Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2006; 361(1475): 1917-1927 (más artículos en esta revista)

Secuencias, secuencia de las agrupaciones y especies bacterianas

La Real Sociedad
William Hanage P, Christophe Fraser, G Brian Spratt [*]

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Resumen

Cualquier otra cosa que deberían compartir, las cepas de bacterias asignado a la misma especie deben tener la casa de mantenimiento de los genes que son similares en secuencia. Única secuencias de genes (o secuencias de genes rRNA) tienen muy pocos sitios informativos para resolver las cepas de especies estrechamente emparentadas, y las relaciones entre especies similares pueden ser confundidos por interspecies recombinación. Un enfoque más prometedor (análisis de secuencias multilocus, MLSA) es concatenar las secuencias de múltiples casa de mantenimiento del lugar y observar los patrones de agrupamiento entre las grandes poblaciones de cepas estrechamente relacionadas del llamado especies bacterianas. Estudios recientes han demostrado que las grandes poblaciones pueden ser resueltos en que no se solapan secuencia de las agrupaciones que de acuerdo con las especies asignadas por los métodos microbiológicos. El uso de patrones de agrupamiento para informar a la división de estrechamente relacionadas en las poblaciones de especies tiene muchas ventajas para la bacteria poco estudiada (o de volver a evaluar bien estudiados especies), ya que proporciona una forma de reconocer natural discontinuidades en la distribución de genotipos similares. La agrupación de patrones puede ser utilizada por grupos de expertos como la base de un enfoque pragmático para la asignación de especies, teniendo en cuenta todo lo adicional se dispone de datos (por ejemplo, las similitudes en la ecología, fenotipo y contenido de genes). El desarrollo de grandes bases de datos MLSA Internet ofrece la posibilidad de asignar nuevas cepas previamente definidos para las agrupaciones de especies y una taxonomía electrónico. Las ventajas y los problemas en el uso de secuencias agrupaciones como la base de las especies se analizan las cesiones.

1. Introducción

Bacteriana… existen especies bacterianas diversidad está organizada en discretas fenotípica y genética agrupaciones, que están separados por grandes fenotípica y genética lagunas, y estos grupos son reconocidos como especies. Cohan Fred (2002]

Para muchos microbiólogos, especies bacterianas son reales las entidades que pueden ser reconocidas como agrupaciones de genotipos que están claramente resueltas de agrupaciones similares ( Palys et al. 1997 ). De hecho, hay casi ningún dato que se ocupan de esta afirmación, que en esencia es una declaración de creencia. Una vista más agnóstico es preguntar si las poblaciones de bacterias similares hacer siempre (o generalmente) forma discreta bien resueltas genotípica agrupaciones que merecen la situación de las especies y examinar los métodos que deben emplearse para hacer frente a esta cuestión ( Hanage et al. 2005, un ). La cuestión es de cierta importancia para taxónomos microbianos. Si existen especies como bien resueltas genotípica agrupaciones, éstas se pueden definir de manera más natural, y taxónomos microbianos podría avanzar a partir de su práctica actual, que se basa principalmente en la definición de las especies de normas y valores umbral que no tienen en cuenta ninguna de las discontinuidades naturales en la agrupación de genotipos relacionados.

En este artículo, se examinará si las secuencias se pueden utilizar para resolver las agrupaciones de genotipos relacionados entre grandes poblaciones de bacterias similares. La atención se centra no en consideraciones teóricas, sino en la cuestión práctica de saber si las secuencias de genes puede informar el proceso por el cual guarda estrecha relación bacterias se asignan a las especies, y las perspectivas de una taxonomía electrónico a cepas bacterianas que pueden ser asignados a las especies a través de Internet ( Gevers et al. 2005 ). Los comentarios de las especies conceptos y definiciones que se aplican a las bacterias se pueden encontrar en otros artículos de este volumen (Cohan 2006; Staley 2006] y en otros lugares ( VANDAMME et al. 1996 ; Ward, 1998; Rosselló-Mora y Amann 2001; Cohan 2002; Stackebrandt et al. 2002 ; Gevers et al. 2005 ).

La idea de que existen verdaderas entidades dentro del mundo bacteriano que podemos asignar como especie es tan omnipresente (y útil) que es difícil evitar el uso de la palabra. En este documento, usamos "especie", tanto en el sentido de resumen coherente grupos de organismos en los que queremos dividir el mundo bacteriano, y describir los grupos reales de los organismos asignados (a menudo incoherente) como el nombre de especies microbiólogos. También se refieren a lo largo de especies bacterianas, pero los asuntos y enfoques se aplican por igual a las arqueas.

2. De normas y valores umbral para las agrupaciones secuencia

Especies delimitación se basan actualmente en relación con el uso genético de ADN-DNA hibridación como una medida; cepas muestran que aproximadamente el 70% o más del ADN-DNA relación se considera que pertenecen a la misma especie y los que tienen menos de este valor son diferentes especies ( Wayne et al. 1987 ). Tal vez sorprendentemente, dada la notable e inesperada variación en el contenido de genes en las cepas de la misma especie ( Welch et al. 2002 ), Este criterio ha funcionado bien y ha sido apoyada por recientes estudios que relacionan el porcentaje de hibridización DNA-DNA a las medidas de promedio de nucleótidos de identidad entre todos los genes compartidos usando pares de cepas cuyos genomas se han secuenciado (Konstantinidis y Tiedje 2005].

Variación genética en el contenido y el alcance de la secuencia de la diversidad entre las cepas asignadas por hibridización DNA-DNA para la misma especie han llevado a algunos a considerar que las especies actuales son demasiado amplias, en comparación con los de organismos superiores (Staley 1997], mientras que en otros casos, se ha sugerido que el 70% del ADN-DNA relación con criterio puede ser necesario relajado para definir algunas especies ( VANDAMME et al. 1996 ). Esto, junto con dificultades en la aplicación de la hibridización DNA-DNA a un gran número de bacterias, la imposibilidad de aplicarlo a las bacterias que hasta el momento son unculturable y el malestar con apoyándose en directrices, normas y valores umbral, ha llevado a una búsqueda de una más natural y más conveniente para las especies definición ( Gevers et al. 2005 ).

Las comparaciones de las secuencias de ADN proporcionan una manera posible de distinguir especies. Los más comunes y más generalmente el enfoque es aplicable el uso de secuencias de 16S rRNA, ya que estos pueden ser obtenidos por ambos cultivables y unculturable bacterias, y la secuencia proporciona precisos datos digitales que pueden ser almacenados en una base de datos única, lo que puede ser interrogado a través de la Internet ( Cole et al. 2003 ). Cepas que presentan más del 70% hibridización DNA-DNA (o que tienen más de 94% promedio de nucleótidos de identidad compartida de todos los genes) han demostrado ser muy similares en su 16S rRNA secuencias de genes (Konstantinidis y Tiedje 2005]. Sin embargo, la conversación no es necesariamente cierto; cepas que tienen casi idénticas secuencias de 16S rRNA no pueden estar estrechamente relacionados en general, si este es juzgado por hibridización DNA-DNA (Rosselló-Mora y Amann 2001] o el promedio de nucleótidos de identidad entre todos los compartida genes (Konstantinidis y Tiedje 2005]. Dos cepas con las secuencias de 16S rRNA que son menos del 97% son idénticos, por lo tanto, asignado con confianza alta de especies diferentes, pero hibridización DNA-DNA aún se requiere para determinar si las cepas que tienen el 97% o más 16S rRNA similitud debería o no ser de la misma especie ( VANDAMME et al. 1996 ).

Las secuencias de 16S rRNA han sido ampliamente utilizados en microbiología ambiental y han sido de incalculable valor para descubrir la gran diversidad de vida microbiana (DeLong & Pace 2001], y para la asignación de unculturable organismos como nuevas especies ( Hugenholtz et al. 1998 ; Garrity et al. 2002 ), Y más problemático, se han utilizado (ya sea implícita o explícitamente) para definir las especies (por ejemplo, estudios de la riqueza de especies o la diversidad en los océanos; Schloss & Handelsman 2004; Thompson et al. 2005, un ). Especies definición utilizando secuencias de rRNA es problemática ya que esta molécula lenta evolución carece el nivel necesario de resolución para distinguir especies similares o para abordar la cuestión de si existen especies y puede ser resuelto con claridad ( Fox et al. 1992 ). Relaciones inferirse de 16S rRNA genes también pueden ser distorsionados por recombinación entre especies similares, lo que complica aún más su uso en especies definición ( Smith et al. 1999 ; Boucher et al. 2004 ).

Las secuencias de una serie de genes de codificación de la proteína también se han utilizado para asignar a las especies de bacterias. Estos tienen la ventaja sobre 16S rRNA de la evolución más rápida y así ofrecer una mayor capacidad para resolver las especies dentro de un género. Sin embargo, el uso de un solo gen tiene como principales inconvenientes que puede haber muy pocos sitios informativos de nucleótidos para resolver especies muy similares y recombinación homóloga (HR) entre otras especies similares pueden distorsionar las verdaderas relaciones entre las especies (figura 1]. En materia de recursos humanos que se cree que es relativamente común entre muchas bacterias (Feil y Spratt 2001] y probablemente también entre muchos arqueas ( Papke et al. 2004 ; Whitaker et al. 2005 ). Por lo general se traduce en la sustitución de un pequeño fragmento (unos kilobases) de los cromosomas de un destinatario bacteria con la correspondiente región de otra cepa de la especie o de una especie vecina. Estudios de laboratorio indican que la eficiencia de la recombinación se cae en un diario de forma lineal con el aumento de la divergencia de secuencias (Majewski y Cohan 1999; Majewski et al. 2000 ), Pero hay amplias pruebas de que las sustituciones se producen en la naturaleza entre especies que difieren en 5-25% en secuencia de nucleótidos ( Dowson et al. 1989 ; Spratt et al. 1989 ; Zhou et al. 1997 ; Kalia et al. 2001 ).

Las deficiencias de la utilización de un solo gen para resolver especies similares se pueden superar mediante el uso de múltiples secuencias de genes, ya que este enfoque proporciona más sitios informativos de nucleótidos y también amortiguadores contra los efectos distorsionadores de la recombinación en uno de los loci ( Hanage et al. 2005, un ). A homóloga interspecies recombinational que implique una sustitución lugar, presenta las especies de B en una cepa de una especie, no debe impedir que la cepa está correctamente asignado a las especies A, como la combinación de secuencias de los otros loci aún debe dar lugar a que la agrupación con otras cepas de especies A. Análisis de la relación de las cepas de especies similares utilizando múltiples secuencias de genes, por lo tanto, proporciona la manera más adecuada la determinación genotípica de las agrupaciones y de evaluar la capacidad de secuencias para resolver las especies ( Gevers et al. 2005 ).

3. La resolución de especies utilizando múltiples casa de mantenimiento de los genes

Varios trabajos han abordado recientemente si las secuencias de múltiples genes pueden ser empleados para distinguir especies similares, informar a la división de un género en especies, o para preguntar si existen especies bacterianas ( Godoy et al. 2003 ; Priest et al. 2004 ; Baldwin et al. 2005 ; Hanage et al. 2005, un , b ; Thompson et al. 2005 b ). La casa de mantenimiento de genes se utilizan para este fin a medida que evolucionen con relativa lentitud (aunque más rápidamente que los genes 16S rRNA) y la mayor parte de la variación que se acumula en estos genes se considera selectivamente neutral. Por otra parte, la casa de mantenimiento de genes codifican productos que pueden ser esenciales para la bacteria y, por consiguiente, se espera que estén presentes en todas las cepas de un género.

El enfoque básico es concatenar las secuencias de la casa de múltiples loci de mantenimiento, la utilización concatenados secuencias de un conjunto de cepas para la construcción de un dendrograma y observar los patrones de agrupamiento de los genotipos. El número de genes que deben ser utilizados y el tamaño de los fragmentos de cada gen que debe ser secuenciado no se han explorado sistemáticamente. Más loci, presumiblemente, aumentar la capacidad de resolver genotípica agrupaciones, pero la exploración de los patrones de agrupamiento dentro de un género, o si existen agrupaciones resuelto, se requiere el análisis de un gran número de cepas (discutido más adelante). Como solución de compromiso entre la necesidad de que tanto la resolución y el sentido práctico, aproximadamente siete loci son probablemente suficientes, pero esto se puede incrementar si es necesario. Aunque este enfoque todavía no se ha informado, puede ser una ventaja cuando se crea un análisis de secuencias multilocus (MLSA) régimen de agrupación para analizar los patrones en un primer subconjunto de las cepas utilizando más de siete loci, por lo que si la historia evolutiva de cualquier lugar parece ser lo suficientemente anómalo para perturbar las relaciones inferirse utilizando todos los otros loci, que puede ser identificado (por ejemplo, Falush et al. 2006 ) Y omitido de la última serie de loci elegido.

El uso de siete loci se ha convertido en la norma para caracterizar cepas bacterianas dentro de una especie de secuencia de multilocus escribiendo (MLST; Maiden et al. 1998 ). En MLST, cada secuencia se le asigna un número de alelos diferentes y cada cepa se define sin ambigüedades por siete enteros, que corresponden a los números de alelo en los siete loci (el perfil alélica). La relación entre las cepas de una especie se muestra como un dendrograma utilizando la matriz de diferencias pairwise alélica en sus perfiles. En algunos casos, las cepas de varias especies estrechamente relacionadas se han caracterizado por MLST, utilizando el mismo conjunto de siete genes, y han permitido un análisis de las relaciones entre las especies ( Godoy et al. 2003 ; Baldwin et al. 2005 ; Hanage et al. 2005, un , b ). Cepas de diferentes especies casi siempre tienen diferentes alelos en los siete loci, y por lo tanto, la concatenados secuencias de los siete loci se utilizan para explorar las relaciones entre las cepas de especies similares. Esta extensión del MLST enfoque que se ha denominado MTAS ( Gevers et al. 2005 ).

El MTAS ha sido cada vez más utilizada para determinar la posición filogenética de nuevas especies (por ejemplo, Christensen et al. 2004 ; Holmes et al. 2004 ) Y las relaciones entre las especies en géneros estrechamente relacionados (por ejemplo, Wertz et al. 2003 ). Unos pocos estudios han utilizado el enfoque de ver a las relaciones entre las especies estrechamente relacionadas dentro de un mismo género. Por lo tanto, MLSA se ha utilizado para resolver las especies y las especies candidato a la Burkholderia cepacia especies complejas ( Baldwin et al. 2005 ) Y para resolver las especies de Vibrio ( Thompson et al. 2005 b ). Estos estudios han puesto de manifiesto la resolución de la denominada especie, pero sólo han utilizado pequeñas cantidades de cada especie. Las bacterias existen como la población y hacer frente a las relaciones entre especies similares requiere el análisis de grandes poblaciones, para ver si grupos de especies se pueden resolver, para circunscribir los límites de estas especies y grupos a explorar el grado de separación entre ellos. Una prueba más rigurosa es, pues, examinar si MLSA puede resolver un gran número de cepas de especies muy similares en que no se solapan las agrupaciones.

Tres ejemplos recientes de la utilización del MTAS para resolver las especies agrupaciones son discutidos aquí. Cabe destacar que en estos ejemplos, los árboles se utilizan únicamente para establecer los patrones de agrupamiento y no para inferir las relaciones filogenéticas entre las agrupaciones o de las cepas dentro de los distintos grupos. Los árboles se han construido utilizando MrBayes v. 3.1 (Ronquist Huelsenbeck y 2003] con los priores de la mejor ajustado modelo de sustitución de nucleótidos determina utilizando MrModeltest v. 2.2 ( Nylander et al. 2004 ). En el caso de la Neisseria, un pequeño conjunto de datos compuesta de los primeros 100 y Neisseria meningitidis Neisseria lactamica todas las cepas y 67 cepas de Neisseria gonorrhoeae se utilizó para obtener esto como resultado del excesivo tiempo de cálculo para los cálculos realizados utilizando el conjunto de datos.

4. Resolver Burkholderia pseudomallei, y Burkholderia mallei Burkholderia thailandensis

Godoy et al. (2003) caracterizado las cepas de Burkholderia pseudomallei, y Burkholderia mallei Burkholderia thailandensis de MLST, y examinó la resolución de estas especies mediante el MTAS. La agrupación patrones pueden ser re-examinadas de conformidad con la actual B. pseudomallei MLST base de datos ( http://bpseudomallei.mlst.net ), Que ahora incluye a 770 aislamientos de B. pseudomallei, 36 de B. mallei y 24 de B. thailandensis. Un árbol construido a partir de la concatenados secuencias de los siete MLST loci de un ejemplo de cada uno de los 421 genotipos diferentes multilocus (cepas) en la actual base de datos pone de manifiesto que todas las B. pseudomallei están estrechamente agrupadas y están bien resueltas desde un segundo grupo, que incluye todas las B. thailandensis (figura 2]. Ambas especies son nombrados saprófitos del suelo y están íntimamente relacionados, pero se pueden distinguir fenotípicamente por el hecho de si tienen o no pueden asimilar arabinosa, y clínicamente por el hecho de que B. pseudomallei puede causar enfermedad grave tras la inoculación o inhalación, mientras que B. thailandensis se considera avirulent.

Aunque la media de divergencia entre la secuencia B. y B. pseudomallei thailandensis ca es sólo del 3%, el MTAS enfoque apoya la opinión de que estos deben ser considerados como especie separada, ya que están bien resueltas en el árbol (probabilidad posterior de cada nodo se encuentra 100%), y no hay intercambio de alelos entre las especies. Los aislados de la tercera especie, B. mallei, la causa de muermo (principalmente una enfermedad de equinos, y de vez en cuando de seres humanos), en el grupo B. pseudomallei. Todos los 36 B. mallei en la actual B. pseudomallei MLST sitio web, recuperado de fuentes en todo el mundo durante un período de 40 años, son idénticos por MLST (con excepción de una cepa que sólo difiere en un nucleótido único sitio en uno de los siete loci). Esta "especie", por lo tanto, puede ser considerada como una cepa (o clon), de B. pseudomallei que se ha dado históricamente una especie separada nombre de microbiólogos médicos debido al hecho que causa una enfermedad distintivo (muermo), que la diferencia de B. pseudomallei, que es la causa de melioidosis.

El análisis de MLSA Godoy et al. (2003) También resolvió la situación taxonómica de una cepa asignado provisionalmente como B. pseudomallei ( Yabuuchi et al. 1992 ) Que se recuperó de un paciente involucrado en un accidente de tractor en Oklahoma (no zona endémica para esta especie). Esta cepa fue mostrado por MLSA a ser claramente diferenciado de ambos B. y B. pseudomallei thailandensis (figura 2] y, posteriormente, una segunda similar cepa ha sido identificada en los Estados Unidos y estos han sido asignados oficialmente a una nueva especie, Burkholderia oklahomensis ( Glass et al. 2006 ).

5. Especies dentro de cada especie

Burkholderia mallei es un ejemplo interesante de "especies dentro de una especie», que pone de relieve algunos de los problemas en especies bacterianas cesión. Por MLSA, es claramente un clon de B. pseudomallei; alelos a seis de los siete loci de B. mallei también están presentes en B. pseudomallei y el séptimo es distinta a una B. pseudomallei alelo en un solo sitio de nucleótidos ( Godoy et al. 2003 ). Sin embargo, tiene un genoma que es por lo menos una megabase más pequeños, otra la ecología, ya no sobreviven en el suelo y dependiendo de transmisión entre los equinos, y, por tanto, casi con toda seguridad se encuentra en una trayectoria evolutiva diferente (de hecho, B. mallei es, probablemente, en una trayectoria a la extinción como muermo es ahora extremadamente raro y restringido a unos pocos focos endémicos en Asia, África y Oriente Medio). El MTAS ha identificado otros ejemplos, donde históricamente, las bacterias asociadas con un distintivo humano o animal, las enfermedades se han dado los nombres de las especies, pero en realidad son un clon (o un grupo de clones estrechamente relacionadas) con distintivo la biología y la ecología dentro de una 'madre especie "(por ejemplo, Bacillus anthracis y Salmonella typhi; Kidgell et al. 2002 ; Priest et al. 2004 ). Estas anomalías son probablemente la consecuencia inevitable de la reciente aparición de linajes distintivos que están destinados a surgir como nuevas especies dentro de una de las especies existentes.

6. La solución similar recombinación especies que comparten el mismo nicho

Un hecho particularmente difícil la prueba de la existencia de especies es examinar los patrones de agrupamiento entre las grandes poblaciones de bacterias similares en los que la recombinación es conocido por ser frecuentes, y que se produzca entre las especies, y donde las bacterias colonizan el cuerpo mismo sitio y, por tanto, tener las mismas oportunidades para el intercambio de genes. Dos estudios recientes han solicitado MLSA a preguntar si genotípica distintas agrupaciones de empresas pueden ser resueltas entre co-colonizadores recombinogenic poblaciones.

La especie humana Neisseria proporciona el primer ejemplo ( Hanage et al. 2005, un ). La taxonomía del género Neisseria ha sido objeto de una revisión a través de los años e incluye dos patógenos-N. y N. meningitidis gonorrhoeae-y un número de comensales Neisseria humanos y varias especies animales. Neisseria meningitidis se llevó asymptomatically en la nasofaringe humana, pero de vez en cuando puede tener acceso a la sangre y de líquido cefalorraquídeo para dar lugar a la septicemia y la meningitis. Neisseria gonorrhoeae, que causa la gonorrea, está estrechamente relacionado con N. meningitidis, y es sobre todo recuperado del tracto genital humano, aunque también puedan ser recuperados de recto y la sonda naso-o orofaringe. Cámara de mantenimiento de los genes de N. gonorrhoeae son mucho más uniforme en la secuencia que los de N. meningitidis y se ha sugerido que el ex agente patógeno surgió hace relativamente poco tiempo como una cepa de un ser humano nasofaríngeo Neisseria especies que adquirieron la capacidad de colonizar el tracto genital y que puedan transmitirse por la vía sexual ( Vázquez et al. 1993 ).

Las otras especies de Neisseria humanos (por ejemplo, N. lactamica) son todos los colonizadores de la nasofaringe y se consideran no patógenas comensales, aunque en ocasiones algunos han sido asociados con la enfermedad. Estas especies nombrado comensales, por lo tanto, pueden coexistir junto con N. meningitidis dentro de un individuo humano nasofaringe, proporcionando oportunidades para la recombinación dentro y entre las especies estrechamente emparentadas. El público Neisseria MLST base de datos ( http://pubmlst.org/neisseria ) Contiene las secuencias de siete viviendas de mantenimiento de los genes de muchos miles de cepas de N. meningitidis y mucho menor número de N. lactamica y N. gonorrhoeae cepas. Se extrajeron del público Neisseria MLST la base de datos de secuencias de los siete MLST loci de 500 diferentes cepas de N. meningitidis, 171 cepas de N. lactamica y 67 cepas de N. gonorrhoeae, y utiliza la concatenados secuencias de los siete lugares para explorar los patrones de agrupamiento y de examinar las relaciones entre los grupos observados y los nombres de especies asignadas por norma los procedimientos microbiológicos ( Hanage et al. 2005, un ).

El análisis de las secuencias de N. meningitidis casa de mantenimiento de genes ha demostrado amplias pruebas para recombinational relacionados con las importaciones procedentes de especies comensales ( Feil et al. 1995 ; Zhou et al. 1997 ), Y los árboles de diferentes Neisseria casa de mantenimiento de los genes (y 16S rRNA genes) sugieren diferentes relaciones filogenéticas entre estas especies ( Smith et al. 1999 ). Como era de esperar, los árboles individuales derivados de las secuencias de cada locus MLST no resuelven N. meningitidis cepas de N. lactamica cepas ( Hanage et al. 2005, un ). Sin embargo, las secuencias de concatenados de los siete loci MLST resolver completamente el N. lactamica de las cepas de N. meningitidis (el grupo de cepas que figura como N. lactamica se agrupan en el 100% de los árboles extraídos de la parte posterior de probabilidad), aunque algunas cepas se derivan de la sucursal que separa estas dos especies (figura 3], y dos cepas situado al final de una larga rama derivados de la meningitis grupo son claros ejemplos de identidad errónea (flecha en la figura 3]. Cuando los ejemplos de otras especies de Neisseria se incluyen, estos dos' lactamica 'cepas con estas agrupaciones ( Hanage et al. 2005, un ) Y que han sido probablemente identificado erróneamente como N. lactamica de la presentación de laboratorio microbiológico. De las cepas aisladas de especies ecológicamente, N. gonorrhoeae, forman un apretado grupo genotípica en una larga rama (100% de apoyo) y están estrechamente aliados con N. meningitidis.

Recombinación especies que colonizan el cuerpo mismo sitio, por consiguiente, pueden resolverse mediante el uso de MLSA, pero la recombinación entre especies similares puede conducir a tensiones' rastrero ', situado en la sucursal que separa a los grupos de especies. Si no sabía nada acerca de estas cepas, que no esté claro por dónde hay que poner la línea divisoria entre el N. y N. meningitidis lactamica agrupaciones. Recombinación especies, por lo tanto, puede aparecer borroso y puede ser difícil utilizar a MLSA sin ambigüedades asignar unos cepas de una especie en lugar de la otra. Por otra parte, no sería evidente que el N. gonorrhoeae grupo deberá ser considerada como distinta de N. meningitidis. Estos resultados subrayan la necesidad de MLSA a ser utilizados como base para las decisiones pragmáticas de los grupos de expertos acerca de dónde hacer distinciones entre las especies, así como la necesidad de mapa en los patrones de agrupamiento sea cual sea la información adicional está disponible. De esta manera, la especial naturaleza de las cepas en el N. gonorrhoeae grupo sería muy evidente de su nicho ecológico diferente y asociación con la enfermedad.

El segundo ejemplo es un desafío siempre por Streptococcus pneumoniae (neumococo) y de sus familiares más cercanos conocidos ( Hanage et al. 2005 b ). Pneumococci asymptomatically colonizar la nasofaringe humana, pero en ocasiones puede causar neumonía, meningitis o septicemia y, más comúnmente, la otitis media aguda y sinusitus. Pneumococci recuperado de la enfermedad suelen ser encapsulada (serotypable) y pueden ser identificados por su reactividad con los sueros a escribir contra el polisacárido capsular. Estos serotypable aislados son generalmente susceptibles a optochin y soluble la bilis, y los aislados con estas características se consideran inequívocamente a ser S. pneumoniae. Dentro de la nasofaringe, hay una serie de organismos que parecen ser muy similares a pneumococci, pero que no son serotypable, y con frecuencia puede ser optochin resistentes y / o bilis insoluble ( Arbique et al. 2004 ). La relación de estas cepas (normalmente llamados atípicos pneumococci) a auténticos pneumococci ha sido poco clara ( Whatmore et al. 2000 ).

Un árbol construido a partir de las secuencias concatenados (seis loci) de 39 diferentes serotypable cepas de S. pneumoniae, lo que representa la diversidad entre los más de 2000 diferentes cepas de neumococo en la base de datos MLST ( http://spneumoniae.mlst.net ), Y 121 atípico pneumococci mostró una clara resolución en dos grupos ( Hanage et al. 2005 b ). Un grupo incluye todos los serotypable pneumococci y un subconjunto de los atípicos pneumococci, y otro grupo incluye el resto de atípicos pneumococci. El primero de la clase atípica pneumococci son casi con toda seguridad pneumococci que, por diversas razones, no son expresión de un polisacárido capsular, mientras que el segundo grupo parece ser una muy estrechamente relacionados pero distintos población ( Hanage et al. 2005 b ). Al igual que en la Neisseria ejemplo, hubo una buena separación de los grupos (100% de probabilidad posterior), pero algunos "difuminado" como uno no serotypable cepa surgió de la sucursal que separa los dos grupos (figura 3]. Recientemente, Arbique et al. (2004) también han llegado a la conclusión (usando hibridización DNA-DNA) que un subconjunto de pneumococci atípicos debe ser asignado a una especie diferente, Streptococcus pseudopneumoniae. MLSA de las dos cepas de referencia de esta nueva especie obtenidos a partir de estos autores muestra que S. pseudopneumoniae corresponde a la agrupación en la figura 4, que es semejante, aunque de distinto, auténtico pneumococci.

Junto a S. y S. pneumoniae pseudopneumoniae, dentro del grupo mitis de estreptococos, están estrechamente relacionados con la denominada especie, Streptococcus mitis y Streptococcus oralis. Los aislamientos identificados por la API RapidID 32 estreptococo como bien S. o S. mitis oralis, cuando se someten a MLSA, se dividían en dos grupos que son distintos el uno del otro y de las otras dos especies (figura 4]. Cada uno de estos dos grupos incluyen las cepas identificadas como especies, presumiblemente debido a las limitaciones en la API de pruebas para identificar correctamente. Los nombres que figuran en el gráfico 4 refleja la identificación de las especies predominantes de las cepas dentro de los grupos, lo que nos permite definir como un asociado principalmente con S. mitis cepas y otro que contenga como la mayoría de las personas identificadas como S. oral. Con la excepción de una cepa, todos los "S. oralis' fueron agrupados en el 100% de los árboles extraídos de la probabilidad posterior a stationarity. Del mismo modo, el 'S. mitis grupo se encuentra con un 100% de probabilidad posterior, y está estrechamente vinculada a la S. y S. pneumoniae pseudopneumoniae agrupaciones. La topología de los cuatro grupos mitis grupo difiere, sustancialmente con más diversidad dentro de la S. mitis y S. oralis grupos (media secuencia diversidad de 5,1 y 6,2%, respectivamente) que las de S. y S. pneumoniae pseudopneumoniae (media diversidad de 1,1 y 3,0%). Por otra parte, el promedio de divergencia entre la secuencia de la S. mitis y S. pneumoniae grupos fue el 5,8%, sólo ligeramente mayor que en el S. mitis grupo. Cabe señalar que esta no es necesariamente evidente en el árbol mostrado en la figura 4 como consecuencia de las más apropiado modelo de sustitución de nucleótidos aplicado en todo el árbol. Sin embargo, la diversidad dentro de la S. mitis y S. oralis agrupaciones se demuestra el hecho de que cada aislamiento examinados tenían un genotipo distinto multilocus. Al igual que en la Neisseria ejemplo, los árboles de genes individuales completamente no resuelven el estreptococo especies grupos identificados con la concatenados secuencias (figura 5].

7. Las agrupaciones: los linajes o las especies?

En los dos ejemplos discutidos en la sección anterior, MLSA resuelve las agrupaciones que tienen una clara relación con el nombre de especies, aunque la recombinación entre las cepas en las diferentes agrupaciones es muy evidente a partir de la inspección de los árboles obtenidos a partir de las secuencias de cada uno de los loci. Incluso en las poblaciones de recombinación que co-colonizar la nasofaringe, las agrupaciones pueden resolverse mediante el uso de MLSA, lo que sugiere que las fuerzas evolutivas han dado lugar a distintas que no se solapan genotípica grupos que la microbiólogos han reconocido como especie. Queda por ver si en gran medida ampliando el número de las cepas utilizadas en estos análisis van a mantener la resolución entre los grupos existentes y también si entre ellos muchos ejemplos de los menos bien estudiados los miembros de cada género va a resolver las agrupaciones que apoyan a las denominaciones actuales especies o se sugerir otras nuevas. La ampliación de las bases de datos también puede modificar nuestros puntos de vista actuales de los grupos. Por ejemplo, la identificación de un grupo de cepas que son mucho más similares a uno de los S. oralis cepas que a cualquiera de los otros, produciría un grupo de cepas que son similares entre sí y están claramente resueltas de los demás S. oral cepas. El fenotípica, bioquímica y propiedades ecológicas de este tipo de grupo puede ser examinado para ver si un nuevo nombre de la especie está justificada.

Un problema importante con la secuencia basada en un enfoque de la definición de las especies es de decidir si resueltas las agrupaciones deben considerarse diferentes linajes dentro de una especie o merecen ser asignados a las especies. En los ejemplos mencionados, con la participación de muy bien estudiados los grupos de bacterias, las agrupaciones se correlacionaron con las anteriores denominaciones de especies; a ser un enfoque útil en taxonomía, MLSA tiene que ser capaz de informar a la división de grandes poblaciones de bacterias poco estudiada en las especies. Secuencia de agrupaciones existen en todos los niveles taxonómicos, de los grupos de genotipos muy similares que sean el resultado de la diversificación de un clon en un complejo clonal ( Feil et al. 2004 ) A la profundización de las agrupaciones que pueden ser asignados como linajes dentro de una especie o como especies separadas.

Con el MTAS enfoque, puede ser difícil decidir el nivel taxonómico de un grupo y para distinguir los grupos que parecen ser irreversible establecidos en diferentes trayectorias evolutivas, y que seguirá divergen de unos a otros, de aquellos que son considerados como las mejores diferentes linajes de una sola especie. Criterios generales para el reconocimiento de la naturaleza de las agrupaciones (por ejemplo, el uso compartido o no compartido de alelos, o la presencia de polimorfismos fijos en diferentes grupos) probablemente no son alcanzables para las bacterias en el que la recombinación puede ser muy frecuente o muy raras. En el primer caso, alelo compartir todavía pueden presentarse en distintas especies claramente debido a interspecies recombinación, mientras que si la recombinación está ausente, alelo reparto entre las distintas especies o linajes divergentes dentro de una especie es poco probable, lo que plantea cuestiones de si cada linaje clonal debe considerarse genotypically para formar su propia especie. Estas dificultades no son inherentes debilidades del MTAS, sino más bien problemas inherentes en la búsqueda de principios universales de las especies en la definición de bacterias. La ventaja del MTAS enfoque es que es pragmática, en lugar de basarse en normas estrictas, y permite a las agrupaciones que se hayan determinado y usado como base para juicios sobre la nomenclatura, teniendo en cuenta todo lo adicional se dispone de datos.

8. Especies cesión en Internet: taxonomía electrónico

El MTAS enfoque parece ser un fructífero camino a seguir, sino para definir los límites de las agrupaciones que requiere el análisis de grandes poblaciones de cepas que cubren la diversidad dentro del género (o una parte del género) de interés. El enfoque es ideal para la colaboración en grupos con intereses comunes, que pueden depositar su secuencia de datos en una única base de datos, junto con la cepa características, y puede usar su experiencia y sus conocimientos del género para interpretar los patrones de agrupamiento de genotipos multilocus y para derivar una opinión de consenso de los grupos que merecen los nombres de las especies. Este proceso tendrá en cuenta cualquiera que sea su adicionales fenotípica, bioquímica, genómica, biogeográfica o ecológicos se dispone de información. Una vez que la base de datos inicial se ha establecido, y la agrupación de patrones se han utilizado para orientar la asignación de especies, la secuencia concatenados de cualquier nueva cepa puede ser fácilmente comparado a través de Internet con un conjunto de referencia que abarca la diversidad dentro de cada grupo de especies, a identificar la agrupación en que la tensión cae y asignar a su especie o subespecie nombre. Este servicio ya está disponible en línea en algunas de las bases de datos en MLST www.mlst.net , Por ejemplo, para distinguir S. de S. pneumoniae pseudopneumoniae y B. de B. pseudomallei thailandensis.

Los nuevos métodos deben ser aceptados y utilizados por los taxonomistas. La sugerencia de que MLSA podrá exigir el análisis inicial de un millar de cepas con el fin de descubrir los patrones de agrupamiento dentro de un mismo género, o incluso una parte de un género, y para asignar los nombres de las especies, puede parecer intimidante. La experiencia adquirida en el desarrollo de MLST para la caracterización de cepas de bacterias patógenas proporciona el aliento, como tres de los MLST bases de datos contienen ahora más de 3000 cepas aisladas y varias otras contienen más de un millar. Estas bases de datos se han incorporado como empresas de colaboración académica de la microbiología, microbiología clínica y laboratorios de salud pública, muchos de los cuales no tenían experiencia previa de secuencia de enfoques basados, que comparten un interés en estos importantes agentes patógenos y que presenten sus datos a las bases de datos . Las bases de datos son grandes porque MLST ha demostrado su valía y ha proporcionado un estándar de oro y precisa e inequívoca caracterización de cepas de estos patógenos. Si el MTAS enfoque es igualmente demostrado ser valioso, ofreciendo una mucho mejor manera de definir las especies dentro de un género, y de asignación de nuevas cepas a las especies por vía electrónica a través de Internet, no hay duda de que las grandes bases de datos comisariada pueden desarrollarse para que exista géneros es suficiente interés. La gran fortaleza de este enfoque es que la secuencia basada en la taxonomía permite la colaboración entre los laboratorios con intereses comunes y un enfoque pragmático y consensual a la definición de las especies.

9. Observaciones finales

Secuencia de las agrupaciones son, naturalmente, no necesariamente las especies, pero cualquiera que sea la otra característica cepas asignadas a la misma especie deben compartir, deben poseer la casa de mantenimiento de los genes que tienen secuencias similares, y que están en un promedio más estrechamente vinculadas a las de la misma especie que que son a los de otras especies (Ward 1998]. Nosotros sostenemos que los patrones de agrupamiento debe ser la base para la definición de especies, buscando natural discontinuidades en la distribución de genotipos relacionados y que se puede con más detalle a, a través de métodos fenotípicos clásicos. Puede haber situaciones en las que grandes grupos de bacterias relacionadas con dejar de forma discreta genotípica agrupaciones, y en esos casos es muy poco probable que otros métodos taxonómicos dará coherente grupos de especies. Si estas situaciones ocurren parece probable que se dentro de los grupos de bacterias, donde hay continuos desacuerdos acerca de su taxonomía.

El MTAS enfoque tiene que ser probado con grandes conjuntos de las cepas que se consideran incluidas en una serie de especies estrechamente relacionadas, a fin de que los patrones de agrupamiento puede estar relacionada con otro tipo de información acerca de las cepas. Este enfoque debería aplicarse a grupos de cepas de las especies relacionadas que tienen altas y bajas tasas de recombinación como diferentes patrones de agrupamiento se espera ( Palys et al. 1997 ). Los patrones de agrupamiento necesidad de estar relacionado con especies designaciones obtenidas por el actual enfoque polyphasic ( VANDAMME et al. 1996 ), Y en los que difieren, la validez de las especies divisiones propuestas por los dos métodos tiene que ser evaluada, sin asumir que los nuevos métodos sólo son válidas si la especie resolver divisiones con métodos antiguos.

La división de géneros en especies, y el desarrollo de pruebas simples fenotípica a reconocer cada especie, ha funcionado bien en muchos casos, pero en otros casos, se han producido constantes revisiones taxonómicas y acalorado debate, que puede reflejar una falta de subyacentes claro especies límites o insuficiencias metodológicas. Genes individuales o de un solo fenotípica pruebas no son suficientes para las fiable la identificación de las especies en géneros, donde la recombinación entre las especies es relativamente frecuente y añade peso a la necesidad de enfoques polyphasic en taxonomía ( VANDAMME et al. 1996 ). El análisis de los patrones de agrupamiento en bien estudiados los géneros debe llevar a orientaciones de la mejor manera de aplicar el enfoque MTAS para definir especies dentro de grupos similares de bacterias que no han sido bien estudiados. En tales casos, la identificación de las agrupaciones resolver proporciona una base para la búsqueda de correlatos biológicos de los grupos, en términos de fenotípicos, bioquímicos o ecológicos diferencias, o biogeografía ( Gevers et al. 2005 ).

A diferencia distinguir fenotípica es necesaria para la aceptación de una nueva especie. Si estas diferencias no se encuentran, grupos similares de bacterias que parecen estar genéticamente distintas tienen que ser descrito por otros términos (por ejemplo, genomospecies). La obligación de efectuar una distinción fenotípica diferencia dificulta la asignación de nuevas especies y las necesidades para ser examinada de nuevo, como promiscuas recombinación entre bacterias estrechamente relacionados pueden impedir la identificación de una única definición fenotípica diferencia, y la exigencia de una diferencia fenotípica puede ser impugnada si puede aislados en el futuro ser identificado en línea mediante el uso de múltiples casa de mantenimiento de secuencias para asignarlos a grupos de especies aceptadas por el interrogatorio de una base de datos MTAS.

Un grave inconveniente, compartida con otros criterios taxonómicos, es que puede MLSA en la actualidad no se aplicará a unculturable organismos, que son generalmente considerados como más numerosas que las que pueden ser cultivadas (Rappe y Giovannoni 2003]. Sin embargo, la definición de las propiedades cultivables de la población, y cómo se relacionan con diferencias en sus secuencias de 16S rRNA, es sólo una forma en que podría ayudar a MLSA lugar en este ámbito una base más segura.

Damos las gracias a Mogens Kilian para los debates sobre mitis grupo de especies clusters, Judy Arbique para proporcionar cepas de referencia de S. pseudopneumoniae Jim Staley y útil para los comentarios sobre el manuscrito. Reconocemos el apoyo de Wellcome Trust (WPH y BGS) y la Real Sociedad (CF).