PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Papel Fundamental de Methylglyoxal y la edad en Micobacterias-Induced Apoptosis del macrófago y de activación

Biblioteca Pública de la Ciencia
Helmy Rachman [1], Nayoung Kim [1], Timo Ulrichs [1], Sven Baumann [1], Lydia Pradl [1], Ali Nasser Eddine [1], Matthias Bild [1], Marion Rother [2], Ralf Kuban-Jürgen [3], Lee Jong Seok [1], Robert Hurwitz [4], Volker Brinkmann [4], de George A. Kosmiadi [5], Stefan HE Kaufmann [1]
[1] Berlin, Alemania
[2] Berlin, Alemania
[3] Berlin, Alemania
[4] Berlin, Alemania
[5] Moscú, Federación de Rusia
Resumen

La apoptosis y la activación de macrófagos juegan un papel importante en el país de acogida respuesta a la infección micobacteriana la participación de TNF-α como un mediador crítico autocrina. Los mecanismos subyacentes son todavía mal definida. En este sentido, muestran niveles elevados de methylglyoxal (MG), una pequeña molécula reactiva y que por lo general es una fisiológico producto de diversas vías metabólicas y avanzado glycation productos finales (AGE) durante la infección por micobacteria de los macrófagos, dando lugar a la apoptosis y la activación de macrófagos. Por otra parte, demostrar abundantes AGE en lesiones pulmonares de la tuberculosis (TB) de los pacientes. Mundial de perfiles de expresión génica de MG-macrófagos tratados reveló una diversa gama de funciones inducida por MG, incluyendo la apoptosis y la respuesta inmune. Nuestros resultados no sólo proporcionan primera evidencia de la participación de MG y AGE en la tuberculosis, sino también formar una base para la novela de estrategias de intervención contra las enfermedades infecciosas en el que MG y AGE desempeñan papeles críticos.

Introducción

La tuberculosis (TB) representa una grave amenaza para la humanidad, causando aproximadamente 2 millones de muertes cada año. En la mayoría de las personas infectadas con el Mycobacterium tuberculosis (MTB), los bacilos provocar a largo plazo la infección asintomática denominado TB latente durante el cual persisten los bacilos dentro de granulomas en una etapa latente. Latente las personas infectadas tienen una ca. 10% de riesgo de progresión de la enfermedad clínica a lo largo de su vida [1], [2].

Dentro de granulomas, los macrófagos se someten a apoptosis, que participa en la defensa de acogida contra la tuberculosis [3], [4]. Correlación entre la apoptosis y la virulencia y persistencia de las micobacterias sigue siendo controvertido. Virulenta MTB se han descrito para inducir la apoptosis más profunda en los macrófagos y células dendríticas in vitro más atenuados Mycobacterium bovis BCG (BCG) [5]. Sin embargo, las pruebas también se ha presentado MTB que atenúa la apoptosis de células de acogida en los macrófagos infectados a través de la inducción de mecanismos antiapoptótico y / o upregulation antiapoptótico de los genes [6] - [8]. Así, aunque la repercusión exacta de MTB en la apoptosis sigue sin estar clara, un papel de la apoptosis en la protección contra, y la patogénesis de la tuberculosis es probable.

La apoptosis puede ser inducida por diversos físicas y químicas insultos. Estudios recientes revelaron que methylglyoxal (MG) induce la apoptosis en una celda de tipo dependen de manera [9] - [11]. La citotoxicidad de MG implica apoptosis. MG induce la apoptosis en células Jurkat por la activación de c-Jun N terminal quinasa (JNK) vía de transducción de señales, lo que disminuye el potencial de membrana mitocondrial, seguido por la caspasa-3 de activación [11]. En cultivos de células HUVEC, MG tirosina induce la fosforilación y agregación de un número de proteínas celulares [12]. En la aorta VSMC de ratas hipertensas, niveles elevados de MG y avanzado glycation productos finales (AGE) se encuentran, en paralelo con pruebas de que MG aumenta el estrés oxidativo, activa el NF-κ B, y aumenta la ICAM-1 de expresión [13]. MG proteínas pueden modificar rápidamente y causar entrecruzamiento, probablemente cambiar las propiedades de estas proteínas y, por tanto, desencadenando respuestas intracelulares. Abordo y Thornalley demostrado que MG-modificados albúmina sérica humana (HSA-MG) induce una mayor expresión de TNF-α en humanos Monocytic THP-1 células [14]. En conjunto, estos estudios sugieren que la MG-modificados proteínas juegan un papel interesante en el desarrollo de distintas enfermedades.

Resultados de la expresión génica global de análisis de MTB aisladas de TB pulmonar activa indican que el tejido entorno de MTB en vivo, sobre todo en las lesiones granulomatosas, es rica en MG [15]. Dado que un número significativo de macrófagos en estas lesiones se someten a apoptosis [3], la hipótesis de que los niveles de MG en los macrófagos apoptóticos determinar los acontecimientos durante la infección micobacteriana. Para impugnar esta hipótesis, que mide los niveles de MG en los macrófagos durante la infección por micobacteria, que se caracteriza MG-inducida por la apoptosis, y comprobado la relación entre niveles elevados de MG / AGE y las funciones de los macrófagos durante la infección micobacteriana. Nuestros resultados apuntan a una estrecha interrelación entre MG / AGE y la apoptosis, así como la activación de los macrófagos durante la tuberculosis.

Resultados y Discusión
La infección por micobacterias de macrófagos desencadena el aumento de la producción de MG

Nuestra gama de ADN resultados sugieren que el medio ambiente de tubérculo bacilos en los sitios de infección es rico en aldehídos, especialmente MG [15]. Para verificar la hipótesis de un MG-rico medio ambiente durante la infección por micobacteria de pulmón, infectados MH-S células ex vivo con micobacterias y medido los niveles relativos de MG en estas células. MH-S son células murinas una macrófagos alveolares derivados de línea celular. Macrófagos alveolares juegan un papel fundamental en la inicial respuesta inmune innata contra la infección del tubérculo bacilos a través de las vías respiratorias [1]. Por otra parte, las recientes pruebas revelan que los macrófagos alveolares son capaces de montar adecuada respuesta inmune [16]. Hemos observado que los niveles de MG aumentado significativamente en MH-S células de 1 día después de la infección por micobacteria, determinado por HPLC (figuras S1a-C). En tres experimentos independientes, los niveles de MG se 2.0-3.7 veces mayor en micobacterias-macrófagos infectados, en comparación con noninfected macrófagos. Este nivel de aumento es comparable a la in vitro inducida por la hiperglucemia y en la sangre de pacientes diabéticos [17], [18].

Estos resultados demuestran por primera vez que los niveles son MG aumentó significativamente durante la infección por micobacteria de macrófagos. En general, MG es un producto fisiológico de diversas vías metabólicas, incluidas las glycolysis anaeróbicas, la descomposición oxidativa de los ácidos grasos poliinsaturados, así como la fragmentación de triosephosphate o catabolismo de cuerpos cetónicos y treonina. MG, 3-deoxyglucosone (3-DG), y glyoxal (GO) se forman durante cada etapa del proceso glycation de la degradación de la glucosa o de Schiff de la base a principios de glycation, o productos de Amadori como fructosamine en las etapas intermedias de glycation [ 19], [20]. MG niveles en las células están reguladas por varios factores, incluyendo la glyoxalase sistema y otros componentes que influyen en la vía glycolysis. El sistema glyoxalase enzima en células eucariotas, que comprende glyoxalase I y II, es el principal responsable de desintoxicación de MG [21] - [23]. El aumento de los niveles de glucosa o de privación de fosfato en el citoplasma puede inducir la producción de MG interferir con la vía glycolysis [24]. Por lo tanto, es posible que la infección por micobacteria de macrófagos desencadena cambios en estas vías metabólicas que lleve a una mayor producción de MG. No podemos excluir formalmente micobacterias que contribuyen directamente al aumento de los niveles de MG macrófagos infectados. Por ejemplo, los radicales de oxígeno reactivas producidas durante la infección por micobacteria Mayo oxidar ácidos grasos poliinsaturados, que representan abundantes componentes de la pared celular micobacteriana, con miras a su descomposición y la formación de MG. Por otra parte, nuestros datos de microarrays de los pacientes con tuberculosis pulmonar indican que las experiencias MTB privación de nutrientes en los lugares de la tuberculosis pulmonar [15]. Esas condiciones pueden alterar MTB vías metabólicas conducen a la formación de MG. Debido a su muy reactivos y los pequeños molecular naturaleza, puede fácilmente MG difuso de células micobacteria en las células huésped.

Mg induce la apoptosis en MH-S células

En un intento por desentrañar la función de MG durante infección por micobacteria, que evaluó si MG desempeña un papel en la apoptosis de infectados MH-S células. Básicamente dos observaciones apoyan este concepto. En primer lugar, MG induce la apoptosis en diferentes líneas celulares [11], en segundo lugar, formación de granulomas es acompañada por la apoptosis de macrófagos [3]. En consonancia con esto, una alta proporción de células apoptóticas se encontró en el lavado broncoalveolar de pacientes con reacción o la tuberculosis diseminada [25]. Modelos in vitro han demostrado que las micobacterias causa apoptosis y la apoptosis de macrófagos de acogida se ha reivindicado a limitar el crecimiento de micobacterias intracelulares [ 6].

En consecuencia, lo primero que investigó la capacidad de MG para inducir apoptosis en MH-S células. La apoptosis se produjo en esta línea celular, según la evaluación de la tinción de ADN cromosómico con yoduro de propidio (PI), seguido por celular usando el análisis FACScalibur citómetro de flujo (figuras 1a y S2). El porcentaje de células apoptóticas llegaron a un máximo de MG una concentración de 0,8 mm. En una MG concentración de 1,6 mM la proporción de células apoptóticas disminuido. Una posible explicación de esta observación es que MG induce necrosis profunda en lugar de la apoptosis en MH-S células en esta alta concentración, como se observó recientemente en células Jurkat [11]. Por otra parte, a esta alta concentración de MG desencadena el crecimiento de detención en la fase G1 a MH-S células que se informó anteriormente para otros tipos de células [10]. Hemos observado el aumento de la externalización de phosphatidylserine, como una señal temprana de la apoptosis 4 h después de MG tratamiento (Figura S3], indicando que las señales de apoptosis inducida antes de este tiempo.

JNK desempeña un papel importante en los procesos de apoptosis [26] - [28]. La inducción de la apoptosis de MG ha sido correlacionado con la activación de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) [11]. Para examinar la apoptosis vía de tratados MG-MH-S células, proteínas totales de MG-MH tratados-S células fueron aisladas en diferentes puntos de tiempo tras el tratamiento y JNK, caspasa-3 y caspasa-9 se determinó la activación. JNK se activa tan pronto como 1 h después de MG tratamiento y esta activación se mantuvo durante 2 h. Caspasa-3 y caspasa-9 de activación se produjo después de 4 h MG tratamiento (Figura 1B].

La activación de JNK puede ocurrir anterior o posterior a la activación de caspasa. Cuando JNK activación precede a la caspasa activación, por lo general es necesaria para la apoptosis. Esto es particularmente relevante cuando las células son expuestas a insultos causada por diversos agentes químicos, irradiación, o la oxidación [29], [30]. Nuestros resultados sugieren que la activación de JNK precede a la aparición de la apoptosis, e inicia una cascada de señalización intracelular en la preparación de la apoptosis inducida por MG en MH-S células. Llegamos a la conclusión de que JNK activación es necesaria para MG-inducida por la apoptosis de MH-S células. Nuestros resultados concuerdan con los informes anteriores [11], la ampliación de la inducción de apoptosis-potencial de esta pequeña molécula de macrófagos alveolares.

El aumento de los niveles de edad en Micobacterias-macrófagos infectados

Bajo condiciones fisiológicas, la mayoría de MG se ve obligada a las proteínas celulares como aductos formados con Lys, Arg, Cys y residuos. Aunque la reacción con Cys se considera reversible, las concentraciones elevadas de MG puede modificar irreversiblemente Lys y Arg residuos a través de la formación AGE. AGE puede mejorar la formación de radicales de oxígeno, con la consiguiente activación de NF-κ B, y la liberación de citoquinas proinflamatorias [31], [32]. EDAD mitogen puede estimular la activación de la proteína-quinasa (MAPK), el activador de la proteína-1 (AP-1), e inducir la expresión de la transformación de crecimiento β1 (TGF-β1) y de matriz extracelular (ECM), proteínas [33], [34]. Por lo tanto, es concebible que los niveles abundantes MG presentes durante la infección por micobacteria de macrófagos conducir a la formación de AGE distintas proteínas, que a su vez desencadenar cambios en la expresión génica global. En la hiperglucemia, aumento de los niveles de MG van acompañados de elevados EDAD formación [17]. Hemos observado abundante durante EDAD infección por micobacteria de macrófagos (Figura 2A]. Más importante aún, hemos detectado la edad en las lesiones de tuberculosis de los pacientes. Figura 2B muestra un espécimen histológico de lesión pulmonar de un paciente con TB. EDAD colocalizes tinción con la acumulación de macrófagos lo que sugiere que los macrófagos son una de las principales fuentes de edad en la tuberculosis activa. De este modo, la formación y acumulación de edad se produce en la tuberculosis. Hasta hace poco, el aumento de AGE formación ha sido mayormente asociados con la diabetes, insuficiencia renal, el envejecimiento y el cáncer [35]. Por lo tanto, nuestra observación se extiende la función de la edad para las enfermedades infecciosas crónicas como la tuberculosis y, por tanto, proporciona nuevos conocimientos sobre la inmunidad contra regional, y la patogénesis de una infección bacteriana crónica.

Micobacterias inducida por apoptosis Requiere MG y AGE

Glutatión reducido (GSH) actúa como cofactor del sistema glyoxalase y cataliza la conversión de MG a D-lactato. MG nonenzymatically se une a la formación de GSH hemithioacetal, que a su vez sirve de sustrato para glyoxalase I (GLO1). Glyoxalase II (GLO2) hidroliza el producto de la GLO1-reacción catalizada, SD-lactoylglutathione a D-lactato. GSH es también un conocido antioxidante, que neutraliza los radicales oxidantes, entre ellas radicales de oxígeno. En virtud de diversas condiciones experimentales, la inducción de la apoptosis está precedida por un aumento de radicales de oxígeno intracelular [9]. MG pueden inducir la generación de radicales de oxígeno reactivo a través de múltiples vías [36] - [38] y estos radicales contribuir a apoptosis inducida por los acontecimientos de MG [39]. Nos muestran que la preincubación de macrófagos con GSH reducido EDAD formación después de la infección con micobacterias (Figura 3A]. Al mismo tiempo se observó una reducción significativa en la apoptosis (Figura 3B]. Se obtuvieron resultados similares para MG-macrófagos tratados, que había sido preincubated con GSH (Figura 3C]. Este hallazgo sugiere que las micobacterias inducida por la apoptosis de macrófagos implica elevados niveles de edad.

MG modula la expresión de la apoptosis-y de la respuesta inmune relacionados con los genes

En un esfuerzo por desentrañar el mecanismo (s) de la apoptosis inducida por MG, hemos realizado mundial de perfiles de expresión génica de MG-macrófagos tratados. MG inmediatamente después de los tratamientos (30 min), un grupo de genes implicados en la apoptosis inducida (Cuadros S1-6) y muchos de estos son cada vez más se expresó en otro momento puntos. TNF-α se indujo a todos los puntos temporales analizados confirmando informes anteriores de que MG y AGE puede inducir TNF-α producción [14]. El aumento de la transcripción de TNF-α fue acompañado por un alto nivel de TNF-α proteína en sobrenadantes de macrófagos tratados con MG (Figura 4A]. Además, varios genes asociados con TNF-α, como TRAF1, TRAF2, y los miembros del TNF-α superfamilia de receptores también fueron inducidos (Cuadros S1-6). La expresión de algún daño en el DNA de los genes inducibles, como DDIT3 y GADD45G fue muy elevada, lo que indica que MG directa o / e indirectamente causa daño en el DNA como un rasgo característico de la apoptosis (Cuadros S1-6).

En particular, MG no sólo inducir la apoptosis relacionadas con genes, sino también un gran número de genes relacionados con la activación de macrófagos y la inducción de inmunidad. Además de TNF-α, una serie de genes pertenecientes a las quimioquinas y citoquinas familias (ligandos y receptores) fueron inducidos (Cuadros S1-6). Entre altamente quimiocinas son inducidas CXCL2 y CXCL10, que son muy abundantes en granulomas pulmonares inducidas por micobacterias [40]. La alta expresión de CXL10 fue confirmada por tiempo real RT-PCR (Tabla S7] y ELISA (Figura 4B]. Por otra parte, en tiempo real de RT-PCR resultados mostraron que el tratamiento previo de macrófagos con GSH reducido la inducción de los genes correspondientes (cuadro S7]. Esto indica directamente la participación de MG en la inducción de estos genes.

Granulomas de pulmón representa el sello distintivo de la tuberculosis pulmonar y el foco principal para las continuas interferencias entre MTB y células inmunes [41]. Inducción de la inmunidad implica elaborar las interacciones entre citocinas y quimiocinas producidas por las células inmunitarias, así como las células del tejido local [40], [41]. TNF es un jugador fundamental en la formación de granulomas [42], [43]. TNF-deficiencia de ratones infectados con MTB son altamente susceptibles a las enfermedades, y la formación de granulomas se ve gravemente afectada [42]. Terapéuticas neutralización de TNF en la artritis reumatoide, los pacientes con infección latente MTB se asocia con mayor riesgo de reactivación de tuberculosis [44]. Por lo tanto, teniendo en cuenta el gran número de genes relacionados con citocinas y quimiocinas, la expresión de que está fuertemente regulada por MG, sugerimos que MG y AGE desempeñar papeles clave en la inmunidad a la tuberculosis con un enfoque en la lesión granulomatosa. Esta hipótesis está apoyada por el hecho de que más del 70% de los genes, que son objeto de regulación por MG (este estudio), regular de manera similar a granulomas de MTB-ratones infectados (Tracy Walker, comunicación personal).

Nuestro mundial de perfiles de expresión génica de MG-macrófagos tratados reveló que MG efectos la expresión de numerosos genes, muchos relacionados con la apoptosis, la activación, y la inmunidad. Por otra parte, parece MG efecto genes asociados con la regulación del crecimiento celular. El sistema glyoxalase y MG se han propuesto como los principales reguladores de la división celular basada en su ubicua presencia y la alta reactividad de MG con celulares subyacentes thiols la división celular [45], [46]. En suma, nuestros experimentos revelaron numerosos papeles de la pequeña molécula MG en diversos eventos celulares. Entender el mecanismo (s) que participan en estos eventos puede servir de base para el diseño de nuevas estrategias de intervención contra las enfermedades infecciosas en el que MG y la edad son fundamentales.

Materiales y Métodos
Cultivo in vitro de bacterias y condiciones de cultivo

BCG Copenhague organismos se cultivaron en los medios de comunicación Middlebrook 7H9 complementado con un 10% (v / v), ADC (Difco Laboratories) y 0,05% (v / v) de Tween 80 (Sigma) a mediados de la fase de registro a 37 ° C con agitación a 90 rpm en el tornillo de tope botellas.

Cultura de MH-S Células

MH-S células (ATCC CRL N º-2019) fueron cultivadas en medio RPMI suplementado con 10% FCS, 1 mM Na-piruvato, y 2 mM L-glutamato, 10 mM HEPES, 0,05 mm 2-mercaptoetanol, 100 U / ml penicilina, y 10 mg / ml de sulfato de estreptomicina. Las células se mantuvieron en un ambiente humidificado del 5% de CO 2 a 37 ° C. Durante la infección por micobacteria, medio de cultivo sin antibióticos se utilizan. Infección de MS-S con células BCG Copenhague se realizó como se describió anteriormente [6], [7].

Análisis de citometría de flujo de fragmentación de ADN

MH-S, las células fueron sembradas en el 2,5 × 10 5 células / ml en un 24 y placa de cultivo de tejidos para 1 día (2,5 × 10 5 células / pocillo). Después del tratamiento con 0,8 mm MG (Sigma) durante 24 h, las células han sido recolectados, resuspendido en 500 μ l de yoduro de propidio de amortiguación (0,1% Tritón X-100, 1 × PBS) que contenía 50 μ g / ml de yoduro de propidio (Sigma), y se incubaron durante 15 minutos en hielo. La fragmentación de DNA, análisis se llevó a cabo utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson). La apoptosis fue anotado por el porcentaje de células que aparecen en la zona por debajo del pico G1/G0 en representación de las células que contienen ADN <2N.

Annexin V vinculante

Un millón de MH-S, las células fueron sembradas en un 6-así placa para 1 día y luego tratados con 0,8 mm MG, y después de cosechadas MG tratamiento para 4, 6 y 24 h. El MH-S, las células fueron recolectadas, lavadas dos veces con 1 × PBS, resuspendido en annexin V vinculante de amortiguación, y teñidos con annexin V de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Sigma), antes de análisis de citometría de flujo.

Determinación de los niveles en MG MH-S Células

Medición de niveles de MG se realizó como se describió anteriormente [23] con algunas modificaciones. MH-S células (2 × 10 7) estaban infectados con BCG a MOI de 50:1. Un día después de la infección, MH-S, las células fueron recolectadas, lavadas dos veces con 1 × PBS, y zadas por ultrasonidos en 5 × 1 ml de PBS. Ácido perclórico (PCA) (Sigma) y o-fenilendiamina (o-PD; Sigma) se añadieron a una concentración final de 0,5 M y 5 mm, respectivamente. La mezcla se incubó a 20 ° C durante 24 h. ACC precipitado fue removido por centrifugación. El sobrenadante fue aprobada a través de una sólida C 18-cartucho de extracción en fase (Aguas Sep-Pak tC18 más cartucho, Millipore), que había sido preparado por el lavado con 6-8 ml de acetonitrilo y 6-8 ml de 10 mM KH 2 PO 4 (pH 2.5). La muestra se eluye del cartucho con 4 ml de acetonitrilo (Sigma). El 2-methylquinoxaline (2-MQ) contenido fue analizado por HPLC. 2-MQ se eluye en un tiempo de retención de 7.1-7.3 min. Aumento de MG se determinará calculando la proporción de áreas de los picos entre MH-S células con y sin infección. El ratio obtenido se normalizó con la relación de los correspondientes números de células.

Lisis celular y análisis por inmunotransferencia

Las células fueron zadas en tampón de lisis que contiene 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,15 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM vanadato de sodio, y 1 × inhibidor de proteinasa cóctel (Sigma). Lisados fueron aprobados por centrifugación a 13000 g durante 10 min, desnaturalizado por ebullición en Laemmli de amortiguación por 5 min, separadas por el 12,5% SDS-PAGE geles, y borrado en la membrana de nitrocelulosa. Inespecíficos vinculante fue bloqueada por incubando la membrana con el 0,1% Tween-20/PBS que contengan 5% nonfat seco de leche durante 1 h a temperatura ambiente. Membranas fueron incubadas en el amortiguador de bloqueo con el anticuerpo primario: caspasa-3 (Señalización Celular y Tecnología), caspasa-9 (de Señalización Celular y Tecnología), o P-JNK (Sigma) durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con rábano picante peroxidasas ( HRP)-anticuerpo secundario conjugado, y las específicas de los complejos inmunes fueron detectados utilizando el Western blot mayor quimioluminiscencia (ECL)-la base de reactivos (Amersham Biosciences).

Detección de edad en Micobacterias-macrófagos infectados

Anticuerpos monoclonales (AcM) contra la AGE (I + D + i, ADYGLYabm, clon 6D12) fue marcado con Cy3 o Cy5 utilizando Cy3/Cy5 Ab Labeling Kit (Amersham Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Macrófagos infectados han sido recolectados, fija con 4% paraformaldehído, y permeabilized a 1 × PBS que contenía 0,1% Tritón X-100. Los macrófagos fijos se colorearon con la etiqueta de anticuerpos y sometidos a análisis FACS.

Inmunohistoquímico de teñido

Debido a la extensa enfermedad pulmonar y la prevalencia de cepas MDR, los pacientes con tuberculosis en Rusia con frecuencia se someten a cirugía torácica electiva. Destruidos partes de sus pulmones son eliminados dentro de la fronteras anatómicas de los segmentos del pulmón para disminuir la carga micobacteriana. Tejido pulmonar se obtuvo en el Departamento de Cirugía Torácica de la Central Instituto de Investigaciones de la Tuberculosis (CTRI). En el momento de una intervención quirúrgica electiva, todos los pacientes con tuberculosis multirresistente estaban bajo terapia de combinación de al menos 3-4 de primera y / o medicamentos de segunda línea. Inmediatamente después de la cirugía, eliminado tejido pulmonar se fijó en el 4% de paraformaldehído. Todos los procedimientos de participación de los pacientes fueron examinados y aprobados por las correspondientes juntas de revisión ética en tanto Moscú y Berlín. El consentimiento informado se obtuvo de cada paciente en este estudio.

La tinción inmunohistoquímico de marcadores celulares de superficie se realizó de acuerdo a protocolos publicado [47]. En resumen, después de deparaffination, cortes de tejido se lavaron con H 2 O, incubadas en buffer EDTA 1mM a 2 bares por 3 min y luego se lava con 0,01% de Tween 20 en PBS (TBS). Las secciones fueron incubadas con MAB contra la AGE (1:300, I + D + i, ADYGLYabm, clon 6D12), CD68 (1:100; Biocarta, CM033B), pAbBCG (1:1000; Dako, Hamburgo, Alemania, B0124), o Ki-67 (1:75; Dako, M7240), respectivamente, durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar en TBS, las secciones fueron incubadas con anticuerpos policlonales goat-anti-mouse/goat-anti-rabbit marcado con fosfatasa alcalina (AP; Dianova, Hamburgo, Alemania, 115-055-146 o 111-055-045) para el 1 h . Bound se detectaron anticuerpos de color utilizando la reacción naftol AS-bi-fosfato solución que contenga neo-fucsina y el nitrito de sodio (Merck, Darmstadt, Alemania, 1,06549). Endógena actividad de la fosfatasa alcalina fue bloqueada por el levamisol (Sigma, Taufkirchen, Alemania, L9756). Contra la tinción se realizó con dobladillo-alaun (Merck).

La medición de TNF-α y de secreción CXCL10

MH-S células (2 × 10 6) fueron tratados con 0,8 mm MG en 4 ml de medio de cultivo. El crecimiento medio fue retirado en diferentes puntos de tiempo después de MG y se evaluó el tratamiento de TNF-α y CXCL10 contenido a través del ratón TNF-alfa y CXCL10 DuoSet ELISA Desarrollo de Sistemas, respectivamente, (R & D Systems), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Las muestras de punto cada vez que se midieron por triplicado. Las barras de error representan la desviación estándar de tres mediciones. OD valores relativos se calcula dividiendo cada valor con una densidad óptica de que la muestra no tratada (0 h).

De perfiles de expresión génica

Después del tratamiento con MG de 0, 0,5, 4,0 y 8,0 h, MH-S, las células han sido recolectados, pildoradas, resuspendido en Trizol (Invitrogen), y vortexed de 1 min a lyse las células. Total RNA se extrajo con cloroformo y precipitado en isopropanol. El ARN precipitado se lavó dos veces con el frío el 70% de etanol.

El GeneChip ® Mouse Genoma 430 2,0 microarrays de oligonucleótidos (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) comprende 45101 sonda fija, que analizan el nivel de expresión de más de 39000 transcripciones y las variantes de más de 34000 bien caracterizado los genes del ratón. Etiquetado de los objetivos de ARN, la hibridación y posterior a la hibridación procedimientos se realizaron de acuerdo a los protocolos proporcionados por Affymetrix. Tras el lavado y la tinción, arrays fueron escaneadas en dos ocasiones a 1,56 μ m de resolución utilizando un escáner GeneChip ® 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA), controlado por el SMOC 1,3 software (Affymetrix). Fotones fue detectada por un fotomultiplicador a través de un tubo de 570-nm longpass filtro. Generados por ordenador, conjunto de imágenes se superpone con una red virtual, controlada por el SMOC 1,3 software. Este paso permite la definición de cada función y dentro de la alineación conocida gama dimensiones. Alrededor de 40 píxeles dentro de cada característica se descarte después de un promedio de los valores y cerca de píxeles característica límites. Los niveles de expresión de genes se calcula de acuerdo al promedio de las intensidades de hibridación adapta perfectamente coincidentes frente a las sondas de oligonucleótidos. Las matrices se ampliaron por el SMOC 1,3 software a un promedio de intensidad de hibridación de 2500 por los genes y analizaron independientemente. Después de la hibridación y análisis de imágenes que excluye la sonda fija con llamadas ausente en las 12 muestras o con intensidades de hibridación nonsignificant.

El Data Mining Tool 3.1 (Affymetrix) y GeneSpring paquete de software 7.2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) fueron utilizados para comparar la muestra de control no tratados (0 h tiempo punto) con MG-tratamiento de muestras en diferentes puntos temporales. Los datos se normalizaron para compensar la variabilidad en hibridaciones y la hibridación artefactos. La normalización consiste en tres secciones:

GeneSpring El paquete de software de 7,2 se utiliza para identificar coexpressed genes dentro de un conjunto de la expresión génica de datos normalmente obtenidos mediante la tecnología de microarrays. Coexpression La información fue a su vez utilizado para ayudar a identificar las funciones biológicas de los genes. Para identificar las posibles funciones biológicas asociadas a grupos de genes, analizamos la Ontología de Genes (GO) anotaciones de coexpressed genes.

Microarray datos se depositan en la órbita geoestacionaria ( http://www.ncbi.nih.gov/geo/ ; Número: GSE3837).

Cuantitativas Real-time RT-PCR de MH-S células

MH-S, las células fueron tratadas con 0,8 mm de MG 4 h con o sin tratamiento previo con GSH. Después del tratamiento, MH-S, las células han sido recolectados, pildoradas, resuspendido en Trizol (Invitrogen), y vortexed de 1 min a lyse las células. Total RNA se extrajo con cloroformo y precipitado en isopropanol. El RNA fue precipitado una vez lavado en frío con el 70% de etanol. Cinco μ g ARN total fue inverso-transcrito utilizando Superíndice Reverse Transcriptase III (Invitrogen), según el protocolo del fabricante. Cuantitativo en tiempo real de RT-PCR se realizó utilizando SYBR Green kit de acuerdo a las instrucciones del fabricante (ABI Prism 7000, Applied Biosystems) y primer pares que figuran en el cuadro S8. Expresión relativa de los niveles se normalizaron a β-actina.

Apoyo a la Información

Damos las gracias a Tracey Walker para que nos proporciona los datos de microarrays microdissection murino de lesiones granulomatosas. HR gracias Dr Ute Ungethüm para la hibridación de arrays de Affymetrix y Ralf Invierno HPLC para la transformación de datos.