PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

La separación de Lucha contra la proliferación y anti-apoptóticos Funciones del retinoblastoma a través de proteínas específicas de sus mutaciones A / B de dominio

Biblioteca Pública de la Ciencia
Chau B. Nelson, Chris W. Pan, Jean Wang YJ [*]
Resumen
Fondo

El retinoblastoma humanos susceptibilidad gen codifica una nuclear phosphoprotein presupuesto ordinario, que es un regulador negativo de la proliferación celular. El crecimiento de supresión de la función requiere de un presupuesto ordinario conservadas evolutivamente A / B de dominio que contiene dos péptido vinculante bolsillos. En la A / B interfaz es un sitio de unión para el C-terminal de trans-activación del dominio de E2F. En el grupo B de dominio es un sitio de unión para las proteínas que contiene el péptido LxCxE motivo.

Metodología y resultados principio

Sobre la base de la estructura cristalina de la A / B de dominio, hemos construido un RB-K530A/N757F (KN) mutante de perturbar el E2F-y LxCxE vinculante bolsillos. La RB-K530A (K) mutante es suficiente para inactivar los E2F vinculante de bolsillo, mientras que la RB-N757F (N) mutante es suficiente para inactivar los LxCxE vinculante bolsillo. Cada mutante inhibe la proliferación celular, pero la RB-KN doble mutante es defectuoso en el crecimiento represión. Sin embargo, la RB-KN mutante es capaz de reducir etopósido inducida por apoptosis.

Conclusión / Importancia

Estudios previos han establecido que la RB-G1-dependiente detención puede conferir resistencia al daño en el DNA inducida por apoptosis. Los resultados de este estudio demuestran que la RB puede también inhibir la apoptosis independiente de crecimiento represión.

Introducción

La susceptibilidad genética retinoblastoma (RB1) codifica una nuclear phosphoprotein presupuesto ordinario con la función de supresión tumoral [1]. La herencia de la mutación germinal RB1 causas retinoblastoma con penetrancia del 90% en los niños; las células tumorales presentan pérdida de heterocigosidad (LOH) en el locus RB1 con la pérdida invariable el alelo normal RB1 [2], [3]. El bi-alleleic inactivación del gen RB1 también ha sido detectado en humanos esporádicos de cáncer de una variedad de tejidos de origen a una frecuencia media de aproximadamente el 10% (COSMIC en la base de datos del genoma Sanger Center). El conocimiento actual sugiere que la RB suprime el desarrollo del tumor mediante la inhibición de la proliferación celular y la promoción de diferenciación terminal [1]. La lucha contra la proliferación de RB función depende de su interacción con el celular E2F-familia factores de transcripción, que son consistentes heterodimers de E2F y DP subunidades [4]. RB interactúa directamente con varios miembros de la familia E2F para inhibir E2F que dependen de la transcripción [4]. Los factores de transcripción E2F regular los genes necesarios para la proliferación celular y la apoptosis [5]. Mediante la inhibición de E2F que dependen de la transcripción, RB regula negativamente la proliferación celular y la apoptosis.

El crecimiento represión función de la proteína RB exige a sus A / B de dominio que se conserva en el presupuesto ordinario de la familia de proteínas. El A / B de dominio del ser humano RB proteína contiene al menos dos péptido vinculante bolsillos, cuyas estructuras se han dilucidado por cristalografía de rayos X [6], [7]. El E2F-péptido vinculante bolsillo reside en el A / B del dominio interfaz, que une la carretera C-terminal del péptido de E2F-1, 2 y 3 [7]. El péptido LxCxE vinculante de bolsillo es una somera ranura en el dominio B-, que media la interacción con las proteínas que contiene el péptido LxCxE motivo [6]. El péptido de dos bolsillos vinculante en el A / B de dominio han sido inactivados por mutaciones específicas de sustitución [8] - [10].

Interrupción de la LxCxE vinculante bolsillo abroga la interacción entre el presupuesto ordinario y el virus de Oncoproteínas como el SV40 T-antígeno, la proteína E7 del VPH y el adenovirus E1A proteínas [8], [10]. El LxCxE vinculante-RB mutantes defectuosos mantener el crecimiento represión función porque estos mutantes mantener sus interacciones con E2F [8], [10]. Uno de los LxCxE vinculante-mutantes defectuosos construido por nuestro laboratorio contiene una sola mutación de sustitución de Asn757 (RB-N, N757F), que es suficiente para perturbar el LxCxE vinculante de bolsillo [8]. Este RB-N mutante reprime E2F que dependen de la transcripción, inhibe la síntesis de ADN, y reduce la formación de colonias [8]. Como se informó aquí, hemos interrumpido desde el péptido E2F vinculante de bolsillo en el presupuesto ordinario A / B interfaz de mutación Lys530 con Ala (RB-K, K530A). La RB-K mutante también sigue siendo competente en la inhibición de la proliferación celular. Sin embargo, la RB-KN doble mutante no inducir el crecimiento de detención.

Estudios anteriores han demostrado que la RB-dependiente es el crecimiento de detención de protección contra la apoptosis. Fibroblastos derivados de Rb-null embriones son defectuosas en el ADN inducidas por los daños G1, S y G2 detención y una mayor exposición de apoptosis respuesta a genotoxinas [11], [12]. La expresión ectópica de RB en SAOS-2 induce a las células osteosarcoma G1 detención y protege de la apoptosis inducida por las radiaciones ionizantes [13]. Inducida por la expresión constitutiva de un activo que carece de presupuesto ordinario phosphorylate nueve sitios (PSM-RB) interferido con doxorubicina inducida por la activación de caspasa-3 como consecuencia de la detención G1-[14], [15]. La resistencia a la apoptosis de G1-detenido células es probable que la participación de RB que dependen de represión transcripcional de E2F-regulado pro-apoptóticos genes [5]. Por lo tanto, los anti-apoptóticos actividad de la mayoría de presupuesto ordinario ha sido considerado como un efecto secundario de su crecimiento represión función. En este estudio, mostramos que RB y RB-KN puede inhibir la apoptosis sin que se produzca la detención del ciclo celular. Hemos demostrado que la RB-KN es una función de separación de mutantes, lo cual es útil en otros estudios de los anti-apoptóticos función del presupuesto ordinario.

Materiales y Métodos
Célula de la cultura y la construcción del plásmido

Adenocarcinoma de mama humana MDA-MB468 y osteosarcoma SAOS-2 se mantuvieron las células en DMEM complementado con un 10% de SFB. Transfections se realizaron con Fugene (Roche Diagnostics), según las instrucciones del fabricante. K530A y N757F mutaciones se introdujeron en humanos RB cDNA a través de PCR mediada por mutagénesis y la consiguiente mutación confirmada por secuenciación del ADN.

GST pull-down, co-immunoprecipitation y immunoblotting

GST proteínas de fusión de RB (humanos, que contiene 395 aminoácidos a través de 928), E2F1 (humanos, de larga duración), E2F3 (humanos, de larga duración), DP1 (humanos, de larga duración) y E7 (virus del papiloma humano-16 , De larga duración) se expresaron en bacterias y se purifica en Glutatión Sepharose (Pharmacia) por métodos estándar [8], [16], [17]. Las proteínas de fusión GST se mezclaban con lisados celulares en vinculante buffer (25 mM Tris-HCl, pH7.5, 250mm KCl, 0,1% Tritón X-100, 0,5 mM EDTA, 0,1 mm TDT) y los inhibidores de la proteasa (Sigma). Tras un amplio lavado de la misma vinculante de amortiguación, las proteínas se mantuvieran en la fase sólida se eluye con la adición de SDS muestra de amortiguación y sometidos a SDS-PAGE para fraccionamiento antes de ser transferidos a membrana de PVDF. RB proteína en la mancha se detectó con una afinidad de anticuerpo policlonal purificado planteado contra la RB [18]. HA-etiquetados proteínas de E2F1 / 3 fueron detectados con un anti-HA anticuerpo monoclonal (Clone HA.11) obtenidos a partir de Berkeley Antibody Co E2F1 (KH95) y exfoliados caspasa-3 (D175) se obtuvieron anticuerpos de Santa Cruz y Señalización Celular Tecnología, respectivamente. Citocromo c de anticuerpos se obtuvo de Pharmingen. Para co-immunoprecipitation, las células fueron zadas en el carácter vinculante de amortiguación, los lisados aclarado por centrifugación, y luego incubadas con anticuerpos anti-RB o anti-HA. Los complejos inmunes fueron recogidos por la proteína G Sepharose, solubilized con EDS muestra de amortiguación para inmunotransferencia de métodos estándar.

La infección por adenovirus

Adenovirus recombinante se construyó y amplificado mediante el sistema de AdEasy [19]. Las células fueron infectadas en una multiplicidad de 100 la noche a la mañana antes del tratamiento con etopósido.

Piso de células BrdU formación y la incorporación

SAOS-2 células fueron transfectadas con plásmidos codificación RB, RB-K, RB-N o RB-KN y la neomicina gen de resistencia [16], [18]. Las células fueron transfectadas con G418 seleccionados durante 14 días, teñidas con cristal violeta, y el gigante plana de células contados bajo un microscopio de disección (5 × magnificación) [16], [20]. Las células fueron incubadas con 10 mM BrdU durante 14 horas, fijo, y teñidos con ficoeritrina monoclonal conjugado con anticuerpos contra BrdU (BrdU-PE). El porcentaje de BrdU-positivas fracción se determinó por el análisis FACS. Para determinar la no específica señal de fondo, se realizó un análisis FACS utilizando células que se tiñen con el PE-conjugado IgG. El BrDU-positivas fracción se determinó a través de una puerta que excluye la señal de fondo.

Apoptosis ensayos

Para medir el alcance de la liberación del citocromo c de la mitocondria, las células fueron cosechadas y resuspendido en Mitobuffer (20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF , 2 μ g / ml leupeptina, 2 μ g / ml Pepstatin, 2 μ g / ml aprotinina) y luego mecánicamente ruptura con 25 golpes de pestle en un vaso homogeneizadora colocado en hielo. Los lisados se hilar libre de los núcleos y células intactas a una velocidad de 500 × g. El sobrenadante fue sometido a centrifugación a 8000 × g para que sedimenten las mitocondrias. Para medir la sub-G1 contenido de ADN, las células fueron fijadas en helado de etanol (70%), re-suspendido en tampón fosfato salino que contiene 40 μ g / ml RNasa y 20 μ g / ml de yoduro de propidio y luego sometidos a análisis FACS.

Resultados
K530A mutación RB abroga la interacción con la trans-activación de dominio de E2F

La estructura del presupuesto ordinario A / B de dominio en el complejo con el C-terminal de péptidos E2F (aa 409-426) ha sido determinada [7]. Sobre la base de las interacciones atómicas entre presupuesto ordinario y E2F aminoácidos, construido varias mutaciones a perturbar este E2F vinculante bolsillo. Entre los mutantes, Lys530Ala sustitución en la A-dominio (K530A, RB-K) (Fig. 1A] es suficiente para perturbar la RB-E2F interacción (Fig. 1B-E]. Hemos previamente inactivados la LxCxE vinculante de bolsillo con la sustitución Asn757Phe mutación (N757F, RB-N) en el dominio B-(Fig. 1A] [8]. La RB-KN mutante contiene mutaciones puntuales.

El presupuesto ordinario y las proteínas mutantes se expresaron en el presupuesto ordinario con déficit de cáncer de mama línea celular MBA-MD468 a través de adenoviral mediada por la transferencia de genes, y los lisados de adenovirus de las células infectadas se aplica luego a glutation-agarosa bolas cargadas con GST-E2F1 o GST - E7 proteínas recombinantes purificadas de la bacteria (Figura 1B]. Como hemos informado anteriormente, GST-E2F1 podría tirar abajo RB y RB-N, mientras que GST-E7 eficiente derribados, pero no RB RB-N (Fig. 1B]. Por el contrario, la RB-K mutante fue derribado de manera eficiente por GST-E7, lo que demuestra la integridad de la LxCxE vinculante en el bolsillo RB-K proteína (Fig. 1B]. Sin embargo, GST-E2F1 no obtiene RB-K, lo que sugiere un papel fundamental de K530 en vinculante E2F1. Como era de esperar, la RB-KN no fue derribado por GST-E2F1 o GST-E7 (Fig. 1B]. A la inversa-GST derribar experimento, E2F-1 era la expresión inducida por la tetraciclina en un sensible SAOS-2 línea celular (Fig. 1C] [21]. Cell lisados con overproduced E2F-1 se aplican a las bolas que contienen glutatión-GST o GST RB-RB-K proteínas recombinantes expresadas en bacterias. El menú desplegable de E2F1 por GST-RB-K se redujo significativamente en comparación con el de GST-RB (Fig. 1C].

El defecto de la RB-K en E2F1 vinculante demostró aún más, co-immunoprecipitation (Fig. 1D] y la represión de la transcripción (Fig. 1E]. El E2F1-inducible SAOS-2 células infectadas con adenovirus que expresan GFP, RB, RB-K, RB-N o RB-KN, seguida por la inducción de E2F-1 y immunoprecipitation con anti-RB (Fig. 1D]. Cada una de las proteínas de RB se expresó a niveles similares (Fig. 1D, panel inferior]. La inducción de E2F-1 era también similar entre las diferentes culturas de infectados SAOS-2 células (Fig. 1D, panel superior]. El co-immunoprecipitation de E2F-1 se observó con RB y RB-N pero no con RB-K o RB-KN (Fig. 1D, panel central]. El C-terminal de E2F1 región es necesaria para su función de activación transcripcional, que se inhibe a la unión de la RB [22], [23]. Para medir esta trans-activación de la función de E2F1, un Gal4-E2F1 proteína de fusión se utiliza para impulsar la expresión de un reportero luciferase bajo el control del tándem Gal4 sitios de unión del ADN [22]. Con esta bien establecida co-transfección de ensayo, Gal4-E2F1 estimulado el reportero de expresión de 300 veces (Fig. 1E]. RB Gal4 reducido la actividad de E2F1 por 3 veces, mientras que la RB-K no afectó la Gal4-E2F1 actividad en consonancia con el defectuoso vinculante. En conjunto, estos resultados son consistentes con los rayos X la estructura de cristal y apoyar la importancia de la lisina-530 en la interacción entre el presupuesto ordinario y el C-terminal de péptidos en E2F1.

RB-K530A se une a E2F1-DP1

Es un hecho bien establecido que puede inhibir la RB-E2F transcripción dependientes a través de dos mecanismos. RB une la carretera C-terminal de trans-activación del dominio de E2F1 para inhibir la transcripción [23]. La RB-E2F complejo también interactúa con otros transcripción co-represores, como las histonas deacetylases o methylases para inhibir la transcripción [23]. Aunque RB-K es defectuoso en la inhibición de la trans-activación de la actividad de E2F1 (Fig. 1E], es competente en la represión de una transcripción E2F-regulado promotor (Figura 2A]. Estudios anteriores han establecido el Ciclinas un promotor para contener E2F-lugar de unión y la actividad promotora es reprimida por la RB-E2F complejo [24]. Con una luciferase reportero impulsado por la Ciclinas El promotor, se puede demostrar que RB, RB y K-RB-N son capaces cada una transcripción de la represión (Fig. 2A]. La RB-mediada por la represión depende de E2F, porque las mutaciones de los E2F vinculante secuencias en las Ciclinas El promotor abolido la RB-mediada por la represión de transcripción (no se muestra). Estos resultados sugieren que la RB-K puede interactuar con E2F, aunque no a través de la unión a E2F C-terminal región.

Se ha informado de que la RB C-región contiene un segundo sitio de unión para la E2F/DP heterodimer [9]. Por lo tanto, determinar si RB-K conservado la capacidad de interactuar con E2F/DP1. A HA-E2F1 etiquetados fue co-expresada con DP1 en células 293T, y los lisados celulares fueron incubadas con cinco diferentes GST-proteínas de fusión GST-E7, GST-RB, GST-RB-K, GST-RB-N, y GST-RB-KN (Figura 2B]. En las condiciones de E2F1 y DP1 co-expresión, encontramos que cada una de las GST-RB proteína de fusión son capaces de tirar abajo eficiente de E2F1. Esto es en contraste con el resultado se muestra en la Fig. 1C, cuando E2F1 Se expresó por sí solo sin DP1. También se realizó co-immunoprecipitation experimentos donde HA-E2F1, DP1, RB y transitoriamente se co-expresada en la RB-C33A deficiente cervical carcinoma de células (Fig. 2C]. La interacción entre el presupuesto ordinario, RB y K-RB-KN con E2F1 fue constantemente observada en forma independiente las células transfectadas (Fig. 2C], contrastando el resultado se muestra en la Fig. 1D. Se ha informado de que la RB C-región se une preferentemente E2F1/DP1 y exhibe una mucho más débil interacción con E2F3/DP1 [9]. Cuando RB, E2F3 y DP1 transitoriamente se co-expresada en 293 células, encontramos E2F3 a co-immunoprecipitate con presupuesto ordinario, sino la interacción era mucho más débil con RB-K (Fig. 2D]. Este resultado es consistente con informes anteriores que interactúa con RB E2F3 principalmente a través de su E2F-péptido vinculante en el bolsillo A / B interfaz que se inactiva por la K530A mutación.

RB-KN carece de crecimiento represión actividad

A continuación se midió el crecimiento de la actividad de represión RB mutantes por un corto plazo la determinación de BrdU y la incorporación de una perspectiva a largo plazo de ensayo de formación de células planas. En el corto plazo ensayo, MDA-MB468 células infectadas con adenovirus que expresan GFP, RB, RB-K, RB-N o RB-KN y luego etiquetados con BrdU (Fig. 3A]. Relativa a las células infectadas con el control de GFP-virus, las células infectadas con el presupuesto ordinario-, RB-K-, o RB-N-virus demostraron una reducción de incorporación BrdU (Fig. 3A]. Las células infectadas con RB-KN, por otra parte, incorporado BrdU a un nivel que es indistinguible de la GFP-infectados con el virus de las células (Fig. 3A].

En el largo plazo de ensayo, hemos utilizado el bien establecida la inducción de la senescencia de presupuesto ordinario en el presupuesto ordinario de humanos con deficiencia de SAOS-2 cells. Expresión ectópica de RB induce la formación de grandes planos que son células metabólicamente activas, pero no sean objeto de división celular [20]. En RB-transfectadas culturas, el número de células planas oscilaron entre 200-400 por placa en cuatro experimentos independientes. En el modelo de transfectadas las culturas, 0-4 células planas se encontraron por placa. En RB-N-transfectadas culturas, 120-220 plana células se encontraron, y en RB-K-transfectadas las células, 80-170 plana células fueron contados. La relativa plana de células de los cuatro experimentos se muestra en la Fig. 3B. Sólo 10-20 plana células se encontraron en las culturas transfectadas con la RB-KN mutante, que muestran una reducción estadísticamente significativa en el plano de la inducción de células actividad de este mutante (Fig. 3B]. Debido a que los niveles de expresión de proteínas a través de la infección por adenovirus fueron más altos que los de transfección de ADN, también compararon el efecto de RB mutantes en BrdU incorporación en transfectadas SAOS-2 cells. El resultado fue coherente con la plana de células de ensayo: la inhibición de la incorporación de BrdU RB-K fue menos eficaz que el de RB, mientras que la RB-KN no inhibió la incorporación BrdU (no se muestra). Estos resultados muestran que la RB-K o la RB-N mutante mantiene el crecimiento represión actividad, pero la RB-KN mutante es defectuoso en el crecimiento represión, en consonancia con sus defectos en la represión de la transcripción de un promotor Ciclinas (Fig. 2A].

RB-KN inhibe la apoptosis

Porque RB-KN es defectuoso en el crecimiento represión, este mutante brinda la oportunidad de probar la hipótesis de que los anti-apoptóticos función de RB es secundario al crecimiento de detención.

La RB-deficiente MDA-MB468 células del cáncer de mama fueron infectadas con adenovirus que expresan GFP, RB, RB-K, RB-N, o RB-KN. Las células infectadas fueron tratados con etopósido. La apoptosis fue evaluada por la fragmentación del ADN (sub-G1 contenido de ADN) (Fig. 4A], liberación del citocromo c (Fig. 4C], y la división de pro-caspasa 3 (Fig. 4D]. Etopósido tratamiento dado lugar a un aumento significativo de la fragmentación del ADN (evaluada por el sub-G1 contenido de ADN) en las buenas prácticas agrarias-infectados con el virus de las células (Fig. 4A]. El aumento en el sub-G1 ADN contenido era insignificante en etopósido tratada con células que fueron infectadas con el presupuesto ordinario, RB-K, o RB-N del virus (Fig. 4A]. Este resultado apoya la conclusión de que la RB-mediada por el crecimiento de detención confiere genotoxin resistentes a la apoptosis inducida. Curiosamente, sin embargo, la RB-KN-infectados con el virus de las células también se muestra reducido la fragmentación del ADN (Fig. 4A], a pesar de la continua progresión del ciclo celular (Fig. 3A].

La exposición a etopósido inducida por la liberación del citocromo c-GFP en las células infectadas del virus (Fig. 4C]. La activación de este paso crítico en la vía intrínseca de apoptosis por etopósido se redujo en células que expresan o RB RB-KN (Fig. 4C]. El etopósido inducida por división de pro-caspasa-3 se redujo en MDA-MB438 células que expresan RB, RB-K, o RB-N (Fig. 4D]. Este procesamiento proteolítico de la caspasa-3 también se redujo en células que expresan RB-KN (Fig. 4D]. El anti-apoptóticos efecto de la RB-KN fue observada en el SAOS-2 así como las células (Fig. 4B], lo que demuestra que RB-KN podría inhibir la apoptosis sin suprimir el crecimiento celular en dos diferentes RB-deficientes líneas celulares.

RB conserva anti-apoptóticos función en células proliferantes

Para determinar si el tipo salvaje RB ha anti-apoptóticos función en células proliferantes, tomamos nota de los resultados que RB-mediada por el crecimiento de detención puede ser anulado por la co-expresión de cyclins [25], [26]. Por lo tanto, co-infectados SAOS-2 células con adenovirus que expresan presupuesto ordinario y Cdk2/Cyclin E. Como era de esperar, co-expresión del presupuesto ordinario con Cdk2/Cyclin E llevaron a PO fosforilación, indicado por la alteración de la movilidad en electroforesis SDS-PAGE ( Fig. 5A].

SAOS-2 células infectadas con adenovirus que expresan GFP, RB o RB-KN por sí sola o en combinación con adenovirus que expresan Cdk2/Cyclin E. células infectadas fueron entonces expuestos a etopósido, cosechado 48 horas después de FACS análisis de contenido de ADN (Fig. 5B & C]. La expresión de E Cdk2/Cyclin con las buenas prácticas agrarias provocado un aumento de la fase S del ADN contenido, pero no un aumento en el sub-G1 ADN (Fig. 5B, # 1]. Etopósido inducida por aumento de la sub-G1 ADN contenido fue similar en las buenas prácticas agrarias-que expresan las células que expresaron Cdk2/Cyclin E (Fig. 5B, # 5] o no (Fig. 5B, # 2] (véase también Fig. 5C]. Expresión de PO o RB-KN protegidas SAOS-2 de etopósido células inducida por la fragmentación de DNA (Fig. 5B, # 3 y # 4) (Fig. 5C]. Co-expresión con Cdk2/Cyclin E aumento de la fase S-fracción de etopósido tratados, RB-positivas, SAOS-2 células (Fig. 5B, # 6); sin embargo, no anular los anti-apoptóticos función de RB ( Fig. 5C]. Co-expresión con Cdk2/Cyclin E no afecta ni a la fase S o el sub-G1 fracción de etopósido tratados, RB-KN-expresando, SAOS-2 células (Fig. 5B, # 7 y Fig. 5C]. Estos resultados sugieren de tipo salvaje RB también puede reducir la apoptosis con la condición, en que el crecimiento de su función de represión no es total.

Discusión

La lucha contra la proliferación función del presupuesto ordinario está mediada por la represión de E2F que dependen de la transcripción de los genes del ciclo celular [4], [27]. RB puede inhibir E2F que dependen de la transcripción de dos mecanismos: o bien directamente a través de la unión a la C-terminal de trans-activación de E2F dominio o mediante el montaje de complejos represor de transcripción E2F-a los promotores regulados [4], [23], [27 ]. La RB-K mutante no se une a la C-terminal de trans-activación de E2F dominio y no inhibe la trans-activación función de E2F1. Sin embargo, RB-K aún interactúa con E2F1/DP1, muy probablemente a través de la C-terminal E2F/DP-binding sitio [9], de que el X-ray estructura cristalina ha sido informado recientemente [28]. La RB-N mutante conserva tanto E2F vinculante bolsillos, es decir, en el A / B en la interfaz y el C-terminal región [8], lo que representa su capacidad para inhibir la proliferación celular. Debido a que la RB-KN doble mutante es defectuoso en la represión de transcripción, podemos concluir que uno intacto LxCxE vinculante de bolsillo es necesaria para RB-K para reprimir la transcripción. Nuestros resultados sugieren RB-K puede inhibir la proliferación a través de la asamblea de transcripción represión complejos, mientras que la RB-N es probable que inhiben directamente la trans-activación de la función de E2F. Así pues, parece que ninguno de los dos establecidos los mecanismos de represión transcripcional es suficiente para el presupuesto ordinario para inhibir la proliferación celular.

Estudios anteriores han demostrado que la RB-células deficientes son hipersensibles a daño en el DNA inducida por la apoptosis, y que la expresión de tipo silvestre-PO-PO en las células deficientes pueden rescatar esta hipersensibilidad [11], [13], [27]. Por otra parte, inducida por la expresión de una fosforilación in-mutado PSM-RB causas G1 detención para proteger a las células de daño en el DNA inducida por la apoptosis [15]. La represión coordinada de la proliferación y la apoptosis de RB puede explicarse por la inhibición de su E2F que dependen de la transcripción [27]. Este estudio de la RB-K, RB y N-RB-KN mutantes, sin embargo, ha demostrado que la RB puede también inhibir la apoptosis en células proliferantes. En la actualidad, no entendemos el mecanismo mediante el cual RB-KN etopósido inhibe la apoptosis inducida. RB-KN conserva el C-terminal E2F1/DP sitio de unión, y pueden inhibir concebible que un subconjunto de E2F1/DP-regulated promotores (que no sea la de Ciclinas A) para inhibir la apoptosis. Por otra parte, RB-KN Mayo secuestrar pro-apoptóticos factores distintos de E2F1, por ejemplo, el nuclear ABL tirosina quinasa que se ha demostrado que promover daño en el DNA inducida por la apoptosis [29], [30]. Porque RB-E2F1 y RB-ABL interacciones se ven perturbadas por RB-fosforilación en células proliferantes [31], [32], los anti-apoptóticos relacionados con la actividad fosforilados presupuesto ordinario o RB-KN no puede ser representada por la inhibición de E2F - 1 y ABL. Un estudio reciente ha demostrado que la RB puede estimular la reparación del ADN [33], [34], lo que aumentará la supervivencia celular en condiciones de estrés genotóxico. La RB-KN mutante debería facilitar futuros estudios para dilucidar el crecimiento independiente de la represión anti-apoptóticos función del presupuesto ordinario.

Damos las gracias al Dr James Degregori en la Universidad de Colorado, Denver, por el generoso regalo de adenovirus recombinante expresando Cdk2/Cyclin E.