PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Fine Tuning de la expresión de genes de globina de metilación del ADN

Biblioteca Pública de la Ciencia
Alon Goren [1], Giora Simchen [2], Eitan Fibach [3], Piroska E. Szabo [4], Keiji Tanimoto [5], Lyubomira Chakalova [6], p. Gerd Pfeifer [4], Peter J. Fraser [6], James D. Engel [7], Howard Cedar [1]
[1] Jerusalén, Israel
[2] Jerusalén, Israel
[3] Jerusalén, Israel
[4] Duarte, California, Estados Unidos de América
[5] Tsukuba, Japón
[6] Cambridge, Reino Unido
[7] Michigan, Estados Unidos de América
Resumen

Los patrones de expresión en el grupo de genes de globina están sujetos a la reglamentación de desarrollo en vivo. Mientras que el A y γ γ G genes se expresan en el hígado fetal, ambos son silenciados por los adultos los eritrocitos. Con el fin de descifrar el papel de la metilación del ADN en este proceso, hemos generado un ratón transgénico YAC sistema que nos permite un control γ metilación durante el desarrollo. Metilación del ADN provoca una 20 veces la represión de γ Un tanto en no erythroid y adultos Células Eritroides. En Células Eritroides esta modificación funciona como un mecanismo dominante para reprimir la expresión de genes γ, probablemente a través de cambios en la acetilación de histonas que impiden la unión de erythroid factores de transcripción al promotor. Estos estudios demuestran que la metilación del ADN sirve como una elegante en vivo de ajuste del dispositivo adecuado para la selección de genes en el locus globina. Además, nuestros resultados proporcionan un mecanismo para comprender los altos niveles de γ-globina transcripción visto en pacientes con persistencia hereditaria de hemoglobina fetal, y ayudan a explicar por qué 5azaC butirato y los compuestos de estimular γ-globina expresión en pacientes con β-hemoglobinopatías.

Introducción

Genoma amplia metilación del ADN es creado durante el desarrollo temprano y luego mantenerse en un semi-conservador manera a través de cada división celular [1]. La presencia de grupos metilo al parecer sirve como señal molecular que puede dirigir el envase de ADN en un circuito cerrado de difícil acceso conformación cromatina [2] y lograr la deacetylation locales de histonas H3 y H4 [3]. Debido a estas observaciones, se ha postulado que la metilación puede servir como un mecanismo mundial para la represión de la transcripción basal [4]. De acuerdo con esta organización, muchos genes específicos de tejido se encuentran metilado en casi todos los tipos de células del organismo, sino que sufren desarrollo regulado desmetilación en su tipo de células de expresión [5]. Poco se sabe acerca del papel de la metilación del ADN en este proceso de diferenciación.

Un buen sistema para el estudio de la metilación de genes concretos es la humana β-globina locus en el cromosoma 11, que está integrada por cinco diferentes tipo β-genes que se expresan en una forma regulada durante el desarrollo [6]. En no-Células Eritroides, todo el locus repeticiones finales de la fase S [7] - [9] y se envasa en un recipiente cerrado DNaseI insensible conformación de cromatina, donde todos los genes individuales son metilado. En contraste, durante erythroid diferenciación de células específicas, la plena legitimación sido sometido a un "abrir" el proceso, convirtiéndose en principios de replicar y, en general, DNaseI sensibles [10], pero sólo se someten a genes específicos desmetilación y, de hecho, convertirse en transcriptionally activa. Así, por ejemplo, γ-globina preferentemente los genes son activos en el hígado fetal, mientras que la β principalmente gen está activo en adultos Células Eritroides en caso de que ambos A y γ γ G permanecer metilado [11] y silenciadas en un proceso que parece estar mediada de MBD2 [12].

Usando un enfoque genético en ratones transgénicos que demuestran que la metilación del ADN local juega un papel en la prevención de la activación de γ globina en adultos Células Eritroides, y este efecto es mediado por las histonas deacetylation y la prevención de factor vinculante. Estos resultados proporcionan una sólida base experimental para los enfoques encaminados a inducir la expresión γ en los casos de β-talasemia a través de tratamientos que lograr la desmetilación del ADN o las histonas acetilación. Nuestros resultados también sugieren que la desmetilación puede ser un paso obligatorio en los mecanismos moleculares que lograr la expresión anormal de γ globina visto en la persistencia hereditaria de hemoglobina fetal.

Resultados
Experimental estrategia

Con el fin de determinar el papel exacto de metilación del ADN en la represión de γ-expresión de genes de globina, realizamos un enfoque biológico para el control local de metilación. Con este fin se utilizó una (cromosomas artificiales de levaduras) YAC transgén llevar toda la humana β-globina de legitimación que ha demostrado ser debidamente regulado en el ratón [13], [14]. Durante el desarrollo temprano, en el momento de su implantación, las regiones insulares CpG son reconocidos y protegidos del proceso de metilación de novo [15]. Esto se logra mediante la participación de las entidades de crédito que actúen secuencias [16], [17], y uno de esos elementos (IE-Isla de elemento) identificadas en la Aprt lugar, se ha demostrado que el trabajo predominantemente para prevenir la metilación de transgenes in vivo [3] . Experimentos preliminares indicaron que la inserción de dos copias en tándem de la IE, cerca de la γ-globina promotor podría generar una proporción relativamente grande (1 kb) unmethylated región que se mantiene en todas las células somáticas del ratón (ver Materiales y Métodos]. Sobre la base de esta observación que ha diseñado una duplicación de IE secuencia flanqueada LoxP sitios con 40 pb río arriba a la A-γ globina transcripción de genes en el sitio web inicial a 150 kb YAC que lleva toda la humana β-globina locus [18], y esta construcción se utilizó para generar ratones transgénicos (Figura 1A]. Cuatro fundador con animales intactos YACs se obtuvieron, y el análisis Southern blot mostró que 3 de ellos (47, 64, 113) fueron completamente unmethylated en un sitio de restricción selectiva en la γ un promotor del gen, lo que indica que esta estrategia tuvo éxito (Figura 1B] . En un animal transgénico (66), el promotor se mantuvo parcialmente metilado.

Con el fin de manipular la metilación del ADN y, por tanto, probar su efecto sobre la transcripción γ, ratones transgénicos fueron cruzadas con dos tipos de cre-expresando animales. La primera línea de creación de ratones (CRE) contienen un vector de expresión que es constitutivamente activa en todos los tipos de células de primeras etapas en el desarrollo [19]. En F1 animales generados a partir de esta cruz, la IE se retirarían antes de su implantación y, en consecuencia, el γ Un gen se convierte en metilado (ver Figura 1]. El Mx-Cre ratón, en cambio, contiene un interferón inducible cre-gen [20]. En F1 los animales de esta cruz, la γ Un gen debe ser protegido de la metilación de novo en el momento de su implantación. En el adulto, la IE puede ser destituido por el tratamiento con interferón, pero el gen que todavía quedan sin modificar. Así, utilizando esta estrategia, debería ser posible combinado para generar ratones transgénicos con un sitio fijo integración cuya única diferencia es el estado de metilación del ADN en los γ El promotor, en todo el organismo [21].

Efecto de la metilación del ADN en la expresión génica

El uso de la globina YAC transgén, ahora es posible determinar el efecto de la metilación del ADN en la transcripción de un gen γ en tanto no erythroid y Células Eritroides. Como no Células Eritroides, hemos utilizado fibroblastos de ratón embrionario (MEFs) generados a partir de Cre o Mx-Cre transgénicos (línea 64) cruza. La secuenciación bisulfite técnica se utilizó para medir el estado de metilación en la A y γ γ G promotores. En las células en las que la IE se ha retirado de pre-implantación (CRE), el γ Un gen se encontró completamente metilado en 4 sitios CpG aguas arriba. En contraste, las células que mantienen la IE durante la implantación (Mx-CRE) son muy unmethylated en esta misma región (Figura 1C]. El G γ promotor siempre un importante control que se mantuvo metilado en todas las MEFs de ratones transgénicos.

Semi-cuantitativos RT-PCR se utilizó para determinar el nivel de expresión de la γ, así como β-globina genes. Tomamos ventaja de una única enzima de restricción en el sitio γ Un gen para distinguir entre una y γ γ G transcripciones. Se encontró que la unmethylated γ Un gen se transcribe a niveles mucho más altos (alrededor de 20 veces) que la copia metilado, mientras que tanto el G γ y β-globina genes se expresan en niveles similares (Figura 2]. Estos resultados son consistentes con estudios previos que demuestran que la metilación del ADN de genes promotores γ inhibe la transcripción transfectadas en fibroblastos [22]. Cabe señalar que estos niveles el estado de equilibrio de ARN en MEFs son unos 8-9 órdenes de magnitud inferior a la que en el hígado fetal o de adultos erythroblasts. La mayor parte de esta inhibición es claramente independiente de metilación del ADN.

Con el fin de examinar el papel de la metilación del ADN en el control de γ-globina transcripción en Células Eritroides, estamos aislados de adultos bazo de animales transgénicos (líneas 47, 64, 113) y distinguirse en la erythroblasts utilizando una celda de tipo de anticuerpos específicos afinidad columna. En estas células, la β-globina de genes se expresa en niveles muy altos (Figura 2B]. Si bien la γ-globina secuencias son transcritas en un nivel bajo en comparación con β-globina, esto es aún cerca de 6 órdenes de magnitud superior a la que no se mide en Células Eritroides. Este incremento en la expresión es presumiblemente debido al hecho de que este locus se encuentra en una situación de mayor apertura general de la cromatina en la conformación de estas células. Cabe señalar, sin embargo, esa cantidad de γ A-globina ARN sigue siendo considerablemente inferior a los niveles producidos en el hígado fetal. Undermethylation de la γ Un gen promotor en el bazo erythroblasts trae consigo una notable 20 veces incremento medio en la actividad de este gen, en comparación con su homólogo metilado en tres independientes transgénicos fundadores. En contraste, los constitutivamente metilado γ G promotor sigue siendo reprimidos, y esto sirve como un interno de control negativo para la inducción visto con un γ.

Aunque el porcentaje normal de expresión γ globina humana en erythroblasts es de aproximadamente 5-10% del total (β + γ) ( http://www.genecards.org/index.shtml ; http://symatlas.gnf.org/SymAtlas ), Esta relación parece mucho más baja (1%) en nuestro ratones, y esto es, de hecho, en consonancia con los datos anteriores de otros animales transgénicos desempeño similar construcciones (0.3-3%) [14], [23]. A falta de metilación del ADN en los γ El promotor, γ globina expresión proporción aumenta (hasta un nivel del 3-6%), pero si suponemos que el gen G γ se ve afectada por la desmetilación en la misma medida, el total de γ / γ + β realmente se espera que llegue a niveles de 10-25%, que es aproximadamente el mismo orden de magnitud que la observada en el hígado fetal (Figura 2 y / o casos de transgénicos HPFH (30-65%), donde tanto la γ y β genes están activos [24]. Así pues, parece que la metilación del ADN es que actúa como un mecanismo local para reprimir la actividad de γ-genes de globina en adultos Células Eritroides.

Efecto de la metilación del ADN en la modificación de histonas

Uno de los mecanismos de metilación del ADN que inhibe la expresión de genes es de lograr la deacetylation locales de histonas [3]. Por tanto, nuestro estudio la modificación de las histonas patrón de nucleosomas coloca en la región promotora de la A y γ γ G genes in vivo. Esto se llevó a cabo mediante el aislamiento mononucleosomes de fibroblastos o células erythroblast y someterlos a la cromatina Immunoprecipitation (CHIP) utilizando el análisis de anticuerpos contra el Ac-H4. El principio activo del ratón β-actina y actina α inactiva genes se utilizaron como controles pareados para verificar la eficacia de immunoprecipitation.

Como era de esperar, los metilado γ Un gen promotor-en no Células Eritroides se envasa en nucleosomas que contengan desacetilizado histona H4, de manera similar a otros genes reprimidos. Sorprendentemente, a falta de metilación del ADN, esta región se convierte en acetilado, alcanzando los niveles máximos mismo probablemente como resultado de metilo proteínas de unión [12] relacionados con transcriptionally activa genes como β-actina o β-globina en Células Eritroides (Figura 3A ). Idéntico resultados se observaron para metilación del H3 (K4) (datos no presentados), que también es conocido por ser correlacionada con la actividad de los genes. Este cambio en el patrón de modificación de las histonas es sorprendente a la luz del hecho de que γ-globina se expresa a niveles tan bajos no en Células Eritroides, lo que sugiere que a diferencia de otros mecanismos de represión, es la metilación del ADN que desempeña un papel dominante en el establecimiento o el mantenimiento de acetilación de histonas en este lugar.

Acetilación de histonas se examinó también en adultos erythroblasts purificados de bazo. En estas células, los genes γ se expresan en los niveles 6 órdenes de magnitud superior a la observada en los fibroblastos. A pesar de ello, tanto el G γ y γ A los promotores están empaquetados con nucleosomas que contengan desacetilizado histona H4 (Figura 3B]. Esto es más probable debido a la presencia de metilación del ADN, ya que la eliminación de estas fracciones de metilo trae consigo un aumento espectacular tanto en la acetilación de H4 y metilación del H3 (K4) (Figura 3B y datos no presentados). Esto sugiere que en Células Eritroides, es básicamente metilación del ADN que mantiene el γ genes empaquetados en su desacetilizado forma, y esto probablemente para explicar su nivel subóptimo de expresión.

Efecto de la metilación del ADN en unión a proteínas

Uno de los principales efectores de globina expresión en Células Eritroides es la presencia de muy específicos factores de transcripción como GATA1, CP1/NF-Y y NFE3 reconocer que define la secuencia de motivos presentes en muchos sitios dentro de la globina locus, entre ellos el γ El promotor [ 25] - [28]. Con el fin de comprobar si la metilación del ADN desempeña un papel importante en estas interacciones, llevamos a cabo en vivo huella en el análisis tanto de adultos como Células Eritroides y linfocitos derivados del bazo. Como era de esperar, no significativas se observaron huellas en la células linfoides (datos no presentados). Del mismo modo, las huellas fueron también ausente en adultos normales Células Eritroides en la que γ es un promotor metilado. Por el contrario, cuando estos grupos metilo están ausentes, las huellas más fuertes tanto el GATA-1 y distal CP1/NF-Y (CCAAT recuadro) sitios de unión se observaron (Figura 3C]. Cabe señalar que estos elementos por sí mismos no contienen ningún CpG sitios, por lo que es poco probable que la unión es inhibida directamente por los grupos metilo. Más bien, parece que estas proteínas-DNA se impidió a la nucleosoma nivel local por metilación de las histonas mediada deacetylation.

Metilación del ADN en HPFH

En pacientes con persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH) la γ genes se expresan en niveles inusualmente alta en los adultos Células Eritroides [29]. Nuestros resultados sobre el papel de la metilación del ADN en este locus sugieren fuertemente que cualquiera que sea el mecanismo molecular en el origen de esta enfermedad, la activación de la γ-globina genes sólo sería posible si el promotor es demethylated. Con el fin de probar esta hipótesis, hemos preparado erythroblast culturas [30] de HPFH pacientes con diferentes lesiones genéticas, y luego ADN aislado de bisulfite análisis de la A y γ γ G genes. En condiciones normales de pro-erythroblasts, los 5 sitios CpG en la región promotora γ son totalmente metilado. En contraste, se observaron menores de metilación en los γ A (4 / 7) y γ G (5 / 34), promotores en un paciente heterocigotos para HPFH1 [31], [32] (Figura 4]. Esta pauta desequilibrada está de acuerdo con las mediciones que demuestran que estos pacientes también tienen un superior al índice normal de la A a la γ γ G expresión [32].

Bisulfite Similares resultados fueron obtenidos para pro-erythroblast ADN de un paciente con β ° Talasemia (IVS-II-I, G ⇑ A) [32] que expresa los altos niveles de γ G-globina, y en este caso hemos detectado masiva-bajo metilación casi exclusivamente a la promotora G γ (Figura 4]. Estos resultados son consistentes con los experimentos anteriores que muestran menores de metilación en un solo sitio de restricción en las regiones promotoras γ HPFH de los pacientes [33], [34]. Tomados en conjunto, estos resultados indican claramente que cualquiera que sea el mecanismo [35], [36] que participan en la mejora de γ transcripción de genes, cada uno de los casos de HPFH es probablemente asociado con cambios moleculares que pueden dar lugar a locales desmetilación o quizás acetilación de histonas en adultos Células Eritroides. En apoyo de esto, nos encontramos con que la metilación del ADN en realidad afecta unión a proteínas específicamente a la misma en los sitios γ promotor que son frecuentemente implicado en HPFH [28].

Discusión

En no-Células Eritroides, toda la globina locus se asocia con heterocromatina [37], [38] y envasado en un recipiente cerrado la cromatina conformación caracteriza por una falta de sensibilidad a DNaseI [10] y el calendario de replicación tardía [8]. Además, los promotores de llevar γ grupos metilo que se puso inicialmente en el momento de implantación y, a continuación, mantienen a través de divisiones celulares posteriores. Estos mecanismos aparentemente sirven para hacer el locus compacto y muy inaccesible a las proteínas nucleares como la RNA polimerasa y su basal factores de transcripción (Figura 2B]. Por esta razón, la síntesis de los promotores γ inicia con muy poca frecuencia. Genéticamente por la prevención del desarrollo normal regulada metilación del ADN en este sitio, hemos sido capaces de eliminar selectivamente una sola capa de protección, lo que permite la transcripción de maquinaria para aumentar la iniciación de la síntesis de RNA en el promotor de alrededor de 20 veces. Hemos demostrado anteriormente que esto se logra a través de metilo proteínas de unión a nivel local que se contrate histona deacetilasa [3]. Nuestros resultados sugieren fuertemente que, a falta de metilación, los auxiliares de represión capas, lo que evidentemente operan a través de mecanismos muy diferentes, no son capaces de lograr la histona deacetylation local.

Estudios anteriores habían demostrado que el locus globina humana está programada para ser activada regionalmente en Células Eritroides generados en las diferentes etapas de desarrollo. Esto es mediado por un aumento de la accesibilidad cromatina (DNaseI sensibilidad) a lo largo de todo el lugar [10], así como un cambio a principios de replicación momento [39], un cambio epigenético que también influye en la estructura la cromatina [40]. Como parte del proceso normal de los adultos erythroid diferenciación, la β-globina gen sufre desmetilación local [11], lo que probablemente constituye la última etapa necesaria para permitir la unión de erythroid transnacional que actúan factores de transcripción.

A pesar de que el γ-globina genes no sean objeto de desmetilación en adultos Células Eritroides y todavía están empaquetados con desacetilizado histonas, los cambios en la cromatina cis hacer estos genes sobre 10 6 veces más probabilidades de ser transcrita, pero esto aún no es suficiente para permitir la síntesis de γ-globina a niveles máximos. Al manipular el lugar a fin de que la γ Un gen es unmethylated, sin embargo, la última barrera de la represión se elimina y este gen puede interactuar con los fuertes factores de transcripción, ya presente en Células Eritroides, lo que permite cerca de los niveles máximos de la síntesis de RNA. Curiosamente, estos factores no reaccionan con similar β globina promotor elementos fetal Células Eritroides [26], sugiriendo fuertemente que este también puede ser debido a la metilación del ADN. De este modo, además de ser un mecanismo de represión basal no en Células Eritroides, metilación del ADN también funciona como un regulador selectivo en Células Eritroides. Desde metilación del ADN desempeña un papel similar en el sistema inmunológico [41], es posible que esto representa un general de ajuste mecanismo para controlar la expresión de genes dentro de las agrupaciones.

Varios estudios han demostrado que los síntomas en β-talasemia puede ser aliviado en parte por el tratamiento con desmetilación del ADN [42] o agentes de acetilación de histonas [43], presumiblemente por el logro de una mayor síntesis de γ-globina. Nuestros resultados proporcionan pruebas moleculares que metilación del ADN es, en efecto, el principal obstáculo para γ expresión en adultos Células Eritroides, y proporcionar el impulso para desarrollar más fármacos específicos para eliminar la metilación de promotores γ.

Materiales y métodos
Clonación

Los 120 bp es decir, desde el hámster Aprt de genes [21] se inserta como un dímero delimitadas por dos LOX elementos de ingeniería en un sitio de restricción PACI 40 pb río arriba a los humanos γ A-transcripción de genes de globina sitio web inicial (Figura 5]. El HindIII / XhaI fragmento fue clonado en el plásmido levadura integrador pRS306 que se inserta a continuación, por recombinación homóloga en humanos la β-globina-YAC albergar células de levadura A201F4.3 [18]. Las colonias fueron seleccionadas para el crecimiento en las placas que carecen de uracilo. La correcta integración fue verificado por análisis Southern blot. Las secuencias de plásmido fueron retirados por la inducción de "bucle" mediante el crecimiento en 5FOA y corregir la escisión fue verificado por análisis Southern blot.

Ratones transgénicos y el análisis de metilación

YAC ADN fue purificado de pulso de campo geles de acuerdo a protocolos estándar [44] e inyectadas en huevos fertilizados de ratón que fueron transferidos a madres adoptivas. Littermates se examinaban para ver si la β-globina YAC transgenes por PCR, y las muestras positivas verificadas por Southern blot. Los tres transgenes (líneas 47, 64, 113) utilizado para el análisis se comprobó que estaban completamente intacto y presente en una sola copia. Los fundadores fueron cruzadas con Cre [19] o Mx-Cre ratones [20]. Para eliminar el IE secuencias después de su nacimiento Mx-Cre X β-globina YAC F1 ratones fueron inyectados 4 veces con polyI-polyC (Sigma) en días alternos. MEFs (paso número 3-4) con un metilado γ Un gen se preparan a partir de embriones Cre. MEFs llevar una unmethylated γ Un gen se prepararon de Mx Cre ratones y luego transfectadas con un tipo 5-citomegalovirus Cre vector [45] para eliminar el IE elemento. Los patrones de metilación en Células Eritroides no fueron analizados, ya sea por Southern blot o bisulfite análisis de metilación como se describe [46]. Después del tratamiento, el ADN fue amplificado mediante la PCR primers adelante -1 (5'-TTGTTTGAAAGGGTTTTTGGTTAAATTTTATTT-3 ') e invertir-1 (5'-TCCTAATCACCAAAACCTACCTTCCCAAAA-3') y, posteriormente, con los cebadores anidados adelante -2 (5'-TTTTGGTTAAATTTTATTTATGGGTTGGTTAGTT -3 ') E invertir-2 (5'-AACTTATAATAATAACCTTATCCTCCTCTATAAAATA-3'). Los productos resultantes fueron clonados utilizando el pGEM-T Easy Vector System I kit (Promega) y las distintas colonias luego secuenciados. Los patrones de metilación en purificado Células Eritroides fueron analizados por la digestión con la metilación enzima de restricción sensible seguida de amplificación de PCR.

Semicuantitativo RT-PCR

Erythroblasts de hígado fetal y adulta de la CRE bazo o Mx-cre cruzaron ratones transgénicos fueron aisladas de MACS (Magnetic activado Cell Clasificador) con biotinilated α-ter119 anticuerpos (PharMingen). Fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) se obtuvieron a partir de Cre o Mx-cre cruzado 12,5 DPC embriones transgénicos. ARN fue extraído con TriPure Aislamiento reactivo (Roche), tratados (250 ng) con DNaseI (Promega) y convertido a cDNA utilizando la Molony virus de la leucemia murina la transcriptasa inversa (Promega) y al azar hexanucleotide pd (N) 6 primers (Pharmacia) en un volumen de reacción de 50 μ l en las condiciones recomendadas por el fabricante. 1 ó 3 μ l del cDNA se utilizó para las reacciones de PCR (95 ° C durante 1 min, 58 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min) en presencia de α 32 P dCTP (Amersham) utilizando los primers pares [47] . Estos primers fueron diseñados para abarcar el exón-intrón los cruces con el fin de distinguir entre cDNA y ADN genómico. RT-PCR fragmentos se separaron el 5% o 7% geles de poliacrilamida y expuestos por autorradiografía. La cantidad relativa de A y γ γ G cDNA fue definida por la digestión con la enzima de restricción PstI que sólo los recortes γ Un producto de PCR. El nivel de γ y β-globina se midió la transcripción de fósforo-el análisis de imágenes de diluirse tras la normalización de las muestras para Aprt.

Immunoprecipitation cromatina (CHIP)

Los núcleos se han preparado a partir de cultivos celulares o purificada ratón erythroblasts bazo, tratados con un inhibidor de HDAC (PMSF) y digerido por MNase (micrococcal nucleasa) para generar mono-nucleosomas que fueron separados en un gradiente de sacarosa [48]. Immunoprecipitation (IP) se llevó a cabo utilizando anti-histona H4 acetilado o contra mí-H3 (Lys4) anticuerpos (Upstate biotecnologías), y la obligada fracción purificada de la proteína A-Sepharose cromatografía (Sigma). Entrada y Encuadernación fracciones de ADN fueron analizadas por PCR semicuantitativo utilizando dos concentraciones. Primer secuencias están disponibles bajo petición.

En vivo footprinting

En vivo Sulfato de dimetil (DMS) y la ligadura de footprinting mediada por PCR (LMPCR) se realizó tal como se describe anteriormente [49], [50], salvo que la DMS in vivo se realizó el tratamiento en Células Eritroides en suspensión celular. En un 50 ml tubo cónico, 10-25 millones de células se suspendieron en 10 ml de medio de cultivo sin suero bovino. DMS se añadió a una concentración final de 0,2%, y las células fueron incubadas a temperatura ambiente durante 5 min. 40 ml de helado de PBS se añadió para detener la reacción DMS y las células fueron centrifugadas rápidamente (250 g, 3 min), lavado dos veces con 30 ml de helado de PBS antes de la preparación de ADN. Para el experimento LMPCR hemos diseñado el primer cebadores de tal manera que distinguir entre el G γ y LOX-P inserta γ A los promotores. Primer prórroga se llevó a cabo con cualquiera de las dos L1n: 5'-GCGTCTGGACTAGGAGCTTTTAAT-3 'o L1: 5'-AAGTAACGCATTTGCT GGAAG-3' (que incluye el elemento IE). Primer, L2: 5'-TTAATCTCAGACGTTCCAGAAGCGAGTGTG-3 'y LP25 primer linker fueron utilizados para la amplificación. El correr de hibridación sonda se realizó en la PCR fragmento L3: 5'-CAGAAGCGAGTGTGTGGAACTGCTGAA-3 '- U: 5'-AAAAAAATTAAGCAGCAGTATCCTCTTGGG-3' con el primer L3.

Nos gustaría dar las gracias a A. Rahat de asistencia en la preparación de los YACs utilizado en este estudio, Marianna Shvartsbeyn por su participación en las primeras etapas de esta investigación y Christos Kattamis y Swee-Lay Thein para proporcionar muestras clínicas.

Este documento está dedicado a la memoria de nuestra querida colaboradora, Mira Ariel, que inició estos estudios.