Journal of Molecular Signaling, 2006; 1: 5-5 (más artículos en esta revista)

Estradiol efectos sobre el transportador de dopamina - los niveles de proteína, localización subcelular, y la función

BioMed Central
Cheryl S Watson (cswatson@utmb.edu) [1], Rebecca A Alyea (raalyea@utmb.edu) [1], Bridget E Hawkins (behawkin@utmb.edu) [1], Mary L Thomas (mthomas @ utmb. edu) [2], Kathryn A Cunningham (kcunning@utmb.edu) [2], Adrian A Jakubas (ajakubas@yahoo.com) [1]
[1] Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Univ. de Texas Medical Branch, Galveston TX 77555-0645, EE.UU.
[2] Departamento de Farmacología y Toxicología, Univ. de Texas Medical Branch, Galveston TX 77555-1031, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Los efectos de los estrógenos sobre la dopamina (DA) de transporte puede tener importantes implicaciones para el aumento de la incidencia de alteraciones neurológicas en las mujeres durante fases de la vida, cuando las fluctuaciones hormonales son frecuentes, por ejemplo, durante la menarquia, ciclismo reproductiva, el embarazo, y peri-menopausia.

Resultados

La actividad del transportador de DA (DAT) se midió por la absorción específica de 3 H-DA. Hemos encontrado que las bajas concentraciones (10 -14 a 10 -8 M), de 17 β-estradiol (E 2) inhiben la absorción a través de la DAT células PC12 en más de 30 minutos, con una inhibición significativa teniendo lugar debido a la exposición E 2 sólo durante los últimos cinco acta de la absorción. Esa acción rápida sugiere un no-genómica, la membrana de iniciado mecanismo de respuesta estrogénica. DAT y los receptores de estrógenos-α (ER α) se elevan en extractos de células de un 20 ng / ml 2 días NGF β tratamiento, mientras que ER β no lo era. DAT, ER ER α y β son también detectables en la membrana plasmática de unpermeabilized células inmuno de manchas y de un fijo de células, cuantitativa de anticuerpos (Ab) a base de placa de ensayo. Además, las células PC12 figura ARN de codificación para la alternativa de membrana ER GPR30, por lo que todos los subtipos 3 ER candidatos a la mediación de la rápida nongenomic acciones de E 2. A las densidades de células por encima de 15000 células por pocillo, el E 2 inducida por la inhibición del transporte se invirtió. La adopción actividad oscilado con el tiempo después de un 10 nm E 2 de trato; en un lento temperatura ambiente de ensayo, la inhibición llegaron a un máximo de 9 minutos, mientras que la absorción de actividad aumentó en 3 y 20-30 min. El uso de un Ab reconociendo el segundo bucle extracelular de DAT (accesible sólo en el exterior de las células unpermeabilized), mide nuestra inmunoensayo de membrana intracelular vs / nonvesicular DAT, ambos se encontraron a lo largo de un descenso 5-60 min E 2 tratamiento, aunque los análisis inmunoblot no demostró celular pérdida total de proteínas.

Conclusión

Nuestros resultados sugieren que los niveles fisiológicos de E 2 puede actuar de secuestrar DAT en compartimentos intracelulares donde el transportista extramembrane el segundo bucle es de difícil acceso (dentro de vesículas) y que la rápida acción estrogénica sobre este diferenciadas neuronal tipo de células pueden ser reglamentados a través de la membrana de Emergencia de varios tipos.

Fondo

La dopamina (DA) es una catecolamina neurotransmisor importante en multitud de funciones cerebrales. DA perturbaciones de la neurotransmisión se asocian con una amplia gama de condiciones patológicas. Las diferencias de género en la expresión de algunas de estas enfermedades [1], así como las fluctuaciones en los niveles de estrógeno durante la vida útil de mujeres [2, 3], sugiere la posibilidad de que los estrógenos pueden jugar un papel en la modulación de señalización DA [4, 5 ]. En las mujeres predomina el estrógeno estradiol (E 2), normalmente se levanta de prepúberes cantidades de ~ 20 horas, a tan alto como un pico de 2-3 nM ciclo de concentración en adultos, fluctúa durante el peri-menopausia, y, en última instancia corresponde a crónicamente inferior postmenopause los niveles. En el embarazo E 2 puede aumentar los niveles tan altos como 20 nm, disminuyendo precipitadamente después del parto. Además, otros estrógenos (estriol, estrona) también cambian. Los estrógenos que fluctúan de manera espectacular y, a continuación, la disminución durante la menopausia puede ser correlacionado con la aparición de algunos trastornos del humor [6]. Puberal las fluctuaciones en los niveles de estrógeno están asociados con variaciones de ánimo a las jóvenes [7]. Algunas mujeres experimentan alteraciones de ánimo como una función mensual de las fluctuaciones cíclicas hormonales (síndrome premenstrual o trastorno premenstrual disphoric, o en casos extremos, demencia premenstrual [8 - 10]]. El aumento de la grasa corporal en realidad protege contra el ciclo basado en los cambios de humor [11] y menopausia quirúrgica basada en la depresión, probablemente por que actúa como un depósito para lipophillic hormonas (incluyendo los estrógenos) que grandes cambios buffer [12]. Por lo tanto, en pacientes en que estos cambios son excesivos, alteraciones del comportamiento puede dar lugar, es importante comprender el celular mecanismos mediante los cuales los estrógenos actúan a través de esta amplia gama de niveles fisiológicos [13].

Hay otros específicos sexistas cognitivo o la función neuronal a base de condiciones médicas que pueden implicar DA señalización sináptica. Crisis en la esquizofrenia / bi-polar trastornos a veces puede estar directamente correlacionada con el ciclo menstrual fluctuaciones hormonales [14]. Hay un fuerte aumento en la incidencia de la enfermedad de Alzhiemer después de la menopausia [15]. Algunas enfermedades que implican DA neurotransmisión son menos prevalentes o diferentes en las mujeres premenopáusicas vs las mujeres postmenopáusicas y hombres (de Parkinson, de Tourette, TDAH [16 - 20]], también sugiere una influencia de los estrógenos en estado de la enfermedad. Otros estudios sugieren una implicación de los estrógenos en la función cognitiva [21] y la atención [22 - 24]. Las mujeres son también más vulnerables a la cocaína que son hombres [25 - 27]. Así, los estrógenos influyen probablemente en líneas generales la situación de transmisión de señales neuronales.

Mientras que los estrógenos a través de sus receptores intracelulares se sabe que regulan la transcripción de genes, es cada vez más evidente que los estrógenos también pueden iniciar efectos celulares en la membrana [revisado en [28,29]]. A diferencia de eventos transcripcional, la membrana de iniciado eventos tienen la capacidad de ser reguladas en forma dinámica a corto plazo y no son necesariamente dependientes de la síntesis de proteínas o la degradación. Por otra parte, inició la membrana de eventos pueden ser mejor detectados rápidamente en la celda de ensayo de sistemas en los que los estrógenos pueden ser controlados experimentalmente con rapidez. Por lo tanto, nongenomic estas acciones son con frecuencia a que se refiere como "rápido" las acciones de los estrógenos. Sin embargo, sostenido a corto plazo los efectos de los estrógenos, o los transformadores de mecanismos que iniciar, puede dar lugar a más consecuencias a largo plazo en los animales.

El principal mecanismo mediante el cual los niveles de DA están reguladas en la sinapsis se realiza por medio de reuptake de la DA transportador (DAT), que es un objetivo de acción de una variedad de fármacos, incluyendo neuroactive antidepresivo agentes [30]. De este modo, los trabajos aquí presentados se llevó a cabo para caracterizar un cultivo celular que se expresa tanto DAT y de membrana asociada a los receptores estrogénicos (RE) que podrían utilizarse para investigar la hipótesis de que el estrógeno regula la actividad a través de DAT rápido, nongenomic mecanismos. Hemos elegido un conocido modelo de celular neuronal respuestas que impliquen la regulación de los transportadores de neurotransmisores y receptores, el feocromocitoma PC12 línea celular, en la que la presencia intracelular de los receptores estrogénicos, había sido informado previamente [31 - 33]. Hemos examinado el RE que están posiblemente implicados (ER α [34], ER β [35, 36], y GPR30 [37 - 39]] y ER-mediada por las respuestas orgánicas que pueden explicar los efectos estrogénicos sobre la regulación de neurotransmisores en la sinapsis. En concreto, nos concentramos en una rápida regulación de la DAT que producen cambios en los niveles de DA sináptica que pueden intervenir en DA mediada por las respuestas de comportamiento. Comprender un mecánico del papel de los estrógenos en la modulación de este transportista debe sugerir nuevas dianas terapéuticas y regímenes diseñados para las mujeres frente a pacientes del sexo masculino en el tratamiento de disturbios de comportamiento exacerbado por la fluctuación de estrógenos.

Resultados
DAT upregulated es de 2 días de NGF en el tratamiento de feocromocitoma PC12 modelo de células

Anteriores estudios sobre tratamientos de NGF células PC12 se centró en una mayor diferenciación de células perfil morfológico como criterio de valoración que exige relativamente largos periodos de tratamiento (upregulation de DAT después de dos semanas de tratamiento con 50 ng NGF [40]]. Hemos tratado de lograr una mayor DAT funcional de los niveles en un corto lapso de tiempo. Para desarrollar un modelo de células en las que robustas DAT respuestas podrían ser controlados en la regulación de estrógenos después de la diferenciación de los tiempos más cortos, optamos por los niveles de ensayo DAT directamente a través de un ensayo de inmunofluorescencia. Se han tratado las células PC12 con bajas concentraciones de NGF β para 2, 4 y 7 días. Un inmunoblot de DAT de proteína NGF tratados con células detectado un aumento de la proteína de DAT día 4 de NGF tratamiento (Figura 1A]. Fig. 1B muestra la aparición de DAT en la membrana de 2 días-NGF células tratadas, DAT, donde es evidente tanto en las células y órganos creados en virtud de procesos. A continuación adaptado nuestras condiciones inmunocitoquímica a un inmunoensayo cuantitativo para nonpermeabilized fijo por las células en placas de 96 pocillos, similar a un ensayo anterior hemos desarrollado para otras extracelulares e intracelulares antígenos [35, 41]. Este ensayo (que se muestra en la Fig. 1C] evaluaron sólo membrana DAT (bajo estas condiciones nonpermeabilizing) reconociendo el segundo bucle extracelular de la proteína DAT [42]. Hemos optimizado la fijación de condiciones para evitar que los anticuerpos (Ab) de entrar en las células (como lo demuestra el escaso valor para el control clathrin Ab). Clathrin, situada justo debajo de la membrana de superficie, es un antígeno abundante, y le da una gran señal en este ensayo cuando las células se permeabilized mediante la adición de detergente durante el proceso de fijación (no se muestra). El NGF tratados con células muestran un ~ 8 veces mayor en los niveles de DAT vs células sin tratar después de sólo 2 días. Estos datos muestran una curva de la concentración con el aumento de Ab para determinar la única concentración de Ab que saturar el antígeno para el futuro de un punto de ensayos (1 μ g / ml). Ambos no tratados y tratados con NGF niveles se pueden medir de este ensayo (ambos se encuentran por encima de los valores obtenidos utilizando no 1 ° Ab IgG o inespecíficos en el control de la inespecíficos Ab vinculante, y no 1 ° o 2 ° Ab en el control de la fosfatasa alcalina endógena contribuir a la señal). Hemos elegido estos dos días de duración NGF un trato eficiente y eficaz manera de preparar nuestras células para ensayos funcionales robustos de DAT después de los cambios en el nivel E 2 tratamientos.

E 2 DA inhibe la absorción a través de la DAT

A continuación se dirigió al afectar, de 10 nM E DA 2 sobre la absorción. En primer lugar, hemos analizado la absorción total de DA en las células PC12 (no bloqueado por los inhibidores específicos para definir un mecanismo en particular), y encontró que en general se inhibe la absorción de E 2 (Figura 2A]. A continuación añade el inhibidor específico DAT nomifensine a definir específicamente la absorción mediada por DAT (Figura 2B]. Una vez más, E 2 significativamente bloqueado DAT-DA absorción específica. DAT-específicas se mejoró la absorción de NGF en las células tratadas, de acuerdo con el aumento de los niveles de DAT se muestra en la Fig. 1. NGF-DAT mayor actividad fue inhibido a igual medida que los niveles basales. Por último, aunque una de 30 min de tratamiento con E 2 se considera un período relativamente corto de tiempo para E 2 a actuar (y por lo tanto podría ser atribuible a la nongenomic vía), es posible que algunos todavía sostienen que E 2-inducida por la transcripción y la traducción podría contribuir a un efecto en este lapso de tiempo. Por lo tanto, la próxima prueba una menor E 2 durante el tiempo de exposición de 30 min captación de ensayo (Fig. 2C] para vincular con más claridad esta función inhibidora de E 2 a un nongenomic mecanismo de acción. Una vez más, el tratamiento con NGF aumento de la DAT-específica la captación de DA, lo que sugiere que las nuevas inducida por NGF DAT es funcional. Al 10 nm E 2 se ha añadido sólo para los últimos 5 minutos de la absorción de ensayo, se inhibió de manera espectacular DAT actividad, con más eficacia que durante los 30 minutos de ensayo; absorción fue revertido completamente con tan sólo 5 minutos de hormona de la exposición. El NGF-inducible parte del transporte también fue completamente bloqueado por el tratamiento E 2. Estos efectos no sólo muestran un rápido y eficiente E 2 inhibición, pero también sugieren que la hormona puede revertir la dirección del transportista, causando DA adoptadas en los últimos 25 minutos de ser eliminado de la célula.

PC12 células o proteínas mensaje de los tres tipos de RE ubicados en las membranas

A continuación hemos querido examinar que los subtipos específicos de RE pueden estar presentes en las células PC12 y podrían ser responsables de estos efectos rápidos en DA transporte. La presencia de RE, naturalmente, expresó α y β en células PC12 y su compromiso a largo plazo (semanas) upregulation de NGF se ha informado anteriormente [31, 32, 40, 43], pero no la presencia de estas proteínas en la membrana. Nuestra única banda de la proteína ER α y la Doublet bandas visto para ER β (Figs. 3a y 4a, Western blots) son similares a las que parecen de otros [31] y confirmar que ER ER α y β se expresan en células PC12. Los resultados en la Fig. 3A muestran también que ER α puede ser elevado a 2 por día (o más) NGF tratamiento. Nos sentimos particularmente interesado en demostrar la membrana versiones de RE, ya que esos son los más susceptibles de participar en rápida nongenomic respuestas. Debido a que estos immunoblots figura ER proteína de los extractos de células enteras, que examinó la siguiente localización subcelular de los receptores de estas proteínas. Como era de esperar, ER α ha demostrado estar en el núcleo de fijo, permeabilized células (datos no presentados). ER α fue heterogénea presentes en las membranas de fijo, nonpermeabilized células (Fig. 3B], y apareció en el cuerpo celular y los procesos, dispuestos en forma irregular espaciados puntiforme agrupaciones. Esto es similar en apariencia a la Mer α manchas que hemos observado anteriormente [44 - 46]. Estamos próximos aplicado estas nonpermeabilizing inmunocitoquímica condiciones para el desarrollo de una placa de ensayo cuantitativo que hemos utilizado anteriormente para demostrar Mer α en otras células [35, 47]. Fig. 3C muestra saturability del antígeno de membrana con el aumento de las concentraciones de Ab, y la comparación de los bajos niveles de receptores de membrana a los niveles de ER α nuclear medido con la misma técnica en las células permeabilized con detergente. Las barras muestran los valores correspondientes a estas proteínas cuando las células se permeabilized, y los símbolos dentro de cada barra de mostrar los mismos valores en nonpermeabilized células. Como era de esperar, la membrana de la población de estas proteínas es mucho menor en cada caso que el conjunto de células permeabilized valor en las células. Controles negativos (incluidos los no 1 ° Ab para detectar cualquier inespecíficos vinculante de la 2 ° Ab, y no 1 ° o 2 ° Abs para detectar cualquier endógeno fosfatasa alcalina contribuir a la señal colorimétrica) dio valores muy bajos. La señal clathrin en unpermeabilized células es muy bajo, y el valor permeabilized celular es bastante alto, como era de esperarse para una proteína que residen dentro de la membrana plasmática.

El otro clásico ER miembro de la familia, ER β se investiguen de manera similar. En contraste con ER α, NGF tratamiento que abarca 7 días no afectan los niveles de esta proteína del receptor (Fig. 4A]. En la Fig. 4B Mer β se evaluó mediante inmunocitoquímica de NGF en células diferenciadas preparado con una técnica de fijación nonpermeabilizing. La aparición de Mer β es muy similar a la de Mer α - tinción de membrana heterogénea entre las células, puntiforme, y distribuyen de forma desigual tanto en las células y órganos creados en virtud de procesos. Una vez más, la medición de este receptor se prestan a una placa de ensayo cuantitativo (Fig. 4C], que mostró una saturable antígeno del receptor de la proteína en la membrana, con un poco más altos niveles presentes en el plenario (permeabilized) las células; bajo el control de los valores negativos y positivos de control de alta los valores fueron similares a las indicadas para la ER α placa de ensayo.

Por último, hemos examinado el ARN de estas células para determinar si la rata GPR30 ARN se expresó, la falta de una rata para Ab GPR30 necesario este enfoque. Un RT-PCR amplimer de que se prevé tamaño pueden producirse a partir de células PC12 ARN (Fig. 5], utilizando dos conjuntos diferentes de los cebadores. Este resultado coincide con los positivos para el control de línea celular, MCF-7 humanas células del cáncer de mama. No hay señal fue evidente cuando ARN muestras fueron omitidas, lo que demuestra que los reactivos contaminados no producir esta señal. A pesar de esta RT-PCR de detección no es un método cuantitativo, los niveles de ARN del GPR30 en células PC12 parece ser similar a la de MCF-7 células.

DA adopción está regulada por E 2 dosis, el tiempo de exposición a E 2, y la densidad de E 2-células expuestas

En estudios previos hemos constatado que Mer α y la parte de abajo efectos que medie en la hipófisis (GH3/B6/F10) las células fueron profundamente influenciadas por la densidad en las células que se cultivaron, con el aumento de densidad celular, la expresión de Mer α (a favor de intracelular ER α ) Se redujo drásticamente. Las células cultivadas a mayores densidades (aunque no inusual para la mayoría de las densidades de cultivo de células de experimentos) también se convirtió en no responden a E 2 para nongenomic acciones [46]. Por lo tanto, hemos examinado el efecto de las células cultivadas en diferentes densidades en los 5 min, 10 nM E 2 inducida por la inhibición de la absorción de DA en las células PC12 (Fig. 6A]. El aumento de la densidad de 10000 a 15000 células por pocillo de un 48-y el aumento de la placa mensurables DA absorción; E 2 es aún completamente eficaz en la inhibición de este mayor nivel de absorción. Sin embargo, cuando las células eran aún más lleno de gente a 20000 células por así, el efecto inhibidor de E 2 se perdió, y en su lugar un estimulante efecto estrogénico en DA se observó transporte.

Porque hemos observado reiteradamente no convencionales de las relaciones dosis-respuesta para estos nongenomic estrogénicos respuestas, que siempre prueba nuestras respuestas en un muy amplio (FM para nM) intervalo de concentración. Fig. 6B muestra un análisis de este tipo de E 2 's efectos en la absorción DA respuesta. Como hemos observado para respuestas rápidas en otros tejidos [29, 41, 48, 49], hay más de un pico de actividad inhibidora de E 2 en las células PC12, separados por las concentraciones en las que E 2 es menos eficaz (10 -10 M).

Para determinar la rapidez y la estabilidad de este efecto estrogénico en DA transporte, que examinó un tiempo de 10 nm E 2 exposición, concentrándose en los más rápidos (<30 min) los incrementos esperados para operar a través del mecanismo nongenomic. Como hemos visto muchas veces en el pasado para nongenomic respuestas [41, 47], rápidamente oscilante temporal fases de esta respuesta era evidente. Debido a que estos efectos cambiado rápidamente a lo largo del tiempo (de inhibición para la mejora de la absorción) a 37 ° C, los resultados les habían proporcionado alguna gran error de tiempo, como se esperaba para este sistema de fluctuación más corto intervalos de tiempo cuando las muestras tienen que ser retirados de la incubadora para su análisis . Por lo tanto, reducirá la temperatura del ensayo (ambiente) de esperar a crear un mundo más estable demostración experimental de esta oscilación. En estas condiciones (Fig. 6C], pico efectos inhibitorios se les vio a los 9 minutos de tiempo. Una pequeña mejora del transporte se produjo a los 3 min y una más sólida a 20-30 min.

E 2 DAT afecta a las proteínas de localización, pero no en general los niveles celulares

Porque DAT mediada por absorción fue inhibida por E 2, el próximo examinó si esto podría deberse a 2-E inducida por el tráfico de DAT o la reducción de los niveles de proteína. Hemos adaptado nuestra placa de ensayo cuantitativo para DAT para medir la superficie celular intracelular vs DAT, permeabilizing de las células de la última medición con detergente durante la fijación de células paso. Un Ab para el segundo bucle extracelular de DAT transportista reconoce que es o bien en la membrana plasmática o en el interior de la célula, pero no sujetos a la vesícula (en cuyo caso el 2 º bucle se enfrenta la vesícula inaccesible interior). Fig. 7 muestra que la cantidad de DAT se redujo en ambos compartimentos celulares. A continuación miró a la totalidad de células DAT niveles de proteína, para determinar si E 2 podría tener un efecto rápido sobre la estabilidad de proteínas DAT. Esa rápida rotación a veces ocurre que para phosphoproteins después de la activación se ubiquitinated y posteriormente enviada a proteosomes o lisosomas. Fig. 8 muestra que el tratamiento E 2 no tuvo ningún efecto sobre los niveles de proteína DAT, en comparación con los vehículos tratados con las células, a través de un tiempo de 5 min a 1 hr.

Discusión

Nuestros estudios demostraron la expresión de DAT y varios tipos de membrana de Emergencia (ER α, β y ER GPR30) en células PC12. Hemos demostrado temprana (2 día), dosis bajas de NGF mejora de DAT y ER α niveles, con consecuencias funcionales. Nuestra novela cualitativos y cuantitativos de demostración de las versiones de membrana ER ER α y β en estas células sugiere que podría ser mecanicista mediadores para la rápida E 2-funcionales inducidos por los efectos que vimos; estos efectos son demasiado rápido para ser mediada por receptores nucleares a través de controles transcripcional. Por otra parte, la detección de ARN GPR30 expresión en las células PC12 sugiere que este recién descrito único ER también podría participar en estas respuestas. Los resultados mostraron que los niveles fisiológicos de E 2 (FM a 10 nM) puede causar muy rápida y espectacular la inhibición de la DA transporte en las células PC12. Esto es similar a la rápida los efectos sobre el transporte de serotonina que hemos descrito previamente en RN46A células [48]. Estos cambios en DAT actividad no se deben a importantes efectos sobre el volumen de negocios de la DAT de proteínas, sino que probablemente operan a través de la trata de DAT [50] en vesículas que proteger a sus dominios extracelulares de detección de Ab, o modificación postraduccional mecanismos que aún no se han investigado .

Tratamientos de estrógeno puede aliviar las enfermedades humanas que puedan implicar la transmisión DA? El tratamiento con estrógenos algunas ha demostrado aliviar algunos casos de depresión posparto (revisado [51]]. Sin embargo, las razones de los fracasos en los demás casos, o una justificación específica para la dosis de estrógeno y la elección todavía no está claro. Evidencia directa en apoyo de una estrategia de tratamiento con estrógenos incluye simulación de pre-y post-parto, los niveles de estrógeno [52]. Hay un modelo de rata para E 2 reversión de la depresión [53] y, sin embargo, E 2 terapia en el ser humano no siempre es eficaz para revertir la depresión de ánimo [52, 54 - 56]. Una explicación de estas diferencias podría ser que otros destacados metabolitos de estrógenos (estrona, estriol) también participan en esta función, y deben ser incluidos como parte de tratamientos destinados a combatir las enfermedades de ánimo provocado por el aumento hormonal o déficit. Además, la eficacia de dichos tratamientos podría estar sujeta a las concentraciones de estrógenos adecuados, y nuestros estudios han demostrado una vez más [29, 41, 48, 49] nonconventional que una relación dosis-respuesta hace que las predicciones de dosis eficaces más difícil.

Uno de los efectos reguladores que hemos detectado para este estrógeno / DA modelo de sistema de señalización es el cambio en la respuesta estrogénica debido a la medida en que las células estaban en contacto unos con otros (provocado por el aumento de densidad de las células). Hemos observado previamente cambios similares en los efectos debidos al aumento de densidad de las células - MER de inhibición de la expresión α y respuestas vinculado a otros tipos de células [46, 47]. Los experimentos usando células cultivadas en estas densidades superiores inhibitoria es bastante común en la mayoría de los laboratorios, y puede ser una causa común para los informes negativos para nongenomic mecanismos de señalización y del receptor de membrana de detección de esteroides. Además, se observó a estos efectos varían con el tiempo, similar a nuestras anteriores observaciones de otros nongenomic efectos. Los mecanismos que pueden intervenir en dicha reglamentación (como el post-translacional modificaciones de las proteínas) son también capaces de una rápida reversión de compensación y los cambios en el tiempo y en respuesta a los cambios en la celda de células en contacto, como los que ocurren durante el desarrollo. Es evidente que es mucho más información acerca de los efectos de esas limitaciones reglamentarias en la nongenomic estrogénicos sistema de respuesta y su receptor (s) se necesitan antes de que podamos aprovechar las ventajas de estos mecanismos en el diseño terapéutico. Estos datos también demuestran por qué precisa de dosis-respuesta y el tiempo de respuesta de información es muy importante para la determinación segura y eficaz las terapias de reemplazo con estrógenos. Dado que los estrógenos pueden aumentar el riesgo de cánceres como los de mama, útero [57], y pituitaria [58], y puede causar una disminución en las funciones cognitivas específicas [59, 60], la dosis y la programación de sustituciones puede ser bastante importante . Aunque los efectos protectores de los estrógenos en contra de algunos isquémica y glucocorticoides inducida por la lesión cerebral se ha demostrado [61, 62], tales estudios se han centrado en dosis muy altas de estrógenos que son inaceptables para el uso crónico a causa del riesgo de cáncer. Por lo tanto, es evidente que todavía no entendemos los detalles de cómo los estrógenos actúan en la vía nongenomic en relación con el tejido-específico y la no clásica dosis-respuesta patrones [63]. De este modo, a sabiendas de parámetros tales como la menor dosis eficaz varía de estrógeno y la cinética de estos mecanismos de respuesta son críticos.

Nuestros datos sugieren que un mecanismo que pueda mediar E 2-DA inducida por la inhibición de la absorción se trata de DAT a un Ab-sitio de difícil acceso dentro de la célula. Informes recientes indican que DAT pueden ser reguladas por endocitosis [50, 64 - 67]. Además, los agentes que causan la fosforilación de DAT podrá regular el tráfico de su secuestro a determinados compartimentos intracelulares [50, 67, 68]. PKC media probablemente estos efectos a través de la modificación de un C-terminal pentapeptide secuencia con homologías entre DAT, SERT y la norepinefrina (NET) los transportistas [50]. E 2 se conoce a activar las enzimas fosforilantes de proteínas (incluidas las PKC) a través de vías nongenomic (revisado en [69]], por lo que podría afectar a las funciones de DAT (y otros transportistas de esta familia) a través de este mecanismo. A veces también la fosforilación de proteínas para las marcas de ubiquitina el etiquetado, la eliminación de proteosomes, y la degradación [67, 70]. Esto no parece ser el caso en nuestro sistema experimental, ya que no DAT notable pérdida de proteínas producido a lo largo de corto plazo de exposición E 2. Sin embargo, cabe señalar que inmunoblot cuantificación parece ser el menos sensible de nuestros ensayos para detectar los cambios en los niveles de proteína. Sin embargo, dado que no conlleve grandes cambios en los niveles eran evidentes, es más probable que los efectos estrogénicos directa en nuestro sistema se encuentran en actividad y localización de la máquina DAT.

Nuestras observaciones de ER candidato proteínas en la membrana plasmática de las células PC12, coincidente con un rápido efecto estrogénico mediado, añade otro ejemplo a nuestra creciente lista de tales esteroides regulados los sistemas que emplean las nongenomic vía de acción. Lo hemos hecho amplios estudios sobre la localización celular de la ER α en el GH 3 / B6/F10 celular modelo y visualizar la membrana versión de este receptor por una variedad de técnicas [34, 35, 44, 45]. Recientemente, también hemos extendido estos estudios a ER α en MCF-7 células [71] y hemos desarrollado una historia similar a la expresión de la membrana del receptor de glucocorticoides [72, 73] en los tejidos linfoides. En general, nos encontramos con que el número relativo (un menor número de receptores de membrana en comparación con los receptores nucleares), la distribución y la aparición de estos grupos aparentemente agrupadas de receptores es similar, y de acuerdo con la membrana del receptor de esteroides caracterizaciones de otros grupos de investigación (por ejemplo, [74, 75]]. Sin embargo, la presencia de Mer β en las células PC12 es única entre las células que han estudiado el uso de estas técnicas; Mer β sólo ha sido previamente observado en las células que expresan más de una ER β cDNA [36]. Nuestra observación de la presencia de ARN GPR30 en estas células presenta una tercera posibilidad para la regulación de DAT por una ER quizás co-residente en la membrana plasmática de estas células [76]. Los estudios futuros se examinarán los roles específicos de cada uno de estos subtipos de receptores de membrana en la regulación de la DAT.

Conclusión

En resumen, elucidar los mecanismos celulares y los receptores que son responsables de la regulación de los esteroides neurotransmisor transportista funciones serán de importancia crítica para la adopción de decisiones médicas sobre la cantidad adecuada y el tipo de hormonas administradas para beneficio terapéutico. Esto será de importancia crítica para las condiciones comunes tales como post-quirúrgica o post-menopáusicas pérdida de estrógenos, y mensual o el embarazo las fluctuaciones del ciclo. Debemos entender la base de acciones fisiológicas, como los estrógenos E 2 en este sistema, a fin de que los análogos o antagonistas pueden utilizarse para aliviar la vida-etapa específica de efectos estrogénicos o déficit. Un nuevo enfoque en nongenomic esteroides efectos pueden permitir totalmente nuevos enfoques para el tratamiento de estas enfermedades, y fisiológicas que explican los estrógenos en dosis de lo que debe considerarse en el diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades.

Métodos
Célula de la cultura y la administración de hormona

Estamos propagar nuestras células PC12 en un 15% de suero que contienen medio, el despacho a subcultura de pipeteado en repetidas ocasiones las células. Sin embargo, antes de cada experimento, las células fueron trasladados a un determinado medio de 48 horas para asegurar la retirada de los efectos de los estrógenos y otras hormonas y factores de crecimiento presentes en el suero. Nuestro medio es definido alto de glucosa, rojo fenol libre de RPMI 1640 (Gibco / Invitrogen, Grand Island, NY), sustituyendo el 15% de suero con suero MCT sustitución (Celox Laboratories, St. Paul, MN). Durante este período de hambre suero NGF β (un regalo del doctor Regino Pérez-Polo) fue agregado a (a 20 ng / ml) a las culturas de estos estudios. Estudiamos "nativos" de células mediante la regulación NGF estimulación para alcanzar los niveles de DAT en nuestras células que pueden ser fácilmente ensayadas para el efecto inhibitorio de E 2, en lugar de células transfecting con que se construye sobre-expresar DAT. De esta manera, nuestros estudios difieren de muchas publicados anteriormente DAT Reglamento estudios. En estas condiciones, las interacciones reguladoras pueden estar sujetas a un menor número de artefactos debido a la sobre-expresión, como el nivel normal del receptor de las interacciones con otras moléculas de señalización.

La inmunocitoquímica

PC12 células chapada en poli-D-lisina (10 μ g / ml) revestido con cubreobjetos fueron cultivadas en 6-bien a la densidad de placas de células por 20000-40000 así durante 24 horas. Después de suero hambre ± NGF tratamiento, las células fueron fijadas mediante 2% de paraformaldehído (Fisher Científico, Houston, TX), y el 0,2% gluteraldehyde (Microscopía Electrónica, Fort Washington, PA) durante 30 minutos. Cuando proceda, las células fueron permeabilized durante la fijación mediante la adición de NP-40 (o IGEPAL CA-630 puede ser sustituido) y sacarosa [35]. Unquenched aldehídos se redujeron por la aplicación de un 13 mM NaBH 4, 70 mM NaHPO 4 solución acuosa durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para mayor reducción de autofluorescence fondo, del reactivo de Schiff (Fisher) se aplicó durante 15 minutos mientras que en el hielo, y luego se enjuagan, tres veces con agua sulfurosos (volúmenes iguales de 1 N-HCl y el 10% de metabisulfito de sodio solución acuosa). Los pozos se lavaron (10 minutos) con una segunda reducción de solución (1% Na 2 HPO 4 / 1% NaBH 4 en ddH 2 O) a temperatura ambiente, agitando con la luz. Esto fue seguido por 15 minutos en PBS lavado. Las células fueron bloqueados durante 45 minutos a RT con el 0,1% de gelatina de pescado frías (Sigma, St Louis MO) en PBS. Las células se incubaron durante la noche a 4 ° C (con agitación orbital luz) con primaria Ab (diluido en gelatina de pescado / PBS), el 1 ° Ab hemos utilizado para la detección de ER α, a concentraciones de 2-10 μ g / ml fue C542 ( StressGen, Inc, Collegeville, PA). Anti-ER β monoclonal Ab (9,88 clon, Sigma E1276) se utilizó en diluciones que van desde 1:500-1:2000. Ab DAT/e2 a la DA transportista se une al segundo dominio extracelular [42], y se obtuvo de A. Levey (Emory Univ.). Se utiliza en concentraciones que van desde 0.025-10 μ g / ml. Anti-clathrin Ab (CIE bioquímicos, Inc, Aurora, OH) se utilizó en las concentraciones de 1-3 μ g / ml como control para la permeabilización de células. Se utilizó ratón IgG1 κ (Sigma) como irrelevante Ab isotipo y control. Ab secundaria (ya sea con biotina ratón IgG o IgM, de Vector Laboratories, Burlingame, CA) se ha diluido (50 μ L/10 ml) en 0,1% de gelatina de pescado / PBS e incubadas con muestras durante 1 hora a RT. El uso de un kit de Vector Laboratories, ABC-AP solución (diluida en PBS) se añadió, seguido por una serie de lavados de PBS y, a continuación, Vector Roja sustrato de fosfatasa alcalina (Vector Laboratories) se añadió por 2-5 minutos. El sustrato de fosfatasa alcalina fue preparado por la adición de 2 gotas de cada reactivo de la carpeta a 5 ml de 100 mM Tris-HCl (pH 8,2-8,5) y la adición de un inhibidor endógeno fosfatasa levamisol (Vector Labs) a una concentración final de 0,5 mm. La solución fue removido y los pozos enjuagar inmediatamente con ddH 2 O, un pequeño volumen se dejó a cada bien hasta el cubreobjetos está dispuesta a pasar por el ciclo siguiente: la deshidratación con dos cambios de 70% de etanol (30 segundos cada uno), seguidos por dos cambios de etanol al 100% (30 segundos cada uno). El cubreobjetos fueron liquidados con tres lavados de xileno (3 minutos cada uno) y luego montar con Cytoseal 280 (Microscopía Electrónica). Las imágenes fueron vistos en virtud de un filtro FITC Leitz con un microscopio de fluorescencia equipado con un CoolSNAP Pro-cámara digital de los medios de comunicación cibernética utilizando Image-Pro Plus software. La célula imágenes fueron vistos usando un amplio espectro FITC filtro. En estas condiciones, la coloración rojo intenso de la Transmisión Vectorial Roja se observa como manchas de color rojo anaranjado, el verde tinción es inducida por aldehído autofluorescence fondo. Se utilizó con estas fotografías incluidas autofluorescence fondo para dar una simultánea de células esquema sobre el que el Ab mediada por Vector Roja señal es visible. Específicas de tinción fue también visible utilizando un filtro de rodamina, pero sin el fondo verde (no se muestra).

Western Blot

PC12 células fueron cultivadas a 50% confluencia de 100 mm en placas de Petri y el suero de hambre ± NGF para 2-7 días. Las células fueron entonces enjuagarse dos veces con helado de PBS y solubilized en 0,5 ml de buffer de lisis (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Tritón X-100; 2,5 mM pirofosfato de sodio, 1 mM β glycerolphosphate-1; mM Na 3 VO 4, 1 μ g / ml leupeptina, 1 mM PMSF) a 4 ° C. Después de ultrasonidos (4 × s, cada 5 segundos), el material insoluble se eliminaron por centrifugación a 15000 × g durante 10 min. El extracto fue tratado con EDS muestra de amortiguación y hervido durante 5 min. Alícuotas fueron ensayadas para la concentración de proteínas (BioRad), y 20 μ g / ml de proteína total fue sometido a SDS-PAGE en el 10% de acrilamida, y luego transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Blots fueron bloqueadas (2% nonfat seco de leche, 1% BSA en 10 mM Tris-solución salina amortiguadora pH 7.4) durante 1 hora, seguido por la noche a la mañana con la incubación primaria de Ab ER α (1 μ g / ml Stressgen, SRA 1010), ER β (1 : 1000, Sigma E1276), o DAT (DAT/e2, 1:500 de A. Levey) a 4 ° C. Blots fueron incubadas y enjuagarse con y conjugado con peroxidasa anti-mouse IgG (1:4000, en el sur de Biotech) para ER ER α y β, y conjugado con peroxidasa-anti-rata (1:4000, en el sur de Biotech) para DAT a RT por 2 horas. Inmunoreactividad se detectó en X-ray film (Amersham) por mejorar la quimioluminiscencia.

Placa de inmunoensayo para la detección y cuantificación de DAT y ERS

Hemos desarrollado originalmente sensible y cuantitativo específico fijo de células sándwich inmunoensayos adecuado para placas de 96 pocillos para demostrar Mer α en la superficie celular de las dos células GH3 y MCF-7 células del cáncer de mama [35, 47]. Para el presente estudio hemos adaptado aún más el ensayo para su uso con células PC12, a medida DAT, era ER y β. Las células fueron chapados en el suero que contienen medio, alimentados con suero sin definirse medio de 48 horas, luego fija con un 2% paraformaldehyde/0.1% glutaraldehído. Las células fueron tratadas con los siguientes reactivos, con el lavado de pasos entre cada aplicación: NaBH 4 aldehído libre para la reducción de la gelatina de pescado para el bloqueo; Ab 1 °; biotina 2 ° Ab; conjugado avidina-fosfatasa alcalina, y el levamisol (para bloquear la endógeno mamíferos subtipo de la fosfatasa alcalina). Luego PNPP, un sustrato de la fosfatasa alcalina, se añadió, la elaboración de un amarillo soluble dephosphorylated producto (PNP), medido en un 405 nm. Por último, el PNP se lavan los reactivos de los pozos, y las células teñidas con cristal violeta (CV); después de la extracción, este colorante se dio lectura a un 590 nm como una medida del número de células, para que nuestro antígeno valores se normalizaron.

Este ensayo fue adaptado para medir los mismos antígenos en el compartimiento intracelular, simplemente incluyendo la membrana de la permeabilizing detergentes en la fijación de paso, a fin de que los niveles intracelulares de (permeabilized) y extracelular (unpermeabilized) antígenos se pueden comparar esencialmente por los mismos métodos [35] . Por lo tanto, analizarse los antígenos de membrana intracelular para la reubicación (el tráfico). Ab para la abundante antígeno intracelular clathrin se utilizó para determinar el estado de permeabilización de las células en cada ensayo.

Medición de transporte DA [77]

PC12 células cultivadas (1-4 × 10 4 / así en poli-D-lisina-48-revestido así placas) y enjuagarse preincubated en una solución tampón durante 30 minutos bajo condiciones de ensayo a 37 ° C. Inhibidores fueron incluidos en este paso preincubación. Transporte ensayos fueron iniciados por la adición de una solución tampón que contiene 3 H-DA (Dupont NEN, 50 nM único punto para ensayos), monoamineoxidase inhibidores pargyline o selegeline [78], ácido ascórbico (para la estabilidad metabólica de E 2 y otros compuestos), y 50 nM DMI (para inhibir cualquier contribución de la NET). Los inhibidores específicos DAT nomifensine (500 nM) o GBR-12909 (100 nM) se incluyeron en las muestras paralelas; las diferencias entre las respuestas ± estos inhibidores se utilizaron para definir la absorción debido a DAT. En algunos casos E 2 se añadió al mismo tiempo con la etiqueta DA; en otros casos se añadió después de la etiqueta DA incubación había seguido para el número de minutos; por lo tanto, E 2 se agregó sólo en los últimos minutos de la absorción de ensayo. Los ensayos se dieron por concluidas con rapidez el lavado de los pozos 3 × con helado de amortiguación. Las células fueron entonces solubilized en el agua durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación, o por un congelar y descongelar ciclo, y una alícuota evaluado por 3 H líquido a través de scintillation contar. En algunos casos, otra alícuota fue ensayada para contenido de proteína con una Bio-Rad Bradford ensayo; este valor determinado pozos donde las células se ha convertido en desvinculado de la parte inferior y, por exclusión de datos. La adopción de ensayos para determinar los cambios temporales en la regulación se hace a 15000 células por pocillo y a temperatura ambiente, la ralentización de la reacción y que permite con menos posibilidad de errores mediciones.

ARN aislamiento y análisis de PCR

ARN fue preparado a partir de células PC12 lisado utilizando el kit RNAqueous (Ambion). Primera línea de cDNA de síntesis se ha realizado mediante el superíndice primer capítulo III del sistema de síntesis de RT-PCR (Invitrogen). En pocas palabras, 2 μ g de ARN, 50 μ M oligo (dT), 10 mM dNTP mix, y DEPC-agua tratada hasta 10 μ l de volumen final se incubaron a 65 ° C durante 5 minutos y se coloca en hielo durante 1 minuto. Las muestras fueron incubadas durante 50 minutos a 50 ° C con la adición de 10 μ l de cDNA de síntesis que contenga la mezcla RT buffer, 25 mM MgCl 2, 0,1 M de TDT, RNaseOUT, y Superíndice III RT (200 U / μ l). La reacción se dio por terminada la calefacción de las muestras a 85 ° C durante 5 minutos. La reacción de PCR se realizó en 25 μ l GoTaq Flexi ADN polimerasa de amortiguación (Promega) que contiene 0,2 μ M de ambos genes específicos sentido y antisentido primers, además de 0,5 μ l de la reacción RT. Los primers (especie de regalo del doctor Peter Thomas [39]] fueron diseñados utilizando GenBank secuencia de adhesión no. BC011634 . 1 juego de primers fue: sentido, 5'-GGC TTT GTG GGC AAC ATC-3 '; antisentido, 5'-AAA CGG GAC TGC TTG CAG G-3'. Primer conjunto 2 es: sentido, 5'-GCA GCG TCT TCT TCC TCA CC-3 '; antisentido, 5'-GCC TGA ACA GCT TGT CCC TG-3'. El producto de PCR se obtuvo utilizando el sistema de PCR GeneAmp 9700 con 35 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 seg a 55 ° C, y 2 min a 72 ° C seguido por 10 min de extensión a 72 ° C. Los productos de PCR fueron electrophoresed en un 1% en gel de agarosa al 0,5% bromuro de etidio, y las bandas correspondientes a los productos previstos de 680 bp (juego de primers 1) y 585 pb (el juego de primers 2) se identificaron.

Estadísticas

A una forma ANOVA (SigmaStat 3.0) se utilizó para determinar la significación de los efectos del tratamiento en comparación con los controles del vehículo. Significación estadística fue aceptado en la p <0,05.

Conflicto de intereses

CW es un miembro del consejo consultivo científico para CertiChem Inc

Autores de las contribuciones

BH, AJ, TR y llevó a cabo la identificación de proteínas y estudios de cuantificación. BH y la RA DA realizado estudios de absorción. MT y KC ayudado en el desarrollo de estos estudios, ha prestado apoyo financiero, y con frecuencia experimento ayudó en el diseño y discusión de los resultados. CW fue el líder del proyecto y diseñador de este estudio, y participó en todos los aspectos. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias al doctor Allan Levey para proporcionar la DAT Ab específicos para el dominio extracelular y asesoramiento sobre el éxito de su uso. Damos las gracias a Teresa M. Reed por su excelente asistencia técnica. También damos las gracias a los Dres. David Konkel y Marcy Bubar de comentarios y edición de este manuscrito. El apoyo financiero para estos estudios fue proporcionada por el Memorial Sealy Fondo de Dotación y el Centro para víctimas de abuso de drogas de Investigación en la Universidad de Texas Medical Branch. RAA fue apoyada por el Centro de Sealy para la Salud Ambiental y la medicina, y una beca predoctoral de NIEHS T32-07254.