PLoS ONE, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

Un ratón del estroma respuesta a la invasión del tumor de próstata predice el cáncer de mama y la supervivencia de los pacientes

Biblioteca Pública de la Ciencia
Marina Bacac [1], Paolo Provero [2], Nathalie Mayran [1], Jean-Christophe Stehle [1], Carlo Fusco [1], Ivan Stamenkovic [1]
[1] Lausana, Suiza
[2] Torino, Italia
Resumen

Primaria y el crecimiento del tumor metastásico de acogida del tejido induce respuestas que se cree que el apoyo progresión tumoral. La comprensión de la evolución molecular en el microambiente tumoral durante la progresión tumoral por lo que puede ser relevante no sólo para descubrir potenciales dianas terapéuticas, sino también para la identificación molecular putativo firmas que pueden mejorar la clasificación del tumor y predecir el resultado clínico. Para atender selectivamente la expresión génica del estroma cambios durante la progresión del cáncer, hemos realizado el análisis de cDNA microarray de laser-microdissected células derivadas del estroma de la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y cáncer invasivo en un modelo de varias de carcinogénesis de próstata. Orthologs Humanos de los genes identificados en el estroma reacción a la progresión tumoral en este modelo de ratón se observó que se expresó en varios cánceres humanos, y al grupo de próstata y cáncer de mama en grupos de pacientes con diferentes estadísticamente los resultados clínicos. Cox análisis univariado demostró que la sobreexpresión de estos genes se asocia con la supervivencia más corta y la recurrencia de períodos libres. Tomados en conjunto, nuestras observaciones proporcionan pruebas de que la expresión de la firma del estroma respuesta a la invasión del tumor en un ratón modelo de tumor puede ser utilizada para la sonda cáncer humano, y para proporcionar un poderoso indicador pronóstico de algunos de los más frecuentes tumores malignos humanos.

Introducción

Los tumores malignos son complejos conjuntos celulares compuesto, además de las células tumorales, tejido de acogida derivados de fibroblastos, células endoteliales, células musculares lisas, y leucocitos. A pesar de la autosuficiencia en la generación de señales de crecimiento y la resistencia a una variedad de inhibitorio del crecimiento y la inducción de apoptosis-estímulos, las células tumorales se basan en el apoyo de la acogida de tejidos para la supervivencia, crecimiento y difusión. Además de constituir un reservorio de factores de crecimiento, el estroma de tejido anfitrión proporciona los medios para generar el suministro de oxígeno mediante el apoyo a la angiogénesis, así como un andamiaje estructural para la adhesión de células tumorales y la migración [1] - [4]. Células tumorales, por lo tanto, debe poseer la capacidad para explotar estos recursos para su beneficio.

El acceso a la matriz extracelular (ECM)-secuestrado factores de crecimiento, el inicio de la angiogénesis y la degradación de colágeno y glicoproteínas ECM diversos que constituyen una barrera natural a la invasión requieren la activación de un complejo de enzimas proteolíticas mecanismo que inicia y mantiene la remodelación de ECM [5], [ 6]. Numerosas clases de proteasas extracelulares están implicados en la remodelación de ECM incluidos serina, cisteína y aspartil proteasas, los miembros de la familia metzincin, entre las que se metaloproteinasas de la matriz (MMPs), y adamalysin relacionados proteinasas [6] - [8]. Aunque algunos tipos de células tumorales expresar una amplia gama de enzimas proteolíticas que les permitan inducir ECM remodelación de sí mismos, otros carecen de la necesaria proteolíticas arsenal y debe confiar en las enzimas suministrada por las células del estroma [9], [10]. Mediante la contratación de leucocitos, especialmente los macrófagos, y mediante la activación de fibroblastos a través de la secreción del factor de crecimiento celular y la interacción de células, por ejemplo, las células tumorales se cree que aprovechar las células del estroma en secretor MMPs y otras proteasas que promueven la degradación de ECM y aumentar ECM-obligado biodisponibilidad del factor de crecimiento.

Comprensión profunda de acogida respuestas a diferentes tipos de cáncer de crecimiento, su importancia pronóstica y su valor potencial como dianas terapéuticas se ha visto obstaculizada en parte por los métodos utilizados para hacer frente a ellos. Por lo tanto, tumor-huésped interacciones y sus consecuencias se han estudiado principalmente en tumor de células de fibroblastos-co-la cultura y los sistemas de tumor xenograft modelos en ratones inmunodeficientes, donde el microambiente del estroma sólo puede reflejar en parte primordial de que surjan espontáneamente los tumores [11], [12] . Del mismo modo, la expresión de genes de ambas firmas primaria [13], [14] y metástasis [15] tumores que pueden soportar importancia pronóstica y predecir metastásico proclividad, respectivamente, tienen en su mayor parte han obtenido mayor parte de las poblaciones de células tumorales, de manera que la relativa contribución del tumor y las células del estroma compartimentos no puede ser evaluado fácilmente.

Para hacer frente a la respuesta del estroma para el crecimiento del tumor en un entorno natural, y para evaluar su potencial importancia pronóstica, se examinaron los eventos moleculares en las células del estroma compartimiento durante la progresión del cáncer en un ratón transgénico modelo de carcinogénesis polietápico. La elección de un modelo de ratón en lugar de tejidos humanos se basa en la experiencia de numerosos estudios que han puesto de relieve los retos asociados con el uso de tejidos humanos de archivo, tanto de técnicas y puntos de vista biológico [16]. La variabilidad en cuanto a la toma de muestras, la manipulación de tejidos, procesamiento y almacenamiento pueden desempeñar un papel importante en ocultar potencialmente relevantes perfiles de expresión génica [16]. Además, las respuestas del estroma a un determinado tumor puede variar entre los pacientes según edad del paciente y la coexistencia de trastornos no guardan relación con la malignidad. Un estudio bien diseñado para evaluar la respuesta del estroma a un tumor humano, por lo tanto debe tener un carácter prospectivo y se lleva a cabo en un gran número de personas. Aunque, sin duda, valiosa, ese enfoque exige mucho tiempo y debería ser, idealmente, multicéntrico. Mouse tumor modelos, por otra parte, proporcionar uniformidad sobre la base de un determinado mecanismo oncogénico que impulsa el desarrollo del tumor, un único fondo genético y la reducción de variabilidad interindividual. Altamente reproducible evaluación de los tumores en etapas definidas de la evolución, por lo tanto, es posible. Por otra parte, etapa tardía de los tumores libre intervención terapéutica sean fácilmente accesibles en modelos de ratones, en contraste con los correspondientes tejidos del paciente que son típicamente obtenida tras la quimio-o radioterapia.

La reproducibilidad de desarrollo y progresión tumoral en modelos de ratones predice la reproducibilidad de la correspondiente respuesta del tejido de acogida y sugiere que las pequeñas cantidades de animales que puede ser suficiente para permitir la identificación de la respuesta pertinente del estroma la expresión génica firmas. Esa supuesta expresión de genes firmas se pueden utilizar para sonda de cánceres humanos y la implicación funcional de los genes firma componente del proceso de la enfermedad pueden ser probados.

Los tumores de próstata neuroendocrino que se plantean en el modelo murino utilizado en el presente estudio (CR2-TAG ratones) han sido previamente caracterizado y se muestra a reproducir las etapas de la progresión tumoral y las metástasis [17], [18]. Microarray análisis de la respuesta del estroma hasta la progresión de intraepiteliales invasivas para los tumores reveló una serie de expresión génica en consonancia con la remodelación de ECM, que se caracteriza por el sólido inducción de genes de codificación de proteínas ECM, factores de crecimiento, adhesión y receptores de las proteasas. Sorprendentemente, la expresión de genes conjunto se encontró que tienen un poderoso valor pronóstico en humanos de próstata y cáncer de mama.

Resultados
Laser captura microdissection

Los tumores de próstata neuroendocrino que se plantean en la etiqueta-CR2 ratones y evolucionar a través de una serie de etapas que imitan de cerca la observada en los humanos cáncer de próstata han sido descritas previamente [17], [18]. En pocas palabras, los ratones han nacido con una próstata normal y desarrollar neoplasia intraepitelial prostática (PIN) de 8 semanas, para que el progreso carcinoma invasor de 16-20 semanas, que forman el hígado, los pulmones, los huesos y los ganglios linfáticos metástasis de 24 semanas de edad. La fase invasiva se acompaña de un sólido, predominantemente fibroblástica, la reacción del estroma que hacen que el modelo atractivo de acogida para hacer frente a las respuestas del tejido invasivo el crecimiento del tumor. En el presente estudio, teniendo próstatas PIN principios de lesiones de próstata y tumores invasivos fueron retirados de 10 - y 24 semanas de edad CR2-TAG ratones, respectivamente, en la autopsia (Figura 1A, B]. La elección de las 10 semanas el tiempo fue dictada por la observación de que la invasión temprana puede ya estar presente a las 12 semanas [17]. Por el contrario, las lesiones PIN sin pruebas microscópicas de invasión eran abundantes a las 10 semanas mientras que a las 24 semanas, el 100% de los ratones muestra cáncer invasivo con el crecimiento a lo largo de lesiones metastásicas. A raíz de la evaluación histológica de los tejidos, el compartimiento del estroma de los PIN y las lesiones invasoras tumores de próstata se forma selectiva elimina por LCM (Figura S1] y el ARN se extrajo, amplificado y sometidos a análisis de microarrays.

cDNA microarray análisis de microdissected estroma

A nivel mundial la expresión de genes perfil de microdissected estroma se obtuvo en tejido de la próstata a partir del 10 de ratones (4 con PIN, y 6 con tumores invasivos). La expresión génica análisis reveló 396 transcripciones con expresión diferencial entre las dos fases del tumor (con una tasa de falso descubrimiento (FDR), de 15%). Entre estos, 256 mostradas superior y 140 menores de expresión en cáncer invasivo estroma que en PIN-estroma asociados (Tabla S1]. Ontología de genes funcionales (GO) anotación análisis reveló que uno de los más representados significativamente en las familias de genes en el tumor de estroma invasoras fue anotado al término endopeptidase actividad y que figuran transcripciones de codificación de las enzimas proteolíticas, entre ellas las proteasas lisosomales, asparaginyl endopeptidases, metaloproteinasas de la matriz y proprotein convertases (Cuadro S2]. Los genes funcionales dentro de esta familia que puedan ser relevantes para la progresión tumoral codificar cathepsins B, C, D, Z, legumain, disintegrin-like y metalloprotease reprolysin tipo con thrombospondin tipo 1 motivo 4 (ADAMTS4), metaloproteinasas de la matriz 2 y 3 (MMP2, MMP3), y FURIN, que los procesos latentes precursor en proteínas biológicamente activas sus homólogos (Tabla 1].

Varios de los otros genes expresados diferencialmente en el estroma reactivo, anotado al término región extracelular, también fueron candidatos participantes en la regulación de crecimiento del tumor y la invasión. De este modo, el aumento de expresión de genes que codifican los componentes de la matriz estructural entre ellos, biglycan, procollagen tipo III, y IV, cartílago asociado proteínas, reguladores de crecimiento insulina-factor de biodisponibilidad (IGFBP3), uroquinasa receptor activador del plasminógeno (PLAUR) y los receptores del factor de crecimiento (PDGFRB) , Pueden desempeñar todas las partes esenciales en el control del crecimiento de las células mesenquimales y la diferenciación, que a su vez puede influir en el crecimiento del tumor (Tabla 1].

La validación de resultados de microarrays

Un subconjunto de los genes expresados diferencialmente fueron validados por cuantitativa en tiempo real de RT-PCR de ARN extraído de microdissected PIN y estroma tumoral invasiva derivados de animales que no habían sido utilizados para el análisis de microarrays. Los genes seleccionados para la validación codifican las proteínas implicadas en proteólisis (metaloproteasa de matriz extracelular 3 (MMP3), catepsina C (CTSC), catepsina D (CTSD), y legumain (LGMN)), la modulación del factor de crecimiento tipo insulina-1 biodisponibilidad (IGFBP3), regulación de tumor del estroma y crecimiento de las células, incluidas las plaquetas derivadas de receptor del factor de crecimiento beta (PDGFRB), receptor del factor de crecimiento proteína ligada 14 (GRB14), tumor de proteínas como D52-1 (TPD52L1) y PTEN-quinasa inducida por 1 (PINK1), de células ciclo de regulación (tumor de la hipófisis la transformación de genes, PTTG1), y la supervivencia (IAP baculoviral repetir-con 5, BIRC5, Figura 2A]. De acuerdo con datos de los microarrays, MMP3, PDGFRB, CTSD, BIRC5, CTSC, PTTG1, IGFBP3, y LGMN se encontraron para mostrar, respectivamente, 6 - 6, -, 7 -, 8 -, 14 -, 18 -, 19 - y 19 veces más alta expresión en el cáncer invasivo estroma que en PIN estroma. En un mayor apoyo de los microarrays de datos, GRB14, TPD52L1 y PINK1 mostradas 4 - 4 - y 5 - veces menor expresión en cáncer invasivo que en PIN estroma (Figura 2A]. El análisis inmunohistoquímico confirmó que la expresión de cathepsins D, B y Z fue casi exclusivamente localizadas en el estroma de los tumores invasivos (Figura 2B, E y S2A, B), pero estuvo ausente de PIN estroma (Figura S2C, puntas de flecha). Anti-anticuerpos vimentina (Figura 2C], el doble de lucha contra la catepsina D / anti-anticuerpos vimentina (Figura 2D], y el doble de lucha contra la catepsina D / anti-actina de músculo liso de anticuerpos (datos no presentados) tinción sugirió que se expresaron cathepsins predominantemente de fibroblastos y miofibroblastos. Anti-anticuerpo SV40, que tiñen las células tumorales sólo, y la lucha contra la catepsina patrones de tinción de anticuerpos eran mutuamente excluyentes, lo que indica que catepsina-células positivas en el estroma no eran las células tumorales que habían emigrado y separados fuera de la masa primaria (Figura 2E-G ). Western blot de lisados de fibroblastos cultivados obtenidos a partir de próstatas teniendo PIN lesiones y cáncer invasivo confirmado la inducción de cathepsins B, D y Z en invasoras tumor derivado de los fibroblastos, incluso después de varios días de la cultura (Figura 2H].

Cruz-especies-expresión de genes comparación proporciona pruebas de que orthologs humanos de los genes inducidos en el estroma de invasoras CR-2TAg tumores de cáncer de próstata predecir la supervivencia de los pacientes

El perfil de expresión génica del tumor invasivo asociados en el estroma CR2-Etiqueta modelo de ratón es compatible con la remodelación de tejidos y pueden reflejar concebible de acogida del tejido estromal respuesta a algunos tipos de cáncer invasivo, independientemente de las especies. Para determinar si el ratón del estroma genes identificados en este documento se expresan en los cánceres de próstata humanos y para poner a prueba su potencial relevancia para la supervivencia de los pacientes, hemos desarrollado una lista de orthologs humanos de los genes del ratón que se expresó diferencialmente entre PIN-y el cáncer invasivo estroma. Los genes dentro de la lista se subdivide en las que se upregulated (con la etiqueta "estroma" genes) y los que se downregulated (con la etiqueta "estroma abajo" genes) en el cáncer invasivo-estroma (Tabla S3]. Un publicados anteriormente conjunto de datos de pacientes con cáncer de próstata [13] para los cuales tanto la expresión génica y la recurrencia de la enfermedad se obtuvieron datos se analizaron para la expresión de los dos grupos de genes. Agrupación jerárquica sin supervisión se utilizó para dividir los pacientes en dos grupos basados sólo en los perfiles de expresión de los genes en nuestras listas. Standard Se usaron métodos estadísticos para determinar (a) si los dos grupos de pacientes definido de este modo mostraron diferencias estadísticamente significativas en términos de supervivencia y recurrencia de tiempo libre (Kaplan-Meier análisis), y (b) si los genes dentro de nuestras listas significativamente mayor poder predictivo de genes seleccionados al azar (análisis univariado cox).

Sin supervisión jerárquica agrupación de 79 pacientes con carcinoma de próstata [13], basada en "estroma" genes dio lugar a dos grupos de pacientes (Figura 3A], con una diferencia significativa en la recurrencia de tiempo libre, según la evaluación de Kaplan-Meier análisis de supervivencia (log-rank test p = 8,05 × 10 -5, Figura 3B]. Por el contrario, los grupos de pacientes obtenidos sobre la base de "estroma abajo" la agrupación de genes no difirió significativamente la recurrencia en el tiempo libre,-(p = 0,086, Figura S3A]. Cruz-especies-expresión de genes, por lo tanto, el análisis indica que los genes encontrados a ser inducido en el estroma, en respuesta a la progresión tumoral en CR2-etiqueta del ratón modelo no sólo se expresa en cáncer de próstata humano, pero fueron capaces de predecir los resultados del paciente.

La supervivencia de capacidad predictiva de ratón del estroma genes en diferentes tipos de cáncer humano

Teniendo en cuenta que una reacción del estroma tumoral a la invasión no sólo se produce en muchos tipos de cáncer, pero probablemente promueve la invasión tumoral y metástasis, es concebible que al menos algunos de los cambios moleculares que se producen en el microambiente tumoral durante la progresión tumoral pueden ser comunes a diferentes tipos de cáncer . Para hacer frente a esta hipótesis que hemos probado la aplicabilidad como indicador pronóstico de la expresión génica del estroma conjunto identificados en la etiqueta-CR2 modelo de ratón para varios tumores malignos humanos conocidos para inducir una sólida reacción del estroma, incluidos los de mama, pulmón y carcinoma gástrico. La expresión de genes establecidos También se puso a prueba en el carcinoma de células renales, un tumor con una débil respuesta del estroma, donde no se esperaba tener valor pronóstico.

Agrupación jerárquica sin supervisión de 295 primeras fases de carcinoma de mama los pacientes [14] usando la lista de genes upregulated del estroma ( "estroma") identificó dos grupos de personas (Figura 4A]. Kaplan-Meier análisis de supervivencia de los dos grupos indicaron que fueron significativamente diferentes en lo que respecta a la supervivencia (p = 6,97 × 10 -5, Figura 4B]. El mismo análisis realizado con respecto a la metástasis libre de evolución en lugar de tiempo de supervivencia demostró que los dos grupos también difieren significativamente en el conjunto de metástasis libre de la enfermedad (p = 0.0018, Figura 4C]. De acuerdo con nuestras observaciones sobre el cáncer de próstata, los genes que se encuentran downregulated en el estroma ( "estroma abajo") agrupado los pacientes en grupos que no difieren en medida significativa en la supervivencia (p = 0,2, figura S3B], o metástasis libre de la enfermedad ( p = 0,72, Figura S3C].

Por el contrario, cuando "estroma" genes se utilizaron para el grupo primario 86 adenocarcinomas de pulmón (67 fase I y 19 de tumores en estadio III) [19], los grupos obtenidos no muestran una diferencia significativa de supervivencia (p = 0,985, Figura 4D]. Lo mismo puede decirse de una cohorte de primaria de 90 pacientes con adenocarcinoma gástrico [20], (p = 0,583, Figura 4E]. Como era de esperar, sobre la base de la escasez de la respuesta del estroma, sin supervisión jerárquica de la agrupación primaria 177 de carcinoma de células renales los pacientes [21], utilizando el "estroma" los genes no ceder a grupos de pacientes con muy diferentes curvas de supervivencia (p = 0,513, Figura 4F ).

Cox análisis univariante se proporciona una lista de genes relacionados con la supervivencia

Aunque sin supervisión y clustering de Kaplan-Meier análisis reveló que la lista general de "estroma" genes ha elevado valor pronóstico de próstata y de pacientes con cáncer de mama, no aportar pistas sobre la identidad de los genes que mejor predicen la supervivencia. Para abordar esta cuestión, hemos realizado el análisis univariado de Cox de la correlación entre el nivel de la expresión génica y tiempo de supervivencia. Este análisis produce, para cada gen en nuestra lista, az valor que indica la fuerza y el signo de la correlación: los valores positivos de z> 1,96 indica que la sobreexpresión del gen fue estadísticamente asociado con mal pronóstico (p <0,05), mientras que los valores negativos de z <-1,96 fueron estadísticamente indicativa de buen pronóstico (p <0,05), (Cuadros S4-8). En general, de próstata y de mama conjuntos de datos, "estroma" genes tendieron a tener una mayor z valores en comparación con todos los genes presentes en el chip, lo que confirma que la sobreexpresión de estos genes se asoció con la supervivencia de los pacientes pobres (esquemáticamente representados en la figura 5A, B].

Una cruz de la lista de comparación de las transcripciones estadísticamente significativa con los valores z (p <0,05) en la próstata y de mama conjuntos de datos (tablas S4, S5) identificó 12 genes que son comunes a ambas listas. Entre estos genes se transcripciones que codifican factores de transcripción (CBFB), proteínas nucleares que regulan la importación nuclear (KPNA2), proteínas implicadas en la organización estructural del núcleo (TMPO), proteínas implicadas en la organización de cromosomas (PTTG1, SMC4l1), y una proteína asociados con la separación centrosoma (NUSAP1). Otros genes cuya sobreexpresión se asocia a peor supervivencia de mama y pacientes con cáncer de próstata codificar los reguladores de la diferenciación (ROD1), proteínas quinasas (MAPK4), y los reguladores de organización citoesqueleto (TMSB10, Figura 5C]. Además de los 12 genes conjunto, algunos de los "estroma" genes muestra un tumor específico de asociación con el pronóstico. Así, la sobreexpresión de genes entre ellos CX3CL1, FURIN y MTLG se asocia a peor pronóstico en pacientes con cáncer de mama, pero un resultado favorable en pacientes con cáncer de próstata. Del mismo modo, la alta expresión de la catepsina familia de proteasas (CTSC, CTSZ, CTSB) resultó ser un indicio de mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama, pero al parecer no tienen gran valor predictivo en pacientes con cáncer de próstata. Cox análisis univariante por lo tanto, confirmó que la sobreexpresión de "estroma" genes se asoció con pobres resultados del paciente y permite la identificación de 12 genes que tienen un fuerte valor predictivo para la supervivencia de próstata y de pacientes con cáncer de mama.

Expresión de PTTG1 y CTSD en cánceres humanos

Dos genes de la "estroma" lista fueron seleccionadas para la validación de inmunohistoquímica en tumores humanos, que es el principal objetivo de determinar su localización en lugar de una evaluación precisa de su expresión. El securin gen (PTTG1) fue seleccionada porque muestra la correlación más fuerte con los pobres resultados de la próstata y tanto pacientes con cáncer de mama. La catepsina D gen (CTSD) fue seleccionada porque se consideró que (junto con otros miembros de la proteasa catepsina familia) uno de los más fuertemente inducidos por las transcripciones en la reacción del estroma CR2-Etiqueta modelo de ratón y porque su expresión ha estroma se asocia a peor pronóstico en el cáncer de mama [22].

Securin y catepsina D expresión fueron evaluados mediante técnicas de inmunohistoquímica en un conjunto independiente, de 20 de próstata, 47 de mama, pulmón 20, y 11 muestras de cáncer de ovario. Débil perinuclear securin expresión se observó en ocasionales células en condiciones normales de la próstata y de mama epitelio, pero no en el correspondiente estroma (datos no presentados). Un aumento en securin expresión se observó en ambos epiteliales y del estroma de células compartimentos de su último estadio de lesiones PIN y en carcinoma de mama in situ (Figura 6A, C]. Un nuevo aumento de la tinción con intensidad a lo largo de redistribución tanto a citoplasma y núcleo se observaron en cáncer invasivo etapas (Figura 6B, D], con los más altos niveles de expresión observado en cáncer de mama metastásico lesiones, independientemente de su ubicación (datos no presentados). Elevados de expresión de securin se observó en todos los tumores malignos a prueba, entre ellos de pulmón (Figura 6E] y el cáncer de ovario (Figura 6F]. De acuerdo con datos de los microarrays, expresión securin se encontró un aumento en el estroma de todos los tumores analizados en comparación con el tejido normal estroma. Fibroblastos del estroma tumoral y la infiltración de leucocitos se encontraban entre las células del estroma que expresó securin (Figura 6A-F, puntas de flecha].

Catepsina D expresión se observó en ambos epiteliales y del estroma de las células de próstata y tumores de mama (Figuras 7A, B], mientras que los tejidos normales se carece en gran parte de la lucha contra la catepsina D tinción de anticuerpos (datos no presentados). De pulmón de células grandes y carcinomas de pulmón está representada principalmente adenocarcinomas de células tumorales catepsina D de expresión y la debilidad de expresión del estroma (Figura 7C, D]. Sorprendentemente, las pequeñas células del cáncer de pulmón (CEP) y de células grandes de pulmón carcinoma neuroendocrino (LCNEC) está representada distintivo catepsina D expresión que se limita a las células del estroma compartimiento con poca o ninguna tinción de las células tumorales (Figura 7E, F]. Este patrón de expresión fue muy reminiscencia de la observada en la etiqueta-CR2 modelo murino.

Estroma catepsina D expresión puede influir en la migración de células tumorales y la proliferación

Dado que la catepsina D del estroma expresión se observa en un amplio espectro de tumores, nos dirigimos sus posibles consecuencias funcionales sobre el comportamiento de las células tumorales. En primer lugar, evaluó la migración de próstata tumor neuroendocrino de células derivados de TAG-CR2 tumores de ratón (PNEC células, [23]], en 3D Matrigel co-culturas con peso (CTSD + / +) o catepsina D-deficiente (CTSD - / -) fibroblastos. PNEC células muestran una mayor migración, cuando co-cultivadas con CTSD + / + que con el CTSD - / - fibroblastos (Figura 8A]. Se obtuvieron resultados similares utilizando la cámara de Boyden ensayos donde PNEC células migraron en función de los medios de cultivo condicionados derivados de CTSD + / + o CTSD - / - fibroblastos utilizado como chemoattractant (datos no presentados). Además, el tratamiento de PNEC las células cultivadas en plástico acondicionado con los medios de comunicación derivados de CTSD + / + fibroblastos dado lugar a una mayor proliferación (Figura 8B] y un cambio fenotípica caracterizada por una alargada de tipo neuronal morfología (Figura 8C]. Condicionado medio de cultivo de CTSD - / - fibroblastos no inducir a estos proliferativa y cambios morfológicos (Figura 8B, D]. Sin embargo, condicionado medio de cultivo de CTSD-/ - fibroblastos transfectadas con peso CTSD cDNA recapitulan los cambios fenotípicos PNEC de las células inducida por peso fibroblastos derivados medio (datos no presentados), lo que sugiere que del estroma catepsina D expresión puede influir en tumor neuroendocrino la proliferación celular y la motilidad .

Discusión

El presente trabajo ha identificado una cruz de las especies pertinentes del estroma conjunto la expresión de genes en respuesta a la invasión tumoral. Invasoras CR2-TAG cáncer estroma está representada la inducción de genes de codificación de numerosas proteínas ECM ECM y las enzimas degradantes, incluida la ADAMTS4, MMP2, MMP3 CTSB, CTSC, CTSD y PLAUR. La combinación de la especificidad por el sustrato de las enzimas proteolíticas inducida abarca una amplia gama de proteínas ECM, incluyendo colágenos, fibronectina, fibrina, laminina y vitronectin, latente y los factores de crecimiento, entre otros, del factor de crecimiento hepatocitos (HGF), TGF-β, y de base FGF [11], [24], [25]. El perfil de expresión génica de las células del estroma asociados a la progresión tumoral en CR2-TAG ratones es, pues, coincidente con la remodelación de ECM funciones que cabe esperar en una sólida del estroma reacción a los procesos que van desde la mecánica a daño tisular el crecimiento del tumor.

Estroma reacción para el crecimiento del tumor invasivo es la creencia generalizada de apoyo progresión tumoral mediante el suministro de factores de crecimiento, citocinas y componentes de ECM que promueven la supervivencia de las células tumorales, la proliferación y migración [1], [3]. Como tal, al menos algunos de los genes implicados en la orquestación del estroma tumoral respuestas a la invasión del tumor debe predecir la evolución. En consonancia con esta noción, la firma la expresión de genes identificados en el presente estudio tiene un potente valor pronóstico para la próstata y el cáncer de mama, ambos de los cuales se asocian con una sólida respuesta del estroma. Sin embargo, su aplicabilidad a los cánceres humanos asociada con una reacción del estroma no es universal y no puede predecir el resultado de gástricas y cáncer de pulmón. Hay varias explicaciones posibles para esta observación. En primer lugar, una respuesta del estroma y la correspondiente remodelación de tejidos son procesos complejos que comprenden una amplia gama de celulares y moleculares y los acontecimientos que pueden variar entre los tipos de tumores, en parte debido a las características del tumor y en parte debido a la variabilidad en las propiedades de acogida del tejido de un órgano a otro . Por lo tanto, la reacción del estroma típicamente asociados con la próstata y el cáncer de mama en particular es rico en fibroblastos, miofibroblastos y las proteínas ECM, se asemeja al observado en el CR2-Etiqueta modelo. Los cánceres que generan ulcerante lesiones, como los carcinomas gástricos, por otro lado, podrían ser llamados a inducir una reacción del estroma con un lugar más destacado componente inflamatorio, que se caracteriza por una abundante leukocytic infiltrarse y la angiogénesis. Parece probable que estos dos tipos de reacción del estroma mostrar la expresión de genes diferentes firmas, cada una de ellas con pronóstico potencial importancia para el tipo de cáncer al que está asociado. En segundo lugar, el uso de diferentes enfoques técnicos, incluidos los diferentes tipos de microarrays que contienen no idéntico conjuntos de genes de interés para el estroma y las correspondientes anotaciones, podrá, al menos en parte, cuenta para la aparente falta de coherencia entre la firma de estudios [16], [26 ]. En tercer lugar, la mayoría de tumores humanos de perfiles se han realizado estudios sobre la mayor parte del tejido tumoral, de tal manera que es imposible conocer la representación relativa de la componente del estroma que puede variar significativamente entre las muestras, ocultando la aparición de un consenso firma. Es evidente que un trabajo importante será necesaria para generar y comparar los perfiles de expresión génica de acogida respuestas a diferentes tipos de tumores por medio de enfoques técnicos. Sin embargo, candidato del estroma la expresión génica firmas que son relevantes para la progresión tumoral posible que ya emerge de la comparación de los resultados de estudios como el nuestro a los que han abordado la posible pertinencia en relación con el cáncer de las células del estroma perfiles de expresión génica en una variedad de condiciones fisiopatológicas, incluyendo proliferación fibroblástica trastornos y lesiones asociadas a la reparación tisular.

Un reciente estudio identificó un conjunto de genes cuya expresión patrón distinguido dos trastornos de proliferación fibroblástica el uno del otro, los tumores fibrosos solitarios (SFT) y de tipo desmoide fibromatoses (DTF), y demostró que la expresión de este gen conjunto fue capaz de definir dos grupos de pacientes con carcinoma de mama que difieren significativamente en la supervivencia general [27]. Cruz-estudio de comparación entre nuestro conjunto de "estroma" los genes y los "genes DTF" reveló 15 transcripciones común (Tabla S9]. Dentro de los genes comunes a las dos firmas son varios componentes de ECM ECM y las enzimas degradantes, incluida la COL1A2, COL3A1, BGN, MPAF2 y CTSC. Por el contrario, la comparación con "SFT conjunto de genes" del mismo estudio no produjo un solapamiento significativo, como fue el caso para la comparación de la "estroma abajo" genes tanto a la DTF y SFT conjuntos de genes. Estas observaciones sugieren que el "estroma" genes tienen más probabilidades de encontrarse en DTFs, conocido por ser más agresivo a nivel local y tener un mayor grado de repetición que SFTs.

Un estudio centrado en la expresión de genes en el programa principal fibroblastos cultivados en respuesta a suero, cree que reflejan el papel funcional de los fibroblastos en la cicatrización de la herida, constató que la "herida de respuesta a la firma" fue coordinada reguladas en muchos tumores humanos y es un poderoso predictor de la evolución clínica en varios carcinomas [28], [29]. Sin embargo, la coincidencia entre los conjuntos de genes de este estudio y la nuestra se limitaba a 8 genes (Tabla S9]. Esto puede atribuirse, al menos en parte, a diferencias de diseño experimental, ya que Chang et al. abordar el efecto de suero in vitro en cultivos de fibroblastos que analizamos la reacción del estroma para la progresión tumoral in vivo, lo que implica la contribución de varios otros componentes del microambiente tumoral, incluyendo la infiltración de leucocitos, ECM deposición, y la angiogénesis.

Un tercer estudio utilizó serie de análisis de expresión génica (SAGE) para evaluar los perfiles de expresión de la epiteliales y del estroma de las poblaciones de células malignas de mama del tejido [30]. La comparación de estas transcripciones con los que se encuentran señaladas en el presente trabajo se puso de manifiesto varios genes que son compartidas entre nuestro estudio y sus "células mioepiteliales, miofibroblastos" y "estroma" SAGE bibliotecas, incluida la ADFP, ANXA1, BGN, CCl4, COL1A2, COL3A1, CXCR4 , LAPTM5, MMP2, MT2A, SERPINF1, TMSB10 y TRA1 (Tabla S9].

Cabe señalar que dos de los genes que se encontraron pobres para predecir la supervivencia de la próstata y pacientes con cáncer de mama en el presente estudio (PTTG1 y COL1A2), forman parte de una de 17 genes asociados con la firma de metástasis [15]. Expresión de la PTTG1 gen fue uno de los componentes más importantes dentro de los pronósticos de expresión génica en la firma de próstata y carcinoma de mama. Su expresión en el compartimiento de células tumorales de próstata y cáncer de mama muestras y su aumento con el grado de progresión tumoral fueron coherentes con su implicación en el desarrollo tumoral [31]. Sorprendentemente, mientras que la mayoría de los estudios han informado de su expresión que se limita a las células tumorales del compartimento, se observó securin expresión tanto en el estroma tumoral y los compartimentos de los cánceres invasivos. Esclarecimiento del papel de securin en el estroma tumoral será de interés. Es atractiva para especular, por ejemplo, que securin-positivas las células del estroma reflejan un estado activo que puede contribuir a la progresión tumoral.

Otra observación inesperada del presente trabajo fue el robusto inducción de cathepsins B, C, D y Z, en la invasoras CR2-TAG cáncer simulando el estroma casi exclusivamente del estroma catepsina D patrón de expresión en humanos y CEP LCNEC. Cathepsins Recientemente se han demostrado ser upregulated en varias células de los islotes pancreáticos tumor modelo en el que han contribuido al crecimiento del tumor invasivo [32], [33]. También han sugerido a participar en la progresión de una variedad de cánceres humanos [34], [35] y su expresión en el cáncer de mama estroma se ha demostrado que se correlaciona con mal pronóstico [22]. Estos resultados son consistentes con nuestro presente observaciones y los informes de otros que catepsina D tiene propiedades mitogénica en las células tumorales y fibroblastos [36]. Aunque la importancia funcional de los derivados del estroma cathepsins en la progresión tumoral aún no se ha dilucidado plenamente, el estroma se conoce para proporcionar MMP-proteólisis mediada por una variedad de modelos de tumor y algunos cánceres humanos [9]. Es concebible que por lo menos en algunos tipos de tumores cathepsins pueden funcionar en una forma análoga.

Los recientes trabajos de otros ha demostrado que los genes del cáncer identificados en modelos de ratón puede ser utilizado para la sonda humanos tumores malignos y para identificar los genes humanos implicados en el desarrollo del cáncer y la progresión [37] - [40]. Nuestras observaciones demuestran la viabilidad de la utilización de un ratón modelo de tumor para identificar un estroma la expresión de genes asociados a establecer la progresión tumoral que está presente no sólo en humanos de próstata y cáncer de mama, sino que puede predecir el resultado de ambos tumores malignos. Varios de los genes dentro de los señalados en el presente estudio se han asociado a mal pronóstico, recurrencia y metástasis proclividad de varios tumores humanos y su función precisa en la promoción de la progresión tumoral puede ahora ser evaluada.

Materiales y Métodos
Los Animales y la recogida de muestras

Ratones hemizygous para la etiqueta-CR2 transgén se mantuvieron en un determinado patógeno libre de instalación de acuerdo con las directrices de Suiza para la experimentación con animales (autorización # 1477). Las muestras (PIN próstatas y tumores de próstata) se obtuvieron de ratones transgénicos (CR2-TAG) expresando el virus símico 40 grandes antígeno T (SV40 TAG) en la próstata neuroendocrino de células en virtud de elementos reguladores de la cryptidin-2 genes (Defcr2), descrito anteriormente [17 ], [18]. Para el presente estudio, teniendo próstata temprano PIN lesiones y tumores invasivos de pulmón y con metástasis hepáticas se obtuvieron de 10 - y 24 semanas de edad ratones, respectivamente. Los tejidos fueron aislados en condiciones de libre RNasa, snap-congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.

Laser captura microdissection

LCM diapositivas de tejido prostático de 10 - y 24 semanas de edad ratones con lesiones PIN (n = 4 ratones) y cáncer invasivo (n = 6 ratones), respectivamente, fueron preparados de serie 8 - μ m de espesor tejidos congelados secciones colocado en una policloruro de nucleasa libre de membrana (Molecular Máquinas Industries, Glattbrugg, Suiza). Muestras de tejido fueron fijadas en etanol al 70% (30 segundos), teñidas con hematoxilina y eosina (15 segundos cada una), deshidratados en etanol clasificado, tratados con xileno y secado al aire en un recipiente estéril campana de flujo laminar. Las diapositivas se microdissected inmediatamente después de la tinción utilizando un láser μ Cut Microdissection sistema (Nikon Eclipse TE200). Todas las medidas y soluciones se realizaron bajo condiciones de libre RNasa. Generalmente, las células 1000-5000 se microdissected para su posterior extracción de RNA. Microdissected del estroma regiones dentro de μ m 0-100 y 0-300 μ m del compartimento epitelial en el PIN y el cáncer invasivo de cortes de tejido, respectivamente. Todas las muestras fueron sometidas a examen histológico antes de microdissection.

RNA, extracción, amplificación y análisis de microarrays

Total ARN se extrajo inmediatamente después de microdissection utilizando el ARN PicoPure Kit de aislamiento (Arcturus, Mountain View, CA, www.arctur.com ), De acuerdo a las instrucciones del fabricante. ARN fue cuantificado usando un espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware, EE.UU.), y la concentración oscila entre 10-50 ng / muestra. ARN de calidad se evaluó utilizando el ARN 6000 Pico Kit de ensayo (Agilent). Sólo la buena calidad del RNA fue sometido a dos rondas de amplificación lineal utilizando el RiboAmp ™ kit de amplificación del ARN (Arcturus), de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y Arna fue cuantificado usando RNA 6000 Nano Kit de ensayo (Agilent). Etiquetados cDNA se obtuvo mediante la transcripción reversa de 5 μ g de Arna y la incorporación de Cy3-dCTP y Cy5-dCTP (Amersham Biosciences, Amersham, Reino Unido). Microarrays que contienen 17000 clones de cDNA manchas se obtuvieron a partir de Lausana el ADN Facilidad Array ( http://www.unil.ch/dafl ) Y de expresión análisis realizado mediante el NIA 17k clon set ([41] http://intranet.isrec.isb-sib.ch/microarrays/arrays_users.html ). Hibridación de la etiqueta de microarrays de ADNc se realizó durante 16 horas a 64 ° C en una cámara de humidificado (Corning Costar, Cambridge, MA). Microarrays fueron imágenes utilizando la escáner ScanArray 4000 (Perkin Elmer, Foster City, CA); Cy3 y Cy5 intensidad de fluorescencia se obtuvieron utilizando el software ScanAlyze ( http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm ). La expresión génica se cuantificó con el SMA paquete de impresión utilizando la punta del grupo lowess normalización sin antecedentes resta [42], [43]. Para cada variedad y cada clon ratios log2 (M valores) y la intensidad media log2 (valor) de Cy3 y Cy5 señales fueron así obtenidos. Intensidad valores producidos por el software de análisis de imágenes ScanAlyze así como normalizar la expresión génica de datos para todas las diapositivas están disponibles en la GEO, número de GSE5945.

Diseño experimental y análisis estadístico

Para la identificación de genes expresados diferencialmente entre microdissected estroma de los PIN y el cáncer invasivo de las etapas, las muestras de 10 ratones, 6 con cáncer invasivo y 4 con el PIN, se analizaron. La referencia común (control) para todas las 10 muestras se agruparon proporcionada por el ARNm de 4 PIN muestras. En cada uno de los 10 el control de microarrays de ARN (agrupados de 4 muestras PIN) fue marcado con Cy3 y la prueba de ARN (derivados de cada lesión PIN y carcinoma invasor) con Cy5. Log-ratios de la abundancia de mRNA de cada clon se analizaron con un modelo de dos colas, muestra dos t-test para identificar diferencialmente clones expresó. Para controlar la tasa de falsos positivos, teniendo en cuenta la cuestión de múltiples pruebas hemos utilizado la Benjamini-Hochberg [44] método para elaborar las listas de expresados diferencialmente clones controlados con una tasa de falso descubrimiento (FDR).

Análisis funcional de genes expresados diferencialmente

Las listas de los expresados diferencialmente clones obtenidos como se ha descrito anteriormente fueron analizados desde el punto de vista funcional de anotación de buscar estadísticamente excesivamente Gene Ontología (GO) anotaciones [45]. Este análisis se realizó por separado para inducidos y reprimidos clones. Desde GO términos se atribuyen a los genes en lugar de los clones, las listas de expresados diferencialmente clones fueron traducidos a las listas de genes (identificados por números de identificación de genes Ensembl [46]], utilizando la Refseq ID, el gen informó de símbolos para cada clon en la anotación de los microarrays, y la correspondencia entre identificadores de Refseq, genes y símbolos identificadores de Ensembl dada por el Ensmart herramienta para la navegación Ensembl. Las listas de genes fueron en general más corta que las listas originales de los clones tanto por múltiples clones se asociaron con el mismo gen y porque los clones que no puede estar asociado con cualquier gen estaban presentes. Gene Ontología anotaciones para todos los genes asociados con al menos un clon manchas en el microarray se descargan desde ENSMART [47]. A continuación, prueba las listas de inducidos y reprimidos por los genes excesiva de GO términos de la aplicación de la exacta de Fisher prueba.

El análisis de supervivencia de datos públicos

Expresión de genes y datos de supervivencia de una cohorte de pacientes con cáncer de próstata se amablemente prestada por William Gerald [13]. A disposición del público los datos de expresión génica para las cohortes de cáncer de mama [14], el cáncer de pulmón [19], cáncer gástrico [20], y carcinoma de células renales (CCR) [21] los pacientes se obtuvieron en línea junto con sus correspondientes datos de supervivencia. Cuando crudo Affymetrix se dispone de datos (próstata y el cáncer de pulmón) se les aplicó el algoritmo de RMA rma () para obtener datos de expresión génica. En los demás casos (de mama, cáncer gástrico y carcinoma de células renales) hemos utilizado la expresión datos proporcionados por los autores. Agrupación jerárquica sin supervisión de los pacientes se realizó a través del coeficiente de correlación de Pearson para definir disimilitud entre los perfiles de expresión del paciente, la obtención de dos grupos de pacientes en cada caso. La significación estadística de las diferencias en probabilidad de supervivencia entre los dos grupos se calculó con el log-rank test. Cox univariante se realizó un análisis para determinar correlaciones significativas entre el perfil de expresión de cada gen representadas en las fichas y del tiempo de supervivencia. Estos análisis se realizaron con R (r) y la Bioconductor suite biocond ().

Tiempo real para la cuantificación de transcripción inversa-PCR

cDNA se obtuvo utilizando una leucemia murina Moloney virus de la transcriptasa inversa y RNasa H menos (Promega, Madison, WI). 50 ng de ARN plantilla total se utilizaron por reacción. PCR en tiempo real la amplificación se realizó utilizando un Taqman PCR Universal mastermix ABI en un instrumento Prisma 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Cuantificación relativa de la meta, normalizado con un control endógeno (18s rRNA y GAPDH) se realizó utilizando un estudio comparativo (CT) de acuerdo al método de las instrucciones del fabricante. Los ensayos-on-Demand y sondas primer mix (Applied Biosystems) comercialmente disponibles para MMP3 (Mm00440295_m1), CTSD (Mm00515587_m1), CTSC (Mm00515580_m1), IGFBP3 (Mm00515156_m1), eucariotas 18S rRNA (Hs99999901_s1), y fueron diseñados utilizando Primer Diseño programa (Applied Biosystems) para PTTG1, BIRC5, PDGFRB, LGMN, GRB14, TPD52L1, PINK1. Las secuencias de adelante y atrás primers se proporcionan en los materiales suplementarios y de los medios.

Líneas celulares y la proliferación de ensayo

Cáncer de próstata neuroendocrino de células (PNEC) fueron descritos anteriormente [23] y cultivadas en 75 cm 2 frascos Costar recubiertas con alto peso molecular de poli-L-lisina (0,1 mg / mL, Sigma P1274) y laminina (2 μ g / cm 2, L2020, Sigma), en medio DMEM/F12 (Sigma) suplementado con 10% de SFB, el 1% no aminoácidos esenciales (NEAA, Gibco), B27 sérica suplemento (17504-044, Invitrogen), 5 ng / ml EGF (354001 , BDBiosciences) y 5 ng / ml bFGF (F5392, Sigma). Catepsina D deficiente (CTSD - / -) y de tipo salvaje fibroblastos (CTSD + / +) [36] se cultivaron en DMEM el medio suplementado con 10% de SFB y el 1% NEAA. Medio condicionado (CM) fue preparada con el 80% fibroblastos culturas confluyentes en DMEM sin FBS durante 48 h. Después de la recogida, el CM se centrifuga a 800 g durante 10 min, aliquoted y almacenarse a una temperatura de -80 ° C si no se utiliza inmediatamente.

Por la proliferación de ensayo, PNECs se trypsinized, contados y chapada en placas de 96 pocillos (Costar) a 15 000 μ l cells/100 medio /. Medio fue retirado después de 24 h en placas, las células una vez lavadas con PBS e incubadas con el correspondiente medio condicionado (100 μ l / pocillo) de 24-96 h. La proliferación celular se evaluó mediante la proliferación de células BrdU ensayo kit ELISA (cat. 11 647 229 001, Roche), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Absorbancia se midió utilizando un lector de placas de ELISA a 410 nm con antecedentes resta a 492 nm.

Inmunohistoquímica

Parafina embebido en cortes de tejido (4 - μ m de espesor) se deparaffinized hidratado y de acuerdo a procedimientos estándar. Peroxidasa endógena se quenched con 1% de peróxido de hidrógeno durante 15 minutos. Las secciones fueron sometidos a la recuperación de antígenos de ebullición en solución tampón de citrato (10 mM, pH 6,0) o EDTA (1 mM, pH 7.5) durante 15 minutos, enfriado, lavado, y se incubaron con avidina / bloqueo de biotina soluciones para saciar la biotina endógena. Congelado 4 - μ m de espesor fueron cortes de tejido de acetona-fijos y rehidratada antes de inmunoticción y bloqueado para uniones no específicas con el 1% de albúmina sérica bovina (Fluka). Para la tinción de anticuerpo único, cada una de las secciones fueron incubadas con anticuerpos primarios (diluidos como se indica a continuación) durante 40 minutos a temperatura ambiente (anti-SV40 y anti-anticuerpos securin se incubaron durante la noche a 4 ° C). Por doble tinción de anticuerpos, las secciones fueron incubadas con los dos anticuerpos de serie en dos pasos. Las secciones fueron procesadas mediante norma avidina-biotina técnicas inmunohistoquímicas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Diaminobencidina (DAB) se utilizó como cromógeno para la tinción de anticuerpos único, junto con 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfatasa (BCIP / NBT) o Fast Blue para la doble coloración de anticuerpos.

Los anticuerpos se compraron como sigue: biotina conjugada anti-ratón catepsina D (BAF1029, 50 μ g / ml, dil.1: 5), anti-ratón catepsina B (AF965, 100 μ g / ml, dil.1: 10), y de lucha contra la catepsina X / Z / P (AF1033, 100 μ g / ml, dil.1: 5), todos de R & D Systems (San Diego, CA, EE.UU.); biotina conjugada anti-SV40 gran T, T antígeno pequeños (cat. 554151, 0,1 mg, BD Pharmingen, Dil. 1:20); biotina anti-vimentina Ab-2 Clon V9 (MS-129-P1, 200 μ g / ml, Neo Marcadores, Lab Vision Corporation, EE.UU., dil.1: 50 ); Anti-actina de músculo liso (Abcam Ltd, Cambridge, Reino Unido, dil.1: 50); ratón anti humanos securin (PTTG1) (ab3305, 0,2 mg / ml, Abcam, dil.1: 50); ECL streptavidina-HRP (de Amersham Biosciences); streptavidina-AP (Roche Ciencias Aplicadas); policlonal de conejo anti-inmunoglobulinas de cabra / HRP, de cabra anti-conejo inmunoglobulinas HRP, y BCIP / sustrato sistema de NBT (DakoCytomation); DAB comprimidos y Fast Blue BB sal (Sigma ). Por rutina examen histopatológico, 4 - μ m de espesor cortes de tejido congelado se H & E manchadas de acuerdo a procedimientos estándar.

Apoyo a la Información

Damos las gracias a William Gerald (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, NY) para proporcionar la principal expresión de genes y datos clínicos, Jeff Gordon (Universidad de Washington, St Louis) para proporcionar la amabilidad de la etiqueta-CR2 ratones y células PNEC, Christoph Peters (Universidad de Friburgo) para catepsina D-deficiente y peso fibroblastos, y Amin Issa y Melody Swartz (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) para ayudar a co-3D ensayos de cultura.