PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Células madre mesenquimales mediada por diente regeneración funcional en la especie porcina

Biblioteca Pública de la Ciencia
Wataru Sonoyama [1], Yi Liu [2], Dianji fang [2], Takayoshi Yamaza [1], Byoung-Moo Seo [4], Chunmei Zhang [2], Él Liu [5], Stan Gronthos [6], Cun-Yu Wang [7], Songtao Shi [2], Wang Songlin [1]
[1] Estados Unidos de América
[2] Pekín, China
[3] Okayama, Japón
[4] Seúl, Corea
[5] Pekín, China
[6] Adelaida, Australia del Sur, Australia
[7] Ann Arbor, Michigan, Estados Unidos de América
Resumen

Células madre mesenquimales mediada por la regeneración de los tejidos es un enfoque prometedor para la medicina regenerativa para una amplia gama de aplicaciones. Aquí mostramos una nueva población de células madre aisladas de la raíz papila apical de los dientes humanos (SCAP, las células madre de papila apical). Utilizando un modelo minipig, tanto humanos trasplantados SCAP ligamento periodontal y células madre (PDLSCs) para generar una raíz / periodontal complejo capaz de soportar una corona de porcelana, lo que resulta en la función normal del diente. Este trabajo integra una célula madre mediada estrategia de regeneración de tejidos, materiales de ingeniería para la estructura y las actuales tecnologías de la corona dental. Esta ingeniería de tejidos hibridizada enfoque dirigido a la recuperación del diente de la resistencia y la apariencia.

Introducción

La regeneración de una vida funcional y diente es una de las más prometedoras estrategias terapéuticas para la sustitución de un enfermo o dañado los dientes [1] - [3]. Los recientes avances en cirugía dental de células madre de la biotecnología y la mediada por células murinas diente de regeneración han alentado a los investigadores a explorar el potencial para regenerar los dientes que viven con propiedades funcionales adecuadas [4] - [6]. Murino dientes puede ser regenerada mediante diferentes a las células madre en colaboración forma las estructuras dentales en vivo [4], [5], [7]. Además, la dentina y la pulpa de tejidos y cemento / periodontal complejo se han regenerado de la pulpa dental humana de células madre (DPSCs) y el ligamento periodontal células madre (PDLSCs), respectivamente, cuando se trasplantaron en ratones inmunodeficientes [8], [9]. Sin embargo, debido a la complejidad de los dientes humanos el crecimiento y el desarrollo, la regeneración de toda una estructura dental incluyendo esmalte, dentina y pulpa complejo, y los tejidos periodontales como una entidad funcional en los seres humanos no es posible habida cuenta de las biotecnologías disponibles regenerativa.

La espacial y temporalmente organizada microambiente de la yema del diente y sus tejidos circundantes permite el crecimiento y el desarrollo de la corona y las raíces, lo que resulta en la formación y erupción de los dientes [10]. Raíz del desarrollo implica la formación de la dentina, cemento generación, la instrucción del epitelio, y la erupción del diente. Desde una perspectiva clínica, la parte más importante del diente es la raíz para que apoya a (natural o artificial) corona. La corona por sí sola no puede cumplir con la función normal del diente sin raíz viable. En contraste, la amplia utilización de coronas sintética para reemplazar a otro dañado coronas natural ha sido ampliamente aplicada en clínicas dentales, con excelentes resultados terapéuticos [11].

Aunque las terapias de implante dental han logrado el éxito a largo plazo en la clínica para la recuperación de la función del diente, los implantes dentales requieren pre-existentes de alta calidad ósea estructuras de apoyo a los implantes [12], [13]. Reconstrucción de dientes en pacientes sin un adecuado apoyo ósea sería un gran avance. Tallo mediada por células raíz regeneración ofrece oportunidades para regenerar un bio-raíz y sus asociados los tejidos periodontales, que son necesarios para mantener la función fisiológica de los dientes. El objetivo de este estudio es explorar la posibilidad de reconstruir un diente funcional en miniatura cerdos (minipigs), en el que un bio-raíz periodontal complejo es construido por las células madre postnatales incluyendo las células madre de raíz papila apical (SCAP) y PDLSCs, en el que una corona de porcelana artificial se adhiera. Este híbrido de estrategia autólogo de células madre dentales pueden ser la ingeniería aplicables a la regeneración de dientes humanos. Por otra parte, la restauración de dientes funcionales en la especie porcina puede arrojar luz sobre la regeneración de dientes humanos en el futuro debido a la estrecha similitud entre la peste porcina y humana los tejidos dentales [14], [15].

Resultados
El aislamiento y el trasplante de SCAP

El mecanismo de la contribución de tallo progenitores a raíz de formación aún no se ha dilucidado. En este sentido, hemos encontrado que los humanos raíz papila apical de tejido en el exterior de la zona raíz foramen demostrado positivos para la tinción de células madre mesenquimales molécula de superficie STRO-1 (Figura 1A]. La raíz papila apical podría contener una población de tallo / células progenitoras. Para identificar las células madre putativa, una sola célula suspensiones fueron generados a partir de humanos raíz apical de las papilas recogidos extrajeron los terceros molares de 18-20 años de edad de adultos voluntarios, a raíz de la colagenasa / dispasa digestión. Cuando cultivadas a baja densidad celular, formaron adherente clonogenic agrupaciones de células (UFC-M, unidad formadora de colonia, fibroblástica) (Figura 1B], similares a los observados mesenquimales de diferentes poblaciones de células madre. Para investigar el potencial de SCAP a someterse a odontoblastic / osteoblásticas diferenciación, colonia múltiples derivados de SCAP paso a dos de ellos fueron complementados con L-ascorbato-2-fosfato, dexametasona, fosfato inorgánico y de inducir a la mineralización in vitro, tal como se describe anteriormente [8], [ 9]. Pequeñas y redondas Alizarin Red-formado nódulos positivos en las culturas SCAP después de cuatro semanas de inducción, lo que indica acumulación de calcio in vitro (Figura 1C]. Por otra parte, SCAP cultivadas son capaces de diferenciar en otros tipos de células, como adipocitos (Figura 1D], análogo a DPSCs médula ósea y células madre mesenquimales (BMMSCs) [8].

Para validar la capacidad de SCAP para diferenciar en células funcionales dentinogenic, ex vivo ampliado-SCAP fueron transplantadas a ratones inmunodeficientes, con hidroxiapatita y el fosfato tricálcico (HA / TCP) como soporte. Una típica estructura de la dentina se regeneró, en la que una capa de tejido formado la dentina en la superficie de la HA / TCP junto con el tejido conjuntivo (Figura 1E]. La dentina recién formada fue positivo para anti-DSP tinción de anticuerpos, y la dentina de formación de las células teñidas con anti-humano de las mitocondrias de anticuerpos específicos (Figura 1F-H], lo que sugiere que los donantes procedentes humanos SCAP ha formado la dentina en vivo. A fin de prepararse para dental autólogo de células madre para la regeneración de dientes funcionales en la especie porcina, única colonia aislada derivada de la peste porcina SCAP y PDLSCs y trasplantados en ratones inmunodeficientes para regenerar la dentina y cemento, respectivamente (Figura 1i-1L], equivalente a la de SCAP humanos y PDLSCs.

A continuación abordó si SCAP y DSPCs son los mismos o distintos de células madre mesenquimales poblaciones, debido a que ambos expresaron osteo / odontogénico marcadores y generar tejido mineralizado cuando trasplantados en ratones inmunodeficientes. En primer lugar, hemos recogido SCAP y DPSCs de la misma diente humano y creció bajo condiciones exactamente igual. De acuerdo con un perfil de cDNA microarray comparación (datos no presentados), hay muchos genes expresados diferencialmente entre estas dos poblaciones de células madre. Entre estos genes, se seleccionaron survivin como un ejemplo, y confirmó su mayor expresión en SCAP por Western Blot (Figura 2A]. También se identificó que 24 CD como un marcador de superficie SCAP de análisis de citometría de flujo (Figura 2B]. Durante odontogénico diferenciación in vitro, SCAP perdido la expresión de CD24 con un registro actualizado, regulado expresión de la fosfatasa alcalina (ALP) (Figura 3B]. Además, SCAP mostraron una tasa significativamente mayor de bromodeoxyuridine (BrdU) la captación (Figura 2C], y mayor número de población doublings (Figura 2D]. El SCAP población también demostró una elevada capacidad de regeneración de tejidos (Figura 2E], el aumento de la actividad telomerasa que no sea la de DPSCs del mismo diente (Figura 2F], y una mejor capacidad de migración en un ensayo cero (Figura 2G], en comparación con el de DPSCs el mismo diente. Colectivamente, estos estudios sugirieron que SCAP son una única población de células madre postnatales distinta de DPSC.

Caracterización de moléculas de superficie de SCAP

Para caracterizar SCAP moléculas de superficie, hemos utilizado el análisis de citometría de flujo para demostrar que SCAP a paso 1 expresado muchos marcadores de superficie incluida STRO-1, ALP, CD24, CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, CD166 y ALP, pero fueron negativos para CD34, CD45, CD18 y CD150 (Figura 3A]. STRO-1 y CD146 han sido identificados como principios de células madre mesenquimales marcadores presentes en ambos BMMSCs y DPSCs [8], [16]. Aquí nos dimos cuenta de que CD24 parece ser un marcador específico para SCAP, no detectable en otras células madre mesenquimales incluidos DPSCs y BMMSCs (datos no presentados). En respuesta a la inducción osteogenic condiciones en la cultura, SCAP comenzar a abajo regular su expresión de CD24, mientras que la obtención de expresión ALP (Figura 3B]. Nuestra evidencia experimental sugiere que SCAP derivado de un tejido en desarrollo pueden representar una población de principios de progenitores que tienen ventajas para su uso en la regeneración de los tejidos.

Diente regeneración funcional

Identificación de SCAP brinda la oportunidad de perseguir la regeneración raíz utilizando este de alta calidad "jóvenes" postnatal con células madre derivadas de 18-20 años vounteers adultos. Para desempeñar un papel funcional in vivo, la raíz ha de conectar con el ligamento periodontal para garantizar la correcta posición de estabilidad y apoyo in situ. Por lo tanto, hemos utilizado tanto humanos SCAP y PDLSCs para generar la dentina y en un PDL HA / TCP transportista, con el fin de imitar un bio-fisiológicos raíz / periodontal set-up in vivo. Ocho semanas después del trasplante, el ser humano PDLSCs fueron capaces de formar cemento en la superficie de HA / TCP transportista y fibras de Sharpey, que se caracteriza histológicamente a las fibras de colágeno se han anclado en el cemento (Figura 4 A, B]. Estos datos sugirieron que el uso combinado de células madre mesenquimales poblaciones proporcionar una base para raíz / regeneración de los tejidos periodontales.

Para lograr la regeneración de dientes funcionales, hemos utilizado la peste porcina debido a las similitudes en la especie porcina orofaciales y tejidos humanos organización. Cerdo SCAP fueron cargados en una raíz en forma de HA / TCP bloque que contiene un puesto de canal interior del espacio para permitir la posterior instalación de una corona de porcelana (Figura 5A]. Un incisivo inferior se extrajo y la extracción de socket se limpian con una fresa quirúrgica que elimine las restricciones a los tejidos periodontales (Figura 5A]. La HA / TCP bloque que contiene SCAP fue revestido con Gelfoam (Pharmacia Canada Inc, Ontario, Canadá) que contiene PDLSCs y se incluirán en el zócalo y suturadas por 3 meses (Figura 5B-E]. CT examen reveló una HA / SCAP-Gelfoam / PDLSC estructura creciendo dentro del zócalo con mineralizado raíz-como la formación de tejido del ligamento periodontal y el espacio. La superficie del implante HA / SCAP-Gelfoam / PDLSC estructura quirúrgicamente se volvió a abrir en tres meses post-implantación, y un pre-fabricados de porcelana corona minipig parecido a un incisivo y se insertó cimentado en el pre-post canal formado en el interior de la HA / TCP bloque (Figura 5F-H]. Después de sutura quirúrgica de la apertura, la corona de porcelana se mantiene in situ y se somete al proceso de diente función durante cuatro semanas (Figura 5I, J]. CT y análisis histológico confirmó que la raíz / periodontal estructura ha regenerado (Figura 5K-M]. Por otra parte, recientemente formada bio-raíces demostrado una significativa mejora de la compresión que el de la original HA / TCP transportistas después de seis meses de implantación (Figura 5N]. Estos hallazgos sugieren la viabilidad de utilizar una combinación de la autotransfusión SCAP / PDLSCs en relación con coronas dentales artificiales para la regeneración de dientes funcionales.

Discusión

En general, se considera que la papila dental contribuye a la formación dentaria y, finalmente, se convierte en tejido de la pulpa dentro de la cámara pulpar. En este estudio, encontramos que el origen papila apical figuran las células madre mesenquimales que parecen tener una mayor capacidad de regeneración de dentina DPSCs. Estos hallazgos sugieren que el desarrollo de tejido puede contener un buen recurso de células madre para la regeneración de los tejidos. SCAP representan una novela de población de células madre pluripotentes, como lo demuestra su capacidad para desarrollar en odontoblast-como adipocitos y células in vitro. Esta población celular se encontró a expresar altos niveles de telomerasa y survivin, que son importantes moléculas mediadoras en la proliferación celular. Además, CD24, marcador de SCAP indiferenciado, que es downregulated siguientes odontogénico diferenciación. Estos datos apoyan la idea de que SCAP son una única población de células madre postnatales.

Aunque la pulpa dental contiene DPSCs con la dentina y la pulpa capacidad regenerativa, el desarrollo de tejidos derivados de SCAP mostró un superior potencial de regeneración de tejidos que no sea la de DPSCs. SCAP recogidos de un solo diente son capaces de proporcionar un gran número de células madre probablemente suficiente para trasplantes humanos, porque tienen un alto potencial proliferativo, que se refleja en alta actividad telomerasa [17]. SCAP Humanos mediada por la regeneración de los tejidos pueden ofrecer una prometedora base de células para la terapia de regeneración raíz.

Dado que la mayoría de los tejidos humanos en la etapa de desarrollo no es clínicamente disponible para el aislamiento de células madre, este papila apical de células madre de población, accesible en la práctica clínica dental, es inusual. SCAP puede aislarse de la sabiduría extrajeron los dientes. Por lo tanto, puede ser posible que estos bancos de alta calidad dental células madre para uso autólogo futuro. Su supervivencia a la congelación-descongelación requiere la exploración. Alogénico las células puede ser otra fuente de células madre para el tratamiento de los individuos de edad que ya han han tenido la sabiduría de sus dientes extraídos, sin embargo, la inmunogenicidad de estas células requiere un estudio más a fondo.

Aunque recién formado raíces bio-muestran una menor resistencia a la compresión que no sea natural de la especie porcina raíz dentina, que parecía capaz de soportar la corona de porcelana y dio lugar a las funciones normales. Tal vez sea posible mejorar la resistencia a la compresión y la dureza de la bio-raíces de la selección óptima de la bioingeniería y materiales mediante la optimización de los implantados con células madre número y la calidad. Tallo mediada por células raíz regeneración hibridada con corona clínica tecnología puede ser un enfoque prometedor para la restauración de dientes funcionales debido a la disponibilidad de alta calidad dental células madre para el trasplante autólogo, así como larga experiencia clínica con los procedimientos de implantes dentales. Además, la región orofacial es un sistema abierto para la prestación directa de las células madre para la ingeniería de tejidos. Nuestros estudios demuestran que minipigs ofrecen un excelente modelo para la traducción del concepto funcional de la regeneración de dientes y la viabilidad de la utilización autóloga de células madre para trasplantes.

Materiales y Métodos
Sujetos y cultivo celular

Humano normal terceros molares impactados (n = 18) fueron recogidos de dieciséis adultos (18-20 años de edad) en la Clínica Dental del Instituto Nacional de Odontología y de Investigación Craneofacial (NIDCR) aprobado en virtud de las directrices establecidas por NIH Oficina de Sujetos Humanos de Investigación y la Universidad del Sur de California IRB. Papila apical raíz se separa suavemente de la superficie de la raíz, picada y digeridos en una solución de 3 mg / ml de colagenasa tipo I (Worthington bioquímicos Corp, Freehold, NJ) y 4 mg / ml dispasa (Roche Diagnostic / Boehringer Mannheim Corp ., Indianapolis, IN) durante 30 minutos a 37 ° C. Única de suspensiones de células SCAP se obtuvieron al pasar por una participación del 70 μ m colador (Falcon, Labware BD, Franklin Lakes, NJ), sin semillas a 1 × 10 4 cm en 10 platos de la cultura (Costar, Cambridge, MA), y cultivadas con alfa - Modificación de Eagle's Medium (Gibco / Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con un 15% de SFB (Equitech-Bio Inc, Kerrville, Texas), 100 μ M de ácido L-ascórbico 2-fosfato (Wako, Tokio, Japón), 2 mM L - glutamina (Biosource / Invitrogen), 100 U / ml penicilina y 100 μ g / ml estreptomicina a 37 ° C en el 5% de CO 2. Para evaluar formadoras de colonias eficiencia, el día 10 culturas fueron fijadas con formol al 4%, y luego teñidas con 0,1% de azul de toluidina. Agregados de células ≥ 50 se anotó como colonias. La tasa de proliferación de sub-culturas confluyentes (primer paso) de SCAP se evaluó la incorporación de BrdU de 6 horas, utilizando tinción BrdU Kit (Zymed / Invitrogen). Condiciones para la inducción de la acumulación de calcio como se informó anteriormente [18]. Acumulación de calcio se detectó en un 2% Alizarin Red S (pH 4.2) coloración. La inducción de adipogenesis fue como se informó anteriormente [8]. DPSCs y PDLSCs fueron aisladas y cultivadas como anteriormente se ha descrito [8], [9]. En algunos experimentos, SCAP, DPSCs, y PDLSCs se obtuvieron del mismo donante o donantes. Todas las células primarias utilizadas en este estudio se encontraban en 1-3 pasajes. Para cada experimento, el mismo paso de SCAP, DPSCs, y PDLSCs se utilizaron.

Los anticuerpos

Conejo incluyen anticuerpos anti-HSP90 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA); anti-Cbfa1 (EMD Biosciences, Inc, San Diego, CA); anti-humano-concreto las mitocondrias (Chemicon, Temecula, CA). Mouse incluyen anticuerpos anti-survivin (Santa Cruz Biotechnology, Inc); anti-DSP (LF-21) (Dr. Larry Fisher, NIDCR / NIH); anti-CD146 y STRO-1 (Dr. Stan Gronthos, del Instituto de Medicina y Veterinaria, Australia). Conejo y isotipo murino con ajuste de control negativo de anticuerpos se obtuvieron a partir de Caltag Laboratories (Caltag / Invitrogen). Para el análisis de citometría de flujo, R-PE monoclonal conjugado con anti-humano anticuerpos incluyen: CD14, CD18, CD24, CD29, CD34, CD35, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, CD150, CD166 fueron adquiridos de Pharmingen / BD Bioscience (San Jose, CA) y monoclonal anti-humano ALP fue de hibridoma Bank (Universidad de Iowa, Iowa).

Transplantation

Aproximadamente 4,0 × 10 6 de in vitro ampliado SCAP, DPSCs, PDLSCs y se mezclaron con 40 mg de HA / TCP partículas de cerámica (Zimmer Inc, Varsovia, IN) y luego trasplantado por vía subcutánea en la superficie dorsal de 10 semanas de edad, inmunocomprometidos beige ratones (NIH-bg-nu/nu-xid, Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, IN) tal como está descrita anteriormente [8], [9], [18], [19]. Estos procedimientos se realizaron de conformidad con las especificaciones de los protocolos aprobados animal (NIDCR # 04-317 y USC # 10874). Los trasplantes se recuperaron después de 8 semanas, fijado con formol al 4%, descalcificadas con tamponado 10% EDTA (pH 8,0) y, a continuación, embebidos en parafina. Secciones deparaffinized y fueron teñidas con H & E.

Inmunohistoquímica

Deparaffinized secciones se sumergieron en un 3% de H 2 O 2 / metanol durante 15 minutos para saciar la actividad de peroxidasa endógena, e incubadas con anticuerpos primarios (1:200 a 1:500 de dilución). Isotipo con ajuste de control de anticuerpos fueron utilizados en las mismas condiciones durante 1 hora. Por enzimática tinción inmunohistoquímica, Zymed polímeros SuperPicTure kit de detección (Zymed / Invitrogen) se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, las secciones se counterstained con hematoxilina.

Actividad telomerasa

Actividad telomerasa en SCAP, DPSCs y BMSSCs se detectó mediante el uso de términos cuantitativos telomerasa kit de detección (Allied Biotech, Inc, Ijamsville, MD), con arreglo a la fabricación del protocolo de PCR en tiempo real. En pocas palabras, la telomerasa en las células extracto de 1 × 10 5 células de SCAP, DPSCs, o BMSSCs añadido telomérica repite (TTAGGG) en el extremo 3 'del sustrato y de oligonucleótidos iQ SYBR Green Supermix (BioRad Laboratories, Hercules, CA), y amplificado con una iCycler iQ PCR en tiempo real de máquinas (BioRad Laboratories). La PCR productos generados son detectados directamente por la medición del aumento de fluorescencia causada por unión de SYBR Green a doble vertiente de ADN y se calculará utilizando un software iCycler iQ (BioRad Laboratories). Algunos extractos de células se calienta a 85 ° C durante 10 minutos y se utiliza para control negativo. La PCR en tiempo real condición es la siguiente; telomerasa reacción durante 20 minutos a 25 ° C, PCR inicial de activación paso durante 3 minutos a 95 ° C, 3 etapas de ciclismo; desnaturalización durante 10 segundos a 95 ° C, recocido durante 30 segundos a 60 ° C, la extensión durante 3 minutos a 72 ° C, y el ciclo número 40 ciclos.

Población de duplicación

SCAP y DPSCs se cultivaron en baja densidad a única forma de células derivadas de las colonias y, a continuación, fueron sembradas y trypsinized a una densidad de 0,5 x 10 4 células en 100 mm cultura platos en el primer paso. Al llegar a confluencia, las células fueron sembradas trypsinized y al mismo densidad de las células. La población se calculó duplicar en cada paso de acuerdo con la ecuación: log 2 (el número de células recolectadas y el número de células sembradas). La población finita doublings fueron determinados por acumulativo Además de las cifras totales generados por cada paso hasta que la división de las células dejado [20]. Los criterios para la senescencia celular que son las células no se dividen por un mes en la cultura y que más del 60% de las células se tiñen positivo para beta-galactosidasa [18].

Análisis de citometría de flujo

El procedimiento de análisis de citometría de flujo se realizó como se describió anteriormente [16]. En resumen, las células fueron trypsinized, y aproximadamente 2 × 10 5 células se pildoradas a 5 mL tubos de polipropileno (BD Bioscience). Ellos fueron tratados con 5% al calor de SFB inactivado, 1% BSA (ICN Biomedicals, Inc, Aurora, OH) y un 5% de suero humano normal (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc, West Grove, PA) en HBSS (Gibco / Invitrogen) durante 30 minutos en hielo para no bloquear sitios de unión específicos. Por STRO-1 y ALP manchas, algunas de las células fueron incubadas con 100 μ l de STRO-1 sobrenadante (mouse IgM anti-humano STRO-1) [16] o el ratón 1 IgG anti-humano hueso / hígado / riñón ALP (hibridoma Banco) durante 45 minutos en hielo. Tras el lavado con un 5% al calor de SFB inactivado en HBSS a 4 ° C, se reaccionó con R-PE de cabra conjugado con F (ab ') 2 anti-ratón IgM (μ cadena específica) (Biosource / Invitrogen) o anti-mouse IgG (H + L) (Sur de Biotecnología Associates, Inc, Birmingham, AL) durante 30 minutos en hielo. Para la tinción de CD24, las células fueron tratadas con 1 μ g de R-PE ratón conjugado IgG anti-1 mouse CD24 (BD Bioscience) durante 45 minutos en hielo. Como controles negativos, algunas de las células fueron incubadas con 1 μ g de la no-inmune del ratón IgM (sur de Biotecnología Associates, Inc) o IgG 1 (BD Bioscience). Después de lavar, todas las celdas fueron ordenados en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Bioscience) 10000 mediante la recopilación de acontecimientos, y se analizaron por medio de un software Cell Quest (BD Bioscience).

Modelo de la peste porcina

Seis puras minipigs masculino (4-8 meses de edad, con un peso de 20-40 kg) se obtuvieron del Instituto de Ciencia Animal de la Universidad de Agricultura chino. A esta edad, minipig incisivos están todavía en desarrollo. Minipigs se mantuvieron bajo condiciones convencionales con libre acceso al agua y el suministro regular de alimentos blandos. Este estudio fue revisado y aprobado por el Cuidado de Animales y el Empleo de Comisiones Capital Universidad de Ciencias Médicas y el Instituto de Odontología y de Investigación Craneofacial. Minipigs se anaesthetized con una combinación de cloruro de ketamina (6 mg / kg) y xylazina (0,6 mg / kg) antes de la cirugía. Minipig SCAP y PDLSCs fueron aisladas y cultivadas de la misma como humanos SCAP y PDLSCs como se mencionó anteriormente.

Western Blot

Primaria anticuerpos fueron utilizados en diluciones que van desde 1:200 a 1:1000. Western blot análisis se llevaron a cabo como se informó anteriormente [18], [21].

Resistencia a la compresión de medición

Resistencia a la compresión se puso a prueba por la fuerza H5KS tipo test con sistema de carga de 1mm/min (Tinius Olsen H5KS máquina de ensayo, Tinius Olsen, SA, Estudio, Reino Unido). Un recién formado bio-raíz se cosechó seis meses después de trasplante, y dividido en tres piezas. Resistencia a la compresión de cada pieza se midió por separado. Resistencia a la compresión de raíces naturales minipig y original HA / TCP transportistas También se midieron (n = 5, en cada grupo).

Análisis Estadístico

"T" de Student se utilizó para analizar las diferencias entre los grupos. - Una forma repetida ANOVA seguido de Scheffe de comparación se utilizó para comparar los datos de tres o más grupos. Valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Todos los datos estadísticos se presentan como media ± desviación estándar (n = 5).

Agradecemos a los Dres. Kenneth Yamada, Silvio Gutkind, Vyomesh Patel, y Larry Fisher de NIDCR / NIH para proporcionar asesoramiento científico y apoyo para este estudio. Damos las gracias a hibridoma Bank (Universidad de Iowa, Iowa) para proporcionar ALP anticuerpos para este estudio.