Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 14-14 (más artículos en esta revista)

60-C Fullereno: detección de fotoluminiscencia intracelular y la falta de efectos citotóxicos

BioMed Central
Nicole Levi (levinh3@wfu.edu) [1], Roy Hantgan R (rhantgan@wfubmc.edu) [3], Mark O Animado (mlively@wfubmc.edu) [3], David L Carroll (carrolldl@wfu.edu ) [1], Gaddamanugu L Prasad (glprasad@temple.edu) [4]
[1] Centro de Nanotecnología Molecular y Materiales y el Departamento de Física, Wake Forest University, Winston-Salem, NC 27105, EE.UU.
[2] Virginia Tech y la Universidad de Wake Forest Escuela de Ingeniería Biomédica y las Ciencias, Winston-Salem, NC 27105, EE.UU.
[3] Departamento de Bioquímica, Universidad Wake Forest en Ciencias de la Salud, Winston-Salem, NC 27157, EE.UU.
[4] Departamento de Cirugía General, Wake Forest University Health Sciences, Winston-Salem, NC 27157, EE.UU.

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Resumen

Hemos desarrollado un nuevo método de aplicación de C 60 a células cultivadas que no requiere agua-técnicas de solubilización. Normal de las células malignas y la adopción de C 60 y la inherente fotoluminiscencia de C 60 se detecta en varias líneas celulares. El tratamiento de células con hasta 200 μ g / ml (200 ppm), de 60 C no altera la morfología, citoesqueleto organización, la dinámica del ciclo celular ni inhibir la proliferación celular. Nuestro trabajo muestra que prístina C 60 no es tóxico para las células, y sugiere que a base de fullereno nanocarriers pueden utilizarse para aplicaciones biomédicas.

Fondo

Los recientes avances en la ciencia de los materiales han alimentado un enorme interés en numerosos potenciales aplicaciones biomédicas de diferentes nanomateriales. Por ejemplo, fullereno C 60 moléculas son únicos para sus múltiples usos funcionales en la ciencia de los materiales y la óptica [1 - 4], y se consideran para una gran variedad de aplicaciones biológicas (revisado en [5]], tales como sondas de imagen [6] , Antioxidantes [7 - 9] y los transportistas de drogas (taxol) [10]. Nuestro laboratorio está interesado en explorar si los nuevos multifuncionales nanopartículas pueden diseñarse para el tratamiento contra el cáncer y el diagnóstico. La realización de este objetivo requiere una mejor comprensión de las interacciones entre las nanopartículas y las células y es importante para determinar si procede o no las partículas por sí solos efectos crecimiento y la diferenciación celular. Hemos elegido C 60 para los estudios iniciales ya que la química establecida ofrecen la flexibilidad de combinar diversos biológicamente interesantes y pertinentes las moléculas.

Sin embargo, algunas propiedades indeseables de C 60 presente problemas específicos. Por ejemplo, debido a su inherente hidrofobicidad, C 60 es poco soluble y, por supuesto, las formas grandes micras de tamaño en los grupos de medios acuosos. Por lo tanto, los disolventes orgánicos se utilizan habitualmente para la solubilización de C 60 [11] En consecuencia, las células estudios biológicos con prístina C 60 han sido limitados.

Considerando que la conjugación química de C 60 a diversas moléculas solubles en agua mejora la compatibilidad general acuosa, prístina C 60 es habitualmente disuelto en tolueno [12, 13], tetrahidrofurano (THF) [14] u otros disolventes orgánicos y, a continuación, intercambiaron en el agua mediante la extracción la fase orgánica con agua. El resultado es a menudo la preparación se refiere a 'C soluble en agua 60' que suele ser de color amarillo claro y se calcula que contiene unos cien microgramos de C 60 / ml [15]. Se ha sugerido que la C 60 acuosa es tóxico para las células cultivadas y los efectos tóxicos se deben a la peroxidación de lípidos en las membranas celulares [16 - 19]. Varios grupos han informado de que C 60 (elaborado utilizando diferentes métodos) no es tóxico [20 - 24] y algunos han atribuido la toxicidad de C 60 a las cadenas laterales presentes en el funcionalizado C 60 [25]. Los posibles mecanismos que podrían contribuir a la toxicidad observada de nano C 60, incluye el disolvente efectos atmosféricos como la exposición de disolventes como el THF (según el fabricante). Además, la adquisición de ionogenic a los grupos C 60 de cristal acuoso en la formación de los medios de comunicación a través de disolvente THF de cambio se ha informado de contribuir al potencial de consecuencias biológicas [26]. En apoyo de estas posibilidades, un estudio reciente sugiere que la toxicidad de THF-derivados solubles en agua nano C 60 se suprime mediante la eliminación de THF de γ-irradiación. [27].

El conflicto de datos a efectos citotóxicos de C 60 merece atención y requiere una resolución si estos materiales son para ser biológicamente útil. El siguiente simple hipótesis puedan reconciliar mutuamente con los datos contradictorios sobre los efectos citotóxicos de prístina fullerenos. C 60 sufre modificaciones durante la preparación de agua soluble C 60, y esos cambios son los responsables de los efectos citotóxicos. Considerando que la naturaleza exacta de tales modificaciones se desconoce en la actualidad, las hipótesis pueden ser probados y los efectos de C 60 pueden ser examinados de manera inequívoca si C 60 puede aplicarse a las células de tal manera que evite la necesidad de preparar soluble en agua C 60.

Los estudios presentados en este manuscrito examinar la cuestión clave de observaron efectos citotóxicos de C 60 en normal y culto maligno de mama las células epiteliales. Hemos desarrollado una nueva, con todo simple, el método a aplicar directamente C 60 a las células cultivadas modificando una célula biológica técnica utilizada en anoikis estudios [28, 29].

Aunque varias propiedades clave de fullerenos, como la característica fotoluminiscencia (PL) de C 60 están bien caracterizados en las soluciones [30] y de polímeros complejos [31], pocos han examinado tales propiedades celular en medio ambiente. Fotoluminiscencia de cristalino C 60 produce debido al acoplamiento de los modos vibracionales de la celosía con transiciones electrónicas y la firma de PL fullereno cristales pueden ser útiles para rastrear la presencia de C 60. Los resultados presentados en este trabajo demuestran que no modificado C 60 cristales se toman por las células e intracelulares C 60 conserva su propiedades ópticas, según lo determinado por las mediciones de PL. Es significativo que nuestros estudios revelan que la C 60, preparado por una variedad de métodos hasta 200 μ g / ml, no es tóxico para una serie de tipos de células.

Resultados y discusión

Para eliminar el uso de disolventes orgánicos tóxicos para la aplicación de C 60 a las células, hemos adaptado los métodos habitualmente utilizados en el cultivo de células estudios con recubrimiento de polímero de cultivo de tejidos siguientes platos evaporación de solventes [28, 29, 32]. Suspensiones coloidales de C 60 en metanol (0,2 mg / ml) fueron preparados por sonicación, tal como se describe en Materiales y Métodos y aplicada a platos de cultivo de tejidos como un recubrimiento uniforme. La fase orgánica se permite a evaporarse en una campana de cultivo de tejidos, lo que deja detrás de un revestimiento de C 60 en el plato. Las celdas están chapados a estos platos de C 60. El C 60 chapada en utilizar esta técnica no requiere la manipulación y no contiene duras disolventes orgánicos en cultivos celulares. Nos referimos a esta preparación del C 60 como 'metanol C 60'.

1) Características de metanol C 60

Sonicación en metanol produce una suspensión uniforme de C 60, que tarda aproximadamente 10-30 minutos para resolver fuera de la suspensión. Esta lentitud de la solución permite disponer de tiempo suficiente para el registro de los espectros de absorción. Metanol C 60 es una luz de color marrón suspensión, indicativo de grandes cristales en supension, en comparación con el púrpura suspensiones de tolueno C 60 que se sabe que contienen significativamente menor tamaño de los cristales (Figura 1A]. Para caracterizar las propiedades físico-químicas de metanol C 60, a fin de determinar su características espectrales y se midió el tamaño de partículas de las suspensiones coloidales de C 60 en metanol. Por ejemplo, C 60 tiene una característica triplete-triplete espectro de absorción a 350 nm [33 - 35]. Los espectros de absorción de C 60 en metanol es comparable con la que preparó en tolueno (λ max = 337 nm), lo que es más comúnmente utilizado para suspender C 60 (Figura 1B].

C 60 exhibe un característico color naranja rojizo PL firma en el estado sólido con un pico a 735 nm [31, 36, 37]. Metanol C 60 mantenerse esta propiedad clave que depende de la intersticial espacio entre las moléculas de C 60 en la estructura cristalina con una amplia pico alrededor de 750 nm (Figura 1C]. Espectral Estos resultados son consistentes con el comportamiento establecido de C 60, que presenta leves cambios en la absorción y PL picos depende de la temperatura [36] y el disolvente utilizado para dispersar C 60 [13]. De acuerdo con las características descritas anteriormente, metanol C 60 suspensiones, cuando se aplica a los sustratos de cultivo de tejidos, expuestos fácilmente detectables de cristal y los tamaños marcados PL cuando visualizan por microscopía de luz (que se examinan en la sección siguiente). En conjunto, estos datos sugieren que la C 60 sigue suspendido de manera adecuada en metanol y que las características espectrales son similares a los dispuestos en otros disolventes orgánicos.

Tamaño de las partículas mediciones confirman la estabilidad de metanol-C 60 suspensiones. Dinámica de dispersión de luz láser de las mediciones demuestran que el tolueno C 60, utilizado como referencia (Figura 1D], los rendimientos de partículas de tamaño uniforme con un tamaño medio de 32,7 nm, en consonancia con los datos publicados [18, 38]. Mediciones paralelas con metanol C 60 revela dos picos a 106 nm y 342 nm de tamaño, lo que indica heterogeneidad en el tamaño de las partículas (Figura 1D].

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se utilizó para verificar los tamaños de grupo fullerenos secos de metanol (Figura 1E]. Metanol C 60 agrupaciones fueron observados en una amplia gama de tamaños incluyendo grandes grupos en la gama micras aunque muchos de estos grupos de menos de 10 nm se observaron. TEM micrográficas tamaño de las partículas corroboran los datos obtenidos por dispersión de luz dinámica que indica la presencia de una mezcla heterogénea de los grupos de tamaño variable. Además, tras la evaporación del metanol, la mayoría de las agrupaciones de fullereno no reaggregate, y tienen una gama de tamaños de decenas de nanómetros, aunque algunos grandes grupos también existen. TEM datos difieren de la de la dispersión de luz dinámica de resultados en este sentido desde la dispersión de luz aparato de cuentas correspondientes al promedio de todos los tamaños de fullereno agrupaciones de solución.

Prolongada sonicación de 60 C en diversos disolventes orgánicos es habitual para preparar las soluciones de C 60 [13, 39]. Como medida adicional para cerciorarse de que la suspensión y sonicación de 60 C en metanol no ha introducido ninguna modificación en el fullereno, analizamos cada una matriz de preparación con ayuda de láser de desorción ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas.

Estos análisis, realizados en el modo de iones positivos, puso de manifiesto una especie predominante con una masa monoisotopic Da a 720,1 (teórico masa de C 60 = 720,00 Da) indicativo de C 60 en los preparativos de metanol y tolueno (Figura 2]. La masa observada es consistente con la formación de una carga positiva C 60 de iones de la pérdida de un electrón en vez de ganancia de un protón. Curiosamente, la misma masa se observó a análisis en el modo de iones negativos (datos no presentados). Cada uno de los preparativos contenía una pequeña cantidad de una especie a 489,64 Da que estuvo presente en la preparación original de C 60. En todos los casos, el principal componente era puro C 60 con masa 720,1 Da. El método de preparación de metanol o agua utilizada en este estudio no parece alterar significativamente la estructura de la C 60.

2) El crecimiento de las células en presencia de metanol C 60

Estudios anteriores han sugerido que soluble en agua nano-C 60 en peligro la integridad de membrana plasmática, posiblemente debido a la peroxidación lipídica [19]. Para determinar si el C 60 se aplica a las células de un método diferente que producir un efecto tóxico similar, hemos comprobado los efectos de metanol C 60 en las células cultivadas. En primer lugar, hemos examinado si los cristales de C 60 son absorbidos por las células.

Normal (MCF10A) y malignas (MDA 231 MB y 435 MB MDA) las células epiteliales de mama se chapada en cualquiera de metanol-C 60 platos recubiertos o control de los platos y la morfología celular de las células adjunto se examinó. La presencia de metanol C 60 no alteró la morfología de las células o células y la difusión de la PL firma de C 60 se mantiene en condiciones normales de cultivo celular. Por otra parte, encontramos que cristalino C 60 es absorbido por las células. Para garantizar que la nanopartícula es, en efecto, interiorizado, las células fueron trypsinized con tripsina que los pongan en libertad de la placa y replated en platos recubiertos con colágeno I para mejorar la integrina-matriz extracelular y las interacciones de células propagación. Morfológicamente, las células cultivadas con metanol C 60 re-adjunto y se extendió como el control de las células. El fullereno nanocristales conservan su color naranja rojizo PL, en virtud de contraste de fase (Figura 3A] y sobre el terreno brillante de imágenes utilizados para garantizar que el color de fullerenos no se debe a un artefacto de contraste de fase.

La presencia intracelular de cristales de C 60 se verificó a través de examen a través de múltiples planos focales usando microscopía confocal. Normal de las células epiteliales de mama (MCF10A) cultivadas en la noche a la mañana metanol C 60 se trypsinized, replated en colágeno I, fijado en el paraformaldehído, extraída con 0,1% Triton X-100 y teñidas con FITC marcado phalloidin para counterstaining. C 60 cristales fueron fácilmente evidente por su característica de color naranja rojizo PL firma (Figura 3B]. Múltiples cristales de C 60 de diferentes tamaños Estuvieron presentes en diferentes planos focales, con indicación de su localización intracelular. Examen inicial muestra que intracelulares C 60 no interfiere con la propagación de células en ECM o alterar Microfilamento reorganización siguiente archivo adjunto a ECM. Sin tratar (control) las células, procesado en paralelo, por otra parte, no muestran naranja PL. Se obtuvieron resultados similares con MDA 231 MB y 435 MB MDA células del cáncer de mama (datos no presentados). Desde citoesqueleto reorganización tras la integrina activación implica una serie compleja de eventos de señalización a partir de activación de la integrina y orquestada de activación de Rho GTPasas [40], nuestros resultados sugieren que el tratamiento de C 60 es poco probable que interfiera con los acontecimientos que siguieron a las células-ECM interacciones.

3) la supervivencia celular en presencia de prístina C 60

Como se señala en la introducción, hay una falta de consenso sobre los efectos de C 60 en el crecimiento celular, y tenemos la hipótesis de que la aparente efectos citotóxicos de las nanopartículas se deben a los métodos de preparación y aplicación de C 60 a las células. Por lo tanto, hemos reevaluado los efectos de C 60 en la proliferación celular utilizando metanol C 60 y soluble en agua nano-C 60 elaborados a partir de tolueno.

Varios normales y malignos de células del cáncer de mama se chapada en cultivo de tejidos platos pre-recubiertas con diferentes cantidades (que van de 10-200 μ g (10-200 ppm), lo que corresponde al 13 nmoles a 277 nmoles) de metanol C 60. Contrariamente a los resultados publicados, que establecen que la C 60 es tóxico a 20 ppb [18], con el cultivo de células significativamente mayor (200 ppm) de concentración C 60 no repercuten negativamente en la proliferación celular (Figura 4]. El crecimiento y la proliferación de MCF10A (Figura 4A], MDA MB 231 (Figura 4B] no se vio afectada por la presencia de C 60 y citotóxicos no se observaron efectos. Se obtuvieron resultados similares con MDA MB 435 y células HepG2 (véase la disposición 1]. La falta de toxicidad de 60 C en MDA MB 231 células se confirmó por «muerto-vivo" de células ensayos (Molecular Probes) (Figura 4C]. Además, los perfiles del ciclo celular de MDA MB 231 células cultivadas con o sin C 60 eran esencialmente idénticas, lo que indica que el conjunto de parámetros del ciclo celular se inalterada (Figura 4D], y no subg o-G 1 fracciones (apoptosis de las poblaciones) eran evidentes en las células tratadas con C 60 (no se muestra).

Nuestra conclusión de que el cultivo de células con metanol C 60 no inhibe la proliferación celular se encuentra en contradicción con resultados publicados [16, 18, 19, 41], y, por tanto, estamos investigando si los diferentes métodos de preparación y aplicación de C 60 se explican las diferencias en los efectos de C 60. Hemos preparado soluble en agua nano-C 60 de tolueno, utilizando los protocolos publicados [12, 13] y se caracteriza el material. Nano C 60 elaborados a partir de tolueno producido 274 μ g / ml (274 ppm) de color amarillo ligeramente soluble en agua C 60. Espectros de absorción (Figura 5A], de nano C 60 están de acuerdo con las propiedades espectrales de C 60 [33, 35]. El tamaño de las partículas de nano mediciones C 60 reveló la presencia de cristales con un tamaño medio de 122 nm (Figura 5B].

MCF10A cultivo de células HepG2 y con un máximo de 27,4 μ g / ml (27,4 ppm) de soluble en agua nano C 60 derivados de tolueno no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular (Figuras 5C + D]. La falta de efectos citotóxicos fue confirmada por dos ensayos (coloración violeta cristal y vivir de los ensayos de células muertas) y los análisis del ciclo celular. Las cantidades de C 60 se utilizan en estos experimentos es comparable a los utilizados en estudios previos en donde la extrema toxicidad se comunicó con otros soluble en agua nano preparativos C 60 [18, 19]. De este modo, nuestros hallazgos con metanol C 60 y soluble en agua nano C 60 elaborados a partir de tolueno demostrar que la proliferación celular no es inhibida por fullerenos y las nanopartículas no ejerce efectos tóxicos en el cultivo de células.

Nuestros esfuerzos para aumentar la concentración de la nano C 60 en estudios de cultivo celular se ve limitada por la concentración máxima de C 60 alcanzable en la preparación soluble en agua derivados de tolueno. Cultivo celular y la proliferación en presencia de otros nanomateriales de carbono, tales como nanotubos, también se ha informado de éxito [42, 43] y esos resultados son consistentes con nuestros datos muestran que el crecimiento celular en presencia de prístina C 60 es factible. Si bien varios investigadores (por ejemplo, ver [44, 45]] informan de que los nanotubos de hecho son citotóxicos, una publicación reciente [46] tales atributos a la toxicidad, al menos, en parte, a cuestiones técnicas. Esto es análogo a nuestra hipótesis de que los métodos de preparación del C 60 cuentas correspondientes al observado divergentes efectos citotóxicos de C 60. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que la C 60 partículas pueden utilizarse para el diseño y desarrollo de multi-funcional de las nanopartículas y el núcleo de nanopartículas es poco probable que afecte negativamente a la fisiología celular.

Un importante hallazgo de este estudio es que la C 60, cuando se aplica la suspensión como el metanol, no es tóxico para una variedad de tipos de células y no interfiere con la proliferación celular. Esta conclusión es apoyada por la proliferación de las células ensayos, análisis del ciclo celular y vital manchas. Además, continuamente las células cultivadas con C 60 no mostraron defectos en la celda y la difusión de citoesqueleto organización, con indicación de las células-matriz de interacciones y vías de señalización no se vean perjudicadas por la C 60. Nuestros resultados son apoyados por otros estudios que muestran que el C 60, en consonancia con su bien establecida aceptor de electrones propiedades, es un potente antioxidante [20, 47]. Este descubrimiento clave difiere de varios informes publicados [16, 18, 19, 41], que sugiere que prístina nano C 60 es tóxico. Para conciliar con el tipo de células diferencias, que hemos empleado varios normales y malignos de células epiteliales y probado su proliferación en presencia de tolueno derivado soluble en agua nano C 60. Algunos investigadores han reportado la debilidad de la toxicidad de un preparado de pyrrolidine de polivinilo (PVP) y 60 C en cultivos celulares y modelos animales en comparación con el PVP por sí sola [48, 49]. Sin embargo, cabe señalar que la cantidad de C 60 utilizados en esos estudios que superaba ampliamente utilizados en el presente trabajo y el método de elaboración de C 60 es diferente.

Considerando que varios estudios han examinado los efectos de C 60 en una variedad de células, pocos estudios han examinado si fullereno cristales son absorbidos por las células. La microscopía confocal de metanol C 60 tratados con células en matrices de colágeno revela intracelular C 60 nanocristales de diferentes tamaños en condiciones normales y malignos de células del cáncer de mama (Figura 3B]. Creemos que esta es una primera demostración de intracelular prístina C 60 cristales utilizando la firma PL como el reportero. Los datos se muestra en la Figura 3B sugiere que internalizado C 60 conserva su estructura cristalina como se desprende de su brillante color naranja rojizo PL. Al mismo tiempo que demostrar mayor de C 60 cristales en las células por microscopía confocal, los cristales más pequeños (≤ 200 nm) pueden no ser detectados por esta técnica. Informes recientes indican la capacidad de detectar la fluorescencia de los nanotubos de carbono en sistemas celulares [50 - 54]. Estos hallazgos sugieren la posibilidad de detectar intracelular C 60 de fluorescencia, aunque la señal es generalmente más débil que la señal de infrarrojos de los nanotubos. Mientras que otros, como las nanopartículas funcionalizadas nanotubos [55, 56] y las nanopartículas de oro [57] Se ha informado de que endosomal internalizado a través de las vías, la vía de la internalización de los prístinos C 60 no se conoce. Nuestros datos también sugieren que el PL puede ser utilizado como una herramienta para estimar intracelular C 60 niveles, siempre y cuando el rendimiento de los más pequeños cristales pueden ser medidos cuantitativamente.

En resumen, nuestro trabajo se describe un método rápido y simple para la aplicación de C 60 a cultivos celulares y para investigar las interacciones de C con 60 celdas. Ofrecemos pruebas de que prístina C 60 es considerado por el normal y las células malignas y la intracelular C 60 PL conserva su firma. Por último, demostrar que la cultura continua de células con C 60 no es tóxico y que la adhesión celular, el citoesqueleto de reorganización tras la integrina activación y proliferación de las células después del tratamiento con C 60 no se verán afectados. Los toxicidad de prístina C 60 es más probable debido a la incompleta entendido disolvente o efectos a modificaciones químicas de la C 60 que pueden ocurrir durante la preparación. Una de las principales consecuencias de nuestra investigación es que fullereno basado en nanopartículas podrían ser utilizados para aplicaciones biomédicas, sin consecuencias negativas de los fullerenos.

Conclusión

C 60 fullerenos son útiles para varias aplicaciones biológicas. Aquí se describe un nuevo y simple método de aplicación de estos materiales a las células y demostrado que son adoptadas por las células. Es significativo que nos demuestran que no modificado C 60 fullerenos no son tóxicas para las células. Esta conclusión debería aclarar la cuestión de la percepción de los efectos tóxicos de fullerenos y mejorar el desarrollo de nuevas aplicaciones biomédicas el uso de estas nanopartículas.

Materiales y métodos
Fullereno suspensiones

C 60 fullerenos (Sigma Chemical Co) se sonicated en metanol a 0,2 mg / ml mediante un baño de agua sonicator (Branson) durante 30 minutos para crear un fullereno suspendido solución que se conoce como el metanol C 60. "Soluble en agua 'nano C 60 suspensiones fueron elaborados a partir de tolueno utilizando procedimientos publicados [12, 13]. Para preparar un "nano-C 60 'suspensión de tolueno 0,5 mg de C 60 se añadió por ml de tolueno. La suspensión fue sonicated durante 10 minutos en un baño de agua (Branson) hasta obtener una solución uniforme morado y se obtuvo todos los C 60 ha sido disuelta según lo determinado por la observación. A raíz de ultrasonidos en el tolueno, un volumen igual de agua desionizada se añadió al tolueno / C 60 y una suspensión orgánica y agua de separación de fases se observó. Esta solución fue sonicated en un baño de agua hasta que todos los tolueno ha evaporado (no hay más solución púrpura izquierda), por lo general requieren alrededor de 2-6 horas dependiendo de la cantidad de lotes.

Luz espectroscopía

Fullereno suspensiones se caracterizaron por UV / Vis absorción (Beckman DU7500 espectrómetro) y la espectroscopia de fluorescencia. Fotoluminiscencia (PL) mediciones fueron efectuadas mediante una Safire 2 monocromador multifuncional basado en una microplaca lector (Tecan Instruments). Porque el metanol C 60 suspensiones resolver rápidamente, los espectros se registraron en los 10 minutos de ultrasonidos.

Partículas calibrado

Tamaño mediciones de la fullereno suspensiones coloidales preparado a partir de metanol y tolueno se llevaron a cabo utilizando una dispersión de luz Zetasizer Nano-S instrumento de dispersión de luz (Malvern Instruments, Southboro, MA). Sonicated metanol C 60 suspensiones se medirá inmediatamente para impedir la solución de las partículas. Grabación de los espectros de habitual se completará dentro de 10 minutos de muestra de ultrasonidos.

La microscopía electrónica de transmisión

La microscopía electrónica de transmisión se hizo en grupos de fullereno secos de metanol en las redes de formvar. A Phillips TEM en microscopía electrónica de transmisión (modelo 400, 120 keV) y se utilizó una muestra de 60 C en metanol se seca en un formvar red para la observación de los grupos.

MALDI-TOF

Un Esquire MALDI-TOF espectrómetro de masa (Bruker Daltonics Instruments, Billerica, MA) fue utilizada para medir las masas moleculares de especies presentes en los diversos preparativos C 60. Soluciones que contienen C 60 se mezcla con igual volumen de solución saturada matriz (10 mg de α-ciano-4-hydroxycinnamic por ml de ácido 0,05% de ácido trifluoroacético y el 25% CH 3 CN). Los espectros de masas se registraron en positivos y negativos de ionización de los modos de utilizar el modo de reflectron y calibraciones se realizaron con un péptido masa kit de calibración suministrados por Bruker Daltonics.

Líneas celulares

Normal (MCF10A) y malignas (MDA 435 MB y 231 MB MDA) humano de células epiteliales mamarias líneas, y el carcinoma de hígado humano línea celular (HepG2) se obtuvieron a partir de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y cultivadas en condiciones normales.

Cultivo celular

Metanol C 60 suspensiones se prepararon e inmediatamente se aplica a 12 cultivos de tejido y los platos sobre la base de un protocolo utilizado para los ensayos de anoikis [29, 32]. A raíz de la aplicación de las suspensiones, el metanol se permitió que se evaporan de la cultura platos mientras estaba abierto en una estéril campana. Las células fueron chapados a la revestidos los platos y cultivadas en medios de cultivo ordinarios en una incubadora de cultivo de tejidos. La proliferación celular se midió utilizando cristal violeta ensayos [58]. Cultura platos se enjuagarse con tampón fosfato salino (PBS) y manchados de cristal violeta en mancha (0,25% w / v en metanol al 50%) durante 10 minutos. Tras el lavado de platos para eliminar el exceso de mancha, los platos fueron secadas al aire, la proteína-colorante fue obligado solubilized en el 50% de metanol y la absorbancia se registró a 540 nm [59]. Cada una de las muestras se midió por triplicado y los experimentos se repitieron al menos dos veces. Para algunos experimentos, la proliferación celular se evaluó con un muerto-vivo de células kit de ensayo (Molecular Probes) que contiene calceína AM ethidium y tintes. Microscopía de fluorescencia se utilizó para determinar la viabilidad celular mediante el examen de los coeficientes de verde (viable) a rojo (muertos) las células.

Citometría de flujo

Perfiles del ciclo celular se determinaron por citometría de flujo utilizando protocolos establecidos [29, 60]. Las células fueron trypsinized y fija en el 70% de etanol durante al menos 24 horas a 4 ° C, teñidas con yoduro de propidio y sometidos a análisis de citometría de flujo en un BD FACStar instrumento. El contenido de ADN de las células en diferentes fases del ciclo celular fue determinada por Modfit programa.

La luz y microscopía confocal

Todas las líneas de células fueron incubadas con 200 μ g de C 60 desde la preparación de metanol durante 24 horas a 37 0 C. Tras la incubación, las células fueron lavadas exhaustivamente con PBS para eliminar adherente extracelular fullereno agrupaciones, trypsinized, y en replated recubiertas de colágeno I (5 μ g / cm 2) la cámara de diapositivas [32]. Las muestras fueron vistos ya sea en forma directa por microscopía de contraste de fase usando un microscopio Olympus o procesadas para microscopía confocal. Microscopía de luz, las imágenes fueron grabadas con un modelo de fuente de luz blanca sin filtro UV. Por microscopía confocal preparación, las muestras fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, extrajeron con 0,5% Triton X-100, incubadas con FITC marcado phalloidin (sondas moleculares) para visualizar los filamentos de actina citoesqueleto, y montadas con la anti-fade kit (Molecular Probes) [32, 60]. Las muestras fueron vistos en un Zeiss LSM 510 microscopio confocal. Detección de C 60 se logró por excitación a 458 nm y el uso de un filtro de paso largo para λ> 650 nm. Las imágenes fueron seccionadas ópticamente y las proyecciones de los compilado-z pila fueron importados en Adobe Photoshop (versión CS2).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

NL, ML y las buenas prácticas de laboratorio realizado los experimentos. RH y DLC ayudó en el diseño de algunos experimentos e interpretación de los datos. BPL ha diseñado el proyecto global y escribió el manuscrito, con aportaciones de otros autores hacia el proyecto final.

Material complementario
Archivo Adicional 1
Efecto de metanol C
60
en la proliferación de células cultivadas. MDA 435 MB carcinoma de mama (A) y HepG2 carcinoma hepático (B) las células fueron cultivadas bajo control o en presencia de metanol C60 (0,2 mg / ml) y la proliferación celular se midió como se describe en la leyenda de la figura
4A
y
4B
Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por los fondos del Departamento de Cirugía General, Wake Forest University School of Medicine y Kulynych Familia Fondos para la Investigación Médica (BPL). Espectrometría de masas se realizó en el Laboratorio Biomolecular de Recursos de la Comprehensive Cancer Center de la Universidad de Wake Forest, con el apoyo de conceder 5 P30 CA12197-30 desde el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud.