la activación de hVEGF-A 165 en el hígado, que es el sitio más común de no deseados biodistribución de adenovirus in vivo después de la transferencia de genes [27], [28].

Resultados y Discusión
Prueba de la hVEGF-A 165 cassette de expresión y Efectos a corto plazo

Antes de la creación de ratones transgénicos la pFlox construir (Figura 1] se puso a prueba in vitro y el casete fue encontrado funcional causando un fuerte hVEGF A-165 después de expresión AdCre mediada por la escisión de la STOP fragmento. AdCre y pFlox células tratadas expresó hVEGF-A 165 de manera eficiente de llegar al pico de expresión a las 24 h después de la transducción. Células transduced con pFlox solo o hVEGF-A 165 ratones transgénicos sin la transferencia de genes no expresó ninguna de las cantidades detectables hVEGF-A 165 durante el tiempo de seguimiento. La funcionalidad de la hVEGF-A 165 transgén in vivo fue verificado por resonancia magnetica, donde los cambios típicos eran vistos como discreto edema localizado debajo de la piel en todos los transduced músculos y sus fascias y también en el tejido graso debido a una mayor permeabilidad de los vasos (Figura 2 y Cuadro 1A]. Se utilizó ELISA para medir los niveles de hVEGF-A 165 con el fin de ver los niveles de proteína total del transgén en los tejidos y sueros. La posible formación bruta de reactividad fue probado local después de la transferencia de genes y no se encontraron correlaciones entre el ratón endógeno VEGF-A 164 y hVEGF-A 165 niveles en el control y la AdCre transduced ratones transgénicos (Figura 2]. Sistémico AdCre la transferencia de genes a través de la vena de cola fue realizada el 31 de ratones transgénicos y el control de 10 ratones a la edad de 2 meses. Además, otros 10 ratones transgénicos fueron inyectados con solución salina o AdLacZ. Una semana después de la activación de una amplia gama de hVEGF-A 165 se detectaron concentraciones en el suero de los ratones transgénicos. Se estima que sólo el 0,1 al 5% de todas las células en el hígado se transduced después de la AdCre la transferencia de genes y los niveles de hVEGF-A sólo 165 fueron moderados en comparación con la expresión del transgen en los niveles alcanzados en los tejidos previamente generados transgénicos VEGF-A modelos donde todas las células en un determinado tejido expresar el transgén. Por ejemplo Dor et al [18] fueron capaces de lograr 7 - a 11 veces los aumentos de hVEGF-A 165 expresión en comparación con el nivel de mVEGF endógeno-A 164 A partir del 1 de semana los niveles de hVEGF A-165 en suero se ~ 50% de los niveles alcanzados después de la transferencia directa de genes de codificación con adenovirus hVEGF A-165 [26]. Durante los próximos 3-4 semanas (Figura 3A] suero hVEGF-A 165 se redujo los niveles. Esto podría ser debido a la respuesta inmune contra la infección por adenovirus o toxicidad de la CRE, aun cuando no da señales de respuestas patológicas se encontraron en la química clínica o histológica secciones; apoptosis estaban presentes en todos los hígados transduced con AdCre, sino también en el control de ratones (datos no se muestra) y no importantes se observaron anomalías (ASAT y CRP) entre los grupos (Figura 3B y C]. El promotor área fue seleccionada para ser más resistentes a la metilación (el pollo β-actina promotor) y en contraste con los niveles séricos, la baja expresión de hVEGF-A 165 estuvo presente en muchos tejidos, incluso después de 18 meses analizados con ELISA ( Cuadro 1] y RT-PCR (Figura 3D].

La expresión génica adenoviral sistémica después de la transferencia de genes suele ser visto en el hígado, corazón, riñones, bazo y pulmones [27]. En consecuencia, los cambios en la histología después de hVEGF-A 165 expresión se observaron en el hígado, bazo y corazón en la mayoría de los ratones, pero normalmente no en los pulmones o en los riñones ( Cuadro 1]. Esto puede explicarse por la comparación del ser humano y el ratón endógeno VEGF-A los niveles de proteína en diferentes tejidos. En los pulmones el máximo hVEGF-A 165 niveles de expresión de proteínas sólo 2-8% de la mVEGF-A 164 niveles y en los riñones hVEGF-A 165 expresión proteica se redujo rápidamente a la baja o niveles indetectables. En los primeros puntos temporales, 1-4 semanas después de la AdCre la transferencia de genes, cambios histopatológicos se encontraron sólo en el hígado (Figura 4A-C]. Un aumento del número de capilares que figuran activa la angiogénesis: formación de órganos glomeruloid, el aumento de la brotación y ramificación, SAC-como las estructuras y centros de coordinación sobre el hemangioma de contención (Figura 4C]. El número de capilares en correlación con el número de la proliferación de hepatocitos (PCNA positivas núcleos) y los niveles de expresión hVEGF-A 165 (Figura 4D]. Resultados similares se han observado en ratones transgénicos que expresan hVEGF A-165 en el hígado [18], [29] - [30].

A largo plazo efectos de hVEGF-A 165

Dentro de 6-18 meses después de la transferencia de genes AdCre aumento de vascularización y la proliferación de hepatocitos persiste en el hígado, pero las anomalías morfológicas y signos activa de la angiogénesis son mucho menos frecuentes (Figura 5A]. Todos los ratones estaban saludables sin mayores consecuencias hasta 13 meses y sólo cambios menores se observaron: de los 19 ratones en el largo plazo el seguimiento de un grupo de ratón tenía un hepática basófilos hiperplasia focal de 500 μ m de diámetro que contienen células con un alto cantidad de grasa (Figura 5B]. En el corazón, hemos encontrado discreto edema y en dos ratones epicárdicos calcificación estuvo presente (Figura 5C, E], que puede explicarse por hVEGF-A 165 de capacidad para aumentar la formación ósea [31]. En un ratón de la trompa de Falopio es muy vascularizada (Figura 5F] y en otros el aumento de vascularización del ratón, ocasionales y fibrosis focal paraductal infiltración linfocítica fue encontrado en el páncreas. Por otra parte, testículo del mismo ratón es muy vascularizada (Figura 5G-J]. No se encontraron alteraciones en los ovarios y los riñones. En general, todos los angiogénicos se encontraron alteraciones a nivel de arteriolas y capilares / venules y destacó el aumento de número de buques, la ampliación de los buques y locales angiogénicos actividad.

En los dieciocho meses de seguimiento después de la transferencia de genes principales consecuencias fueron vistos; un ratón desarrollado un carcinoma hepatocelular en el hígado y el otro tenía un adenocarcinoma papilar en los pulmones (Figura 6A, B]. Ambos de estos ratones tenían niveles moderados de expresión hVEGF A-165 en suero después de 1 semana (240 y 710 pg / ml). Nosotros y otros han visto anteriormente espontánea carcinomas en el hígado en muchos modelos de ratones, especialmente en mujeres de edad con ratones Balb / C de fondo [32] y también la expresión de transgénicos hVEGF A-165, especialmente en los pulmones fue baja (ratón endógeno VEGF - A 164 niveles fueron 25 veces superiores a hVEGF-A 165). Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que hVEGF-A 165 desempeñado un papel en la formación de tumores de inducir el crecimiento de tumores latentes o por algún otro mecanismo, especialmente en el caso de carcinoma hepatocelular. En contraste activado de ratones transgénicos sólo los tumores benignos se encontraron en el control de ratones con la misma edad (en peso con la transferencia de genes de anuncios o ratones transgénicos sin activación), un thecoma en la trompa de Falopio y un adenoma en los pulmones. Una hVEGF-A 165 ratón transgénico murieron espontáneamente 16 meses después de la transferencia de genes con la cavidad abdominal llena de sangre y los niveles séricos de hVEGF-A 165 todavía más de 500 pg / ml. Muchos cambios se han visto macroscópicamente en diferentes tejidos de este ratón (Figura 6C-E]. Microscópicamente pendulating un hemangioma cavernoso (7 milímetros de diámetro) estuvo presente en el hígado con una débil coordinación hVEGF-A 165 inmunoreactividad (Figura 6F-H]. Asimismo, el bazo mostró una combinación de cicatrices fibrosas, que son una reminiscencia de Gandy-Gamna nódulos se describe como consecuencia de una hemorragia focal y dilatación de las pupilas de espacios quísticos que se focally lleno de sangre se asemeja peliosis (Figura 6i-K]. En el mismo animal paratubary toda la zona estaba muy vascularizada, y reveló focal hVEGF-A 165 positividad con signos de hemorragia antigua y la formación de un trombo en dilatados espacios quísticos paratubary. (Figura 6L-N]. Todos estos hallazgos se pueden conectar con locales de más de expresión de hVEGF-A 165.

En conclusión, hemos creado un modelo de ratón transgénico que expresa un exceso de hVEGF A-165 después de la creación de la transferencia de genes de proteínas. Mediante la utilización de diferentes vectores, los tejidos específicos promotores locales y las técnicas de transferencia genética hVEGF-A 165 expresión puede ser objeto deseado en los tejidos y tipos de células en ratones adultos. En este modelo los niveles de hVEGF-A 165 expresión moderada y se típico angiogenetic cambios eran en su mayoría se encuentran en el hígado, sino también en algunos otros tejidos después de la transferencia de genes sistémicos. La mayoría de los ratones sanos fueron sin mayores consecuencias hasta 18 meses. Sin embargo, un ratón muerto espontáneamente a causa de sangrado en cavidad abdominal, y teniendo en hemangioma hepático, hemorrágica paratubarian lesiones quísticas y el bazo peliosis. Asimismo, dos ratones desarrollaron tumores malignos (carcinoma hepatocelular y el adenocarcinoma de pulmón). De este modo, llegamos a la conclusión de que sin control a largo plazo expresión de hVEGF-A 165 puede causar importantes alteraciones patológicas en los tejidos blanco y apretado regulación de la expresión del transgen parece ser un requisito previo para todas las aplicaciones terapéuticas con el objetivo de largo plazo expresión de hVEGF-A 165 .

Métodos
Generación de la creación humana controlada VEGF-A 165 cassette de expresión

Un oligonucleótido que contiene los sitios de restricción Xho I sda y yo estaba clonado en un BGL II + II-Dra digerido pcDNA3 vector (Invitrogen). El plásmido resultante fue nombrado pcDNAmcs. A Sal Iy Pst I CAG fragmento que contiene el promotor (que consiste en la inmediata temprana por CMV y el potenciador de pollo β-actina promotor) y conejo β-globina polyA de pCAGGS plásmido (un regalo de generious Prof Jun-ichi Miyazaki) fue clonado en XhoI / SdaI corte pcDNAmcs. LoxP Un sitio que contiene un enlazador MCS oligo fue clonado en el sitio EcoRI del plásmido. El plásmido resultante fue nombrado pCaGGSmcs. A BamHI digerido y mitigado STOP-cassette (que consiste en el SV40 principios de polyadenylation señal y una señal de empalme de donantes [33] de la pBS302 (RIKEN Banco de ADN), se incorporó LMP I sitio de la pCAGGSmcs. Plásmido El resultado fue digerido con EcoRI y EcoRV y ligated con hVEGF-A 165 cDNA (digerido por EcoRI y EcoRV de pCMV-hVEGF-A 165). El plásmido resultante fue nombrado como pFlox (Figura 1] y primero en NIH-3T3 células que se tranduced de Cre adenovirus ( Cre que contienen genes bajo el promotor CMV) 500 a MOI. 12 h después de la transducción, las células fueron transduced con el plásmido pFlox. mediano, se tomaron muestras de humanos VEGF-Un análisis de ELISA (R & D Systems, Minneapolis, EE.UU.) en diferentes puntos temporales.

Animales de experimentación

pFlox plásmido fue digerido con Sal I / Asc I y los fragmentos resultantes se microinjected en la CD2F1 híbrido ratones (Balb / C x DBA2). Ratones transgénicos fueron analizados cola de ADN genómico por PCR usando primers específicos para hVEGF-A 165 (5'-ccatgaactttctgctgtc-3 'y 5'-tcgtgagattctgccctc-3') y un gen de control interno (ApoB con primers 5'-attgccttagatagtgcc-3 'Y 5'-tttgctagatttacacgg-3'), F6 generación de ratones fueron utilizados para los experimentos. hVEGF-A 165 ratones transgénicos (n = 31) y el control de ratones sin el transgén (n = 10) fueron inyectados a través de la vena con cola recombinante E1-parcial-E3 suprimido primera generación serotipo 5 Cre adenovirus (1 × 10 9 ufp). Otro grupo de ratones transgénicos (n = 10) también fueron inyectados con solución salina y se desempeñó como controles adicionales. Un subgrupo de animales fueron sacrificados de 1 a 4 semanas después de la transferencia de genes y el resto de los ratones fueron sacrificados 6 a 18 meses después de la transferencia de genes. La dieta y el agua se proporcionaron ad libitum. Se recogieron muestras de sangre y circulan hVEGF-A 165 y endógeno mVEGF-A 164 se midieron los niveles de cola vena muestras de plasma en diversos puntos de tiempo después de la transferencia de genes con la enzima-ligado inmunoensayos (I + D; Quantikine, humanos VEGF-A y el ratón-VEGF A). De rutina de química clínica para ensayos de aspartil aminotransferasa (ASAT) y proteína C reactiva (CRP) se realizó con Ecoline R 25 (Diagnóstica Merck) y Quickread CRP (Orion Diagnóstica kits). Durante la transferencia de genes animales fueron anestesiados utilizando sc-fluanisone fentanilo (3,15 y 10 mg / kg) / midazolam (5 mg / kg). Los ratones fueron sacrificados utilizando dióxido de carbono. El árbol arterial fue perfundido con PBS. Los tejidos se tomaron muestras para el análisis de la expresión del transgen [34] y bien puesto fijo de 2 h (4% paraformaldehído) y embebidos en parafina o congelado en nitrógeno líquido para ARN y proteínas análisis. Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales y el uso Comité la Universidad de Kuopio.

RM de ELISA y reacción cruzada de prueba

Otro grupo de transgénicos (n = 8) y control (n = 4) Los animales fueron transduced de AdCre o Ad-Tie-Cre o anuncios hVEGF-A 165 (1 × 10 10 ufp / ml) en un volumen total de 100 μ l distribuido en la extremidad distal posterior y en la pantorrilla de la extremidad posterior izquierda. Derecho extremidades posteriores sirvieron como controles. Sólo los ratones que fueron transduced de AdCre fueron seguidos con resonancia magnética, mientras que otros se utilizaron para evaluar posible reacción cruzada por ELISA. La RM se realizó a los 1, 4, 7, 14, 21, 28, y 42 días después de la transferencia de genes. Los ratones fueron anestesiados y coloca con recto a apretar las extremidades posteriores dentro de una bobina de superficie. La RM se realizó a los 9,4 T imán vertical Oxford (Oxford Instruments, Eynsham, Reino Unido), una interfaz a una consola de SMIS (Surrey Medical Imaging Systems, Guilford, Reino Unido). Fat saturación se utilizó en todos los experimentos de resonancia magnética. T 2-ponderada de imágenes se realizó utilizando una secuencia spin eco con dos pulsos reorientación adiabática. Total tiempo de eco (TE) fue de 44 ms, el tiempo de repetición (TR) 2000 ms, resolución 256 × 128, campo de visión (FOV) 22 × 22 mm 2, con un promedio de 4.

Inmunohistoquímica

Para el análisis inmunohistoquímico, las secciones de serie (6 μ m) fueron cortadas y se utilizan para coloraciones. Las secciones fueron teñidas rutinariamente con hematoxilina-eosina y en casos seleccionados con Trichrom Masson, PAS, y Alizarin Red S método de calcio con el fin de analizar los cambios básicos en diferentes tejidos. Vascularización del tejido fue evaluada por inmunoticción con el anticuerpo CD34 (HyCult biotecnología BV, clon 14,7 MEC, dilución 1:20). Antígeno se visualizan de avidina-biotina-HRP sistema (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories). Endógena avidina-biotina actividad en el hígado fue bloqueada por avidina / kit de bloqueo de biotina (avidina / kit de bloqueo de biotina, Vector Laboratories). Además, anti-CD 31 rata anti-anticuerpo monoclonal de ratón (PECAM-1, BD Pharmingen, clon MEC13.3, 1:50) y LYVE-1 primaria de conejo anti-ratón anticuerpo monoclonal (dilución 1:1000) se utilizaron para evaluar el sistema vascular [35]. Ambos antígenos se han detectado utilizando tyramide señal de amplificación (TSA Sistema Biotina, PerkinElmer). Hepatocelular se analizó la proliferación de inmunoticción para la proliferación de núcleos de células antígeno (PCNA, Neomarkers, clon PC 10, dilución 1:500). Antígeno fue detectado mediante el kit Dako ARK (DakoCytomation Dinamarca A / S, Glostrup, Dinamarca). Humanos VEGF-A (policlonal de cabra, R & D Systems, 1:500) se detectó utilizando avidina-biotina-HRP sistema (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories). La señal se visualiza con DAB (Zymed, South San Francisco, CA) o True Blue (KPL, Maryland, EE.UU.) como cromógeno. ApoTaq kit se utilizó para evaluar la apoptosis en el hígado después de la transferencia de genes. Número de capilares y la apoptosis en las secciones de hígado se había contado en cinco campos seleccionados al azar a 200x de aumento utilizando microscopio Olympus AX70 [26] (Olympus Optical, Japón) y análisis de software (Soft Imaging System).

RT-PCR y proteína extracciones

Total RNA se aisló con TRIzol compuestos (Invitrogen). ARN fue tratada DNasa y digerido antes de síntesis de ADNc con Eco 130I, que corta el ADN en el medio de amplificación de la zona con el fin de deshacerse de genómica posible contaminación. cDNA fue sintetizado a partir de la ARN total con Superíndice II (Invitrogen), utilizando primers al azar. La amplificación del transgén se realizó con los primers interior para hVEGF A-165, tal como se describe [36]. Las proteínas se extrajeron con T-PER extracción de proteínas de tejido reactivo incluyendo Detener inhibidores de la proteasa y contenido de proteína total se analizaron con BCA Kit de Determinación de proteínas (Pierce, EE.UU.).

El análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando modificados t-test (SPSS 7,5, SPSS Inc). Los datos son expresados como media ± desviación estándar y el valor de P <0,05 fue considerado significativo.

Los autores desean agradecer a Mervi Nieminen, Anne Martikainen, Tiina Koponen, Sari Järveläinen, Seija Sahrio y Tuula Reponen de asistencia técnica.