Journal of Molecular Signaling, 2006; 1: 6-6 (más artículos en esta revista)

Amino terminal de fosforilación de la tirosina humanos MIXL1

BioMed Central
Wei Guo (WGuo@mednet.ucla.edu) [1], Lalitha Nagarajan (lnagaraj@mdanderson.org) [1]
[1] Departamento de Genética Molecular, MD Anderson Cancer Center, Universidad de Texas, Houston, Texas 77030, EE.UU.

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen

Siete miembros de la familia de Mix pareados de tipo regular homeoproteins mesodermo y endodermo diferenciación en los anfibios. En los mamíferos, los MIXL1 (Mix. Homeobox 1 [Xenopus laevis]-como el gen 1) gen es el único representante de esta familia. A diferencia de los anfibios Mix genes que codifican un marco de lectura de> 300 aminoácidos, mamíferos MIXL1 codifica una proteína más pequeños (~ 230aa). Sin embargo, mamíferos MIXL1 contiene un único rico en prolina de dominio (PRD), con un potencial para interactuar con la señal transducing Src homolgy 3 (SH3) dominios. En particular, MIXL1 humano también contiene un único residuo de tirosina que se Tyr20 amino-terminal para el PRD. Aquí mostramos que las proteínas de mamíferos MIXL1 es fosforilados en Tyr20 y la fosforilación se reduce dramáticamente en la ausencia del PRD. Nuestros resultados son consistentes con la fosforilación de Tyr20 ser MIXL1 un posible mecanismo de regulación que rige su actividad.

Fondo

Mix. 1, de Student para datos apareados-al igual que los genes homeobox, fue identificado inicialmente como un inductor del mesodermo ventral y / o endodermo en Xenopus [1, 2]. Posteriormente, varios genes estrechamente relacionados, Mix 2-4, Bix 1-4, y Mixer, se encuentran aislados y para regular el mesodermo y endodermo o formación [3 - 6]. Sin embargo, en el pollo (CMIX), ratones (MIXL1/Mml) y los seres humanos, la Mix-como homeobox (MIXL1) genes parecen ser de una sola copia [7 - 12]. Además, mamíferos MIXL1 codifica una pequeña proteína de ~ 230 aminoácidos, en contraste con los ~ 340 aminoácidos de proteínas codificadas por los genes Xenopus. Sin embargo, casi todos los miembros de la familia Mix son modulares, con una muy conservadas en parejas de tipo homeodominio y un conservadas carboxi-terminal de ácido dominio (CAD). Una característica distintiva de CMIX, Mml/MIXL1 y humanos MIXL1 es la presencia de prolina-rica dominios (PRD). Tanto el ratón y el humano MIXL1 contener un amino-terminal del PRD entre los residuos 31-60; en pollo sin embargo, el PRD parece ser carboxilo a la recaudación del homeodominio la posibilidad de que la función de este dominio puede ser modular.

El Xenopus Mix / Bix genes se expresan en mesodermo ventral y / o endodermo [1, 3 - 6]. Del mismo modo, la expresión de Mml/MIXL1 ratón o el pollo CMIX se produce inicialmente en el endodermo y visceral, se convierte en restringido a nodo primitivo y de la naciente mesodermo en la gastrulación, en ratones, lo que incluye la hemangioblast, un precursor de hematopoyética vascular y las células madre [9 - 14 ]. La expresión de MIXL1 humanos se limita a los progenitores y los tejidos linfáticos secundarios en adultos [8]. El temporal y espacial patrón de expresión de Mix-al igual que los genes sugiere que estos genes están estrechamente regulado durante el desarrollo embrionario y la diferenciación hematopoyética. El MIX familia parece ser regulado por al menos tres vías de señalización: TGF β / Activin / BMP, FGF, y p53 [2 - 4, 6, 15 - 19].

Un papel para la mezcla de genes familia en el desarrollo se sugiere por tanto ganar-y la pérdida de función de los experimentos. Xenopus Mix.1 gen está implicado en el proceso de modelado mesodermo ventral destino a hematopoyética inducida por BMP-4 [15] y en endodermo desarrollo de sinergia con otras moléculas reguladoras como Siamois [2]. Al igual que en Mix.1, expresión ectópica de MIXL1 humanos inducida por la hematopoyesis embrionaria en Xenopus animal gorras [8]. Homocigótica interrupción de ratón Mml / MIXL1 dado lugar a un marcado engrosamiento del nodo primitivo, graves defectos en el mesodermo paraxial, y la falta de corazón y tubo de intestino [20]. In vitro ES diferenciación más ensayos demostraron que Mml/MIXL1 murino que se responda BMP4 y necesario para la hematopoyesis eficaz [14].

En contraste con el desarrollo de estudios sobre este gen familia, nada se sabe sobre las vías bioquímicas que regulan MIXL1 mamíferos. Ausencia de miembros de una familia numerosa junto con la ganancia del PRD en los mamíferos, plantea una serie de posibilidades para el mecanismo de células similar suerte o la diferenciación de las vías reguladas en anfibios y mamíferos. Uno de ellos puede ser tejido-o el grado de desarrollo específicos de la fosforilación de MIXL1 que puede simular las diversas funciones de regulación de múltiples miembros en Xenopus. En este informe, muestran que las proteínas de mamíferos MIXL1 es fácilmente fosforilados en el amino terminal tyr20. Tyr20 fosforilación de MIXL1, un posible mecanismo de regulación que rigen su actividad se reduce drásticamente en ausencia del PRD.

Materiales y métodos
Plásmido construcción y mutagénesis

La larga duración MIXL1 humanos ORF, Δ CAD mutantes con el truncamiento de carboxi-terminal de ácido dominio y Δ N25 mutantes con el truncamiento de ambos amino-terminal de 25 pb y la región carboxi-terminal de ácido dominio se amplificado por PCR y clonados en vectores de expresión CMV5 (una especie de don David W. Russell, UTSW a Dallas, TX) y CMV2 bandera (Sigma, St Louis, MO) para generar CMV5-MIXL1, CMV2-Bandera-MIXL1, CMV5 Δ-CAD, CMV2-bandera-Δ CAD y CMV2 - Δ bandera-N25. El amino terminal de CMV2-bandera-Δ CAD fue sustituido por el 1-93 bp amino-terminal de parte de MIXL1 a generar la construcción del pabellón CMV2-Δ-PC carece de ambos PRD y CAD dominios. Y110F mutación fue presentado por PCR con una cartilla que contiene una A-a-T (Tyr-PHE) mutación puntual. El MIXL1 carboxi-terminal porción (301-699), de construir el pabellón de CMV2 - Δ CAD o CMV2-bandera-Δ N25 fue sustituida por la amplificación de fragmentos MIXL1 llevar la A-a-T mutación puntual para generar la construcción de CMV2-bandera-Y110F o CMV2-bandera-Δ2 Y. Precisión de las construcciones generó fue confirmada por secuenciación doble hundidos.

Cultivo de células y transfección

HEK 293T células fueron modificadas cultivadas en medio de Eagle (MEM, Invitrogen), complementado con un 10% de SFB, 0,1 mm no aminoácidos esenciales y 1 mM piruvato de sodio (Invitrogen) a 37 ° C en el 10% de CO2. Por transfección, las células fueron chapados a una densidad de 2 × 10 5 células por pocillo en un 6-así placa 2 días antes de la transfección. El transfections se realizaron con LipofectAmine (Invitrogen) según las indicaciones del fabricante protocolos. Monto total de transfectadas ADN se ajustó a 1 μ g por bien mediante el uso de vectores de sus padres. Las células fueron cosechadas nuclear para la extracción de 48 horas después de transfección. Por immunoprecipitation experimentos, la transfections se ampliaron a las placas de 100 mm.

Immunoprecipitation y immunobloting

Nuclear se prepararon extractos de células transfectadas 293T [8] y diluido, aproximadamente a 1,0 μ g de proteína / μ l de lisado. En pocas palabras, 500 μ l de los extractos nucleares fresca se pre-limpiado con 50 μ l de proteína A-agarosa bolas purines (50% v / v, Roche, Indianapolis, IN) a 4 ° C durante 30 minutos en un agitador orbital. Después de centrifugación a 14000 × g a 4 ° C durante 10 minutos, el sobrenadante fue mezclado con 5 μ g de anticuerpo monoclonal murino 4G10 (Upstate) o el control isotypic (anticuerpo monoclonal murino contra el epítopo-V5 Invitrogen) a 4 ° C por la noche a la mañana el agitador orbital. Los complejos inmunes-fueron capturados por la adición de 50 μ l de proteína Una bola de agarosa purines (50% v / v) y mecer suavemente por el agitador orbital a 4 ° C durante 2 horas. Después de pulso centrifugación a 14000 rpm durante 8 segundos, el immunecomplex-proteína-A-agarosa-talón "pellets" fueron recogidos y lavados 5 veces con 800 μ l de helado radioimmunoprecipitation modificados (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7,4] ; 150 mM NaCl, 1% NP-40; 0,25% de sodio deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 μ g / ml leupeptina, 2 μ g / ml pepstatin A; 2 μ g / mL de aprotinina; 500 μ g / mL benzamidine 1; mM Na3VO4 1; mM NaF) y una vez con 800 μ l helado 1 × PBS. Los pellets que contienen complejos inmunes se resuspendido en 60 μ l de 2 × muestra buffer (100 mM Tris-HCl [pH 6,8], 200 mM TDT, SDS 4%, 0,2% Azul de bromofenol, 20% glicerol).

Immunoprecipitates o proteínas nucleares se resolvieron (50 μ g de proteína por carril) en pre-emitidos el 10% NuPAGE geles (Invitrogen). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a Hybond P membrana de nylon (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a 30 V noche a la mañana. El protocolo de immunobloting es esencialmente, según se detalla en otra parte [21]. Conejo anticuerpo policlonal anti-MIXL1-N [8] se utilizó en una dilución de 1:100 o 1:500 inicialmente para inmunotransferencia estudios. Mouse anticuerpo monoclonal anti-bandera M2 (Sigma) 1:300; anticuerpo monoclonal de ratón 4G10 (Upstate) 1:3000 o 1:4000.

Fosfatasa alcalina tratamiento

Extractos nucleares de células HEK 293T transfectadas con CMV5-MIXL1 se preparó sin la adición de inhibidores de la fosfatasa de fluoruro de sodio y sodio orthovanadate. Inmediatamente después de la extracción, 15 μ g de proteína nuclear se incubó con 40 unidades de ternera intestino fosfatasa alcalina (CIAP, Roche) en un 20 μ l de reacción durante 30 minutos a 30 ° C. Como control, la misma reacción se realizó en presencia de 100 mM de sodio orthovanadate, que inhibe la actividad de la CIAP. Además, un simulacro de reacción También se realizó sin la CIAP. Las reacciones se dieron por concluidas con NuPAGE muestra buffer (Invitrogen). Los cambios en la movilidad de proteína se determinó por el sondaje immunoblots con la lucha contra la MIXL1 N-anticuerpo.

Resultados y discusión
MIXL1 es fosforilados en varios sitios

Cuando la escuela para pedir una expresión MIXL1 impulsada por CMV en virtud de promotor en la construcción de pCMV5-MIXL1 fue probada por transfección transitoria en la HEK línea celular 293T, que hemos detectado al menos tres especies de MIXL1 proteínas en extractos nucleares de immunobloting con la lucha contra la MIXL1-N anticuerpos. Experimentos similares con otras construcciones que contengan la expresión de larga duración o truncado MIXL1 también detectaron al menos dos especies de MIXL1 proteínas. Para probar la posibilidad de que las múltiples bandas fueron la MIXL1 proteínas modificados por fosforilación, los extractos nucleares fueron tratados con fosfatasa alcalina (CIAP) para eliminar los grupos fosfato de fosforilados proteínas. MIXL1 proteínas se detectaron por immunobloting con la lucha contra la MIXL1 N-anticuerpo. Como se muestra en la Fig. 1, el anticuerpo reconoce específicamente cuatro especies de MIXL1 sin tratar en extractos nucleares. Sin embargo, la CIAP tratamiento tuvo como resultado la desaparición de dos especies, α y β en la parte superior y en gran medida la intensificación de las señales de la parte inferior dos bandas (γ y δ). Es interesante señalar que la adición del inhibidor de la fosfatasa orthovanadate restaurado las cuatro especies de MIXL1 proteínas en la mancha, lo que demuestra que las dos isoformas más lento de la fosfatasa MIXL1 son sensibles. El más lento de las especies migratorias MIXL1 proteínas (α) también se perdieron en los simulacros de reacción, sin adición de la CIAP. La pérdida podría ser debido a la actividad endógena de la fosfatasa de extractos nucleares, como los inhibidores de la fosfatasa no se utilizaban tanto en la nuclear y la extracción de simulacros de reacción. En conjunto, la fosfatasa sensible a las propiedades indica que la proteína es MIXL1 fosforilados en múltiples sitios.

MIXL1 es tirosina fosforilados

Una predicción de fosforilación programa llamado Netphos 2,0 en el dominio público [22] fue utilizado para búsqueda de posibles sitios de fosforilación en la MIXL1 secuencia de proteínas. Al comparar la secuencia de proteínas MIXL1 con fosforilación consensos para conocer quinasas, el programa prevé 14 posibles sitios de fosforilación de los cuales 10 residuos de serina, treonina 3 residuos y el 1 de residuos de tirosina. Puesto que es el único residuo de tirosina de los dos mostró potencial de fosforilación, optamos por fosforilación de la tirosina examinar en primer lugar. El anticuerpo 4G10 fosfotirosina, que pueden detectar específicamente la tirosina fosforilados de proteínas, se utilizó para ver si es MIXL1 tirosina fosforilados. Nuclear extractos preparados a partir de las células 293T transfectadas con las construcciones pCMV5-MIXL1 (de larga duración MIXL1) y pCMV5 Δ-CAD (CAD-suprimido mutante, Δ CAD) se cargó en dos ejemplares para immunobloting. La mitad de la mancha se hibridó con el anticuerpo 4G10 y la otra mitad con la MIXL1 de anticuerpos específicos de proteínas para mostrar la integridad y la posición relativa de MIXL1 sobre la mancha. Como se muestra en la Fig. 2, la fosfotirosina anticuerpo 4G10 detectado un débil en la banda de extractos nucleares de las células con las de larga duración MIXL1, que no estuvo presente en los extractos nucleares con el control de vectores. La debilidad de las especies se encuentra en una posición similar a la de la MIXL1 proteínas detectadas con el anti-MIXL1-N de anticuerpos, lo que sugiere que la MIXL1 podría ser tirosina fosforilados en células HEK 293T. En consonancia con esta posibilidad, la fosfotirosina anticuerpo detectado una única banda de intensidad mucho más fuerte en una posición correspondiente a mutantes Δ CAD, lo que demuestra que la supresión del CAD de dominio podrían resultar en un aumento de la fosforilación de la tirosina MIXL1 proteínas, posiblemente debido a una mayor estabilidad o un acceso más fácil a la fosforilación sitio (s).

La detección de fosforilación de la tirosina immunobloting fosfotirosina con el anticuerpo no podía excluir la posibilidad de que el anticuerpo 4G10 estaba obligado no específicamente a la abundancia de MIXL1 proteínas overexpressed en células 293T. Para hacer frente a esta posibilidad, hemos examinado si MIXL1 proteínas se podrían immunoprecipitated con el anticuerpo 4G10, que se une específicamente a fosfato residuos de tirosina. El anti-MIXL1-N anticuerpo detectado un débil pero señal concreta de larga duración MIXL1 proteínas en la immunoprecipitates con 4G10 (Lane 1, 2 y 3 en la Fig. 3]. Del mismo modo, los mutantes Δ CAD se immunoprecipitated específicamente con el anticuerpo 4G10 fosfotirosina (Lane 4, 5 y 6 en la Fig. 3]. Los resultados demostraron que el fosfato de tirosina anticuerpo reconoce específicamente MIXL1 algunas proteínas en extractos nucleares. Immunoprecipitation El análisis confirmó además que se MIXL1 tirosina fosforilados en células 293T.

Amino terminal es Tyr20 fosforilados

MIXL1 sólo contiene dos residuos de tirosina. De éstos, uno se encuentra en el amino-terminal de dominio (Tyr20) y el otro es en homeodominio (Tyr110). Por lo tanto, es fácil determinar la fosforilación de la tirosina sitio (s) en MIXL1 de análisis mutacional. Dado que el mutante Δ CAD mostró una señal mucho más fuerte para la fosforilación de la tirosina a la escuela para pedir MIXL1 en el Western Blot con el anticuerpo 4G10, que fue empleada en el análisis de mutación. Sobre la base de la Δ CAD secuencia mutante, que generó 3 MIXL1 mutantes con un punto de mutación en el residuo Tyr110 o un pequeño amino-terminal supresión incluidos Tyr20 o ambos (Fig. 4A]. Dado que el anticuerpo anti-MIXL1-N no puede detectar los amino-terminal suprimido las proteínas mutantes, un pequeño epítopo Bandera se añadió en el marco de amino-terminal de todos los extremos de los tres mutantes, así como la mutante Δ CAD (Fig. 4A]. Nuclear extractos de las células 293T transfectadas con los cuatro construcciones fueron preparados para immunobloting con el anticuerpo 4G10. La misma mancha fue desnudado y rehybridized con el mouse monoclonal anti-Flag anticuerpos, que detecta la Bandera epítopo. Sorprendentemente, el anticuerpo 4G10 fosforilación de la tirosina detectado en el mutante Bandera-Y110F que contiene el único residuo de tirosina Tyr20, similar al que en los mutantes Bandera-Δ CAD (rebautizado como Bandera-2Y aquí) con residuos de tirosina (Fig. 4B]. En contraste, los anticuerpos 4G10 no detectar fosforilación de tirosina en el amino-terminal supresión mutante Bandera-Δ N25 que contiene el único residuo de tirosina Tyr110, así como la mutante Δ2 Bandera-Y tanto que carecen de residuos de tirosina, aunque los niveles de proteína para los cuatro construcciones fueron similares en los extractos nucleares (Fig. 4B]. Por otra parte, la misma tendencia se detectó en el COS-1 células transfectadas con esos cuatro construcciones (datos no presentados). Por lo tanto, estas observaciones sugirió tyr20 a ser el blanco de fosforilación en células HEK 293T, aunque este es incompatible con la predicción de que el programa Netphos2.0. Si es tyr20 fosforilados en proteínas endógenas MIXL1 aún no se ha confirmado.

Ausencia de PRD provoca una marcada reducción en la fosforilación de tirosina

Estudios recientes revelan que el sustrato de fosforilación de proteínas a menudo contienen un dominio de acoplamiento específicas contratar a proteínas quinasas [23]. En algunos casos, el PRD en el sustrato las proteínas pueden competir contra el auto inhibitorio de la interacción entre el dominio SH3 y dominio catalítico, interactuando con dominio SH3 en proteínas quinasas tales como Src [24]. Dado que el ser humano contiene una MIXL1 PRD inmediatamente aguas abajo de los residuos Tyr20 (11 residuos aguas abajo de los residuos Tyr20), que postula que el PRD en humanos MIXL1 pudieran estar implicados en la fosforilación de tirosina. Por lo tanto, hemos examinado la fosforilación de la tirosina-PRD suprimido MIXL1 proteínas. Desde Δ CAD mutante muestra señales más fuertes para la fosforilación de la tirosina, un concepto que contenga el gen mutante MIXL1 con la supresión de la doble PRD y CAD dominios (Δ PC), se ha generado y transfectadas en células 293T. La fosforilación de la tirosina los mutantes Δ PC se determinó mediante immunobloting con el anticuerpo 4G10. Como se muestra en la Fig. 5, la fosforilación de la tirosina en el mutante Δ PC es mucho más débil que la de los mutantes Δ CAD, lo que sugiere que el PRD, aunque no absolutamente necesario para Tyr20 fosforilación, puede ser importante tanto para lograr la plena escala fosforilación o el mantenimiento de la estado de fosforilación de la prevención de dephosphorylation. Futuros estudios con anticuerpos específicos para la Tyr20 fosforilados proteína dilucidar cómo y cuándo se produce la fosforilación. Más importante aún, será fundamental para examinar la fosforilación de MIXL1 endógena en los tejidos hematopoyéticos y células del cáncer de mama. Por lo tanto, el presente informe es un primer paso para elucidar la función potencial del PRD y Tyr20, características únicas para la gripe aviar y mamíferos MIXL1.

Desde MIXL1 localiza a la predominantemente al núcleo (Guo y Nagarajan resultados no publicados), la quinasa (s) responsables de la fosforilación de la tirosina MIXL1 es probable que se localizan en el núcleo. Diez de las 90 tirosina quinasas codificados en los seres humanos, se sabe que para localizar el núcleo (por Latas et al [25]]. Por lo tanto los probables candidatos son c-ABL1, Wee1, FRK, Lyn, FES familia (FES y FER) y JAK familia (JAK1, JAK2, JAK3, y TYK2). A pesar de que el presente se realizaron estudios en células HEK293, varias de estas quinasas se expresan en el sistema hematopoyético. Además, desde la fosforilación de la tirosina MIXL1 no fue examinada en el citoplasma, que no podía excluir que se MIXL1 tirosina fosforilados en el citoplasma y trasladadas en el núcleo.

A diferencia de serina / treonina fosforilación, fosforilación de la tirosina en las proteínas del homeodominio rara vez se informó hasta la fecha. De ahí que el papel de fosforilación de la tirosina en la regulación de las proteínas del homeodominio en gran medida sigue siendo poco clara. El único caso denunciado es la fosforilación de la tirosina HoxA10 durante el interferón-γ inducida por la diferenciación mieloide. En este caso, el interferón-γ inducida por la diferenciación condujo a HoxA10 fosforilación de tirosina en el mielomonocítica línea celular U937, que disminuyó de ADN vinculante HoxA10 a PBX-HoxA10 sitios de unión [26]. Sin embargo, SHP1 proteína-tirosina fosfatasa (SHP1-PTP), que antagoniza la diferenciación mieloide, disminución de la fosforilación de la tirosina HOXA10 homeodominio mejorando así HOXA10 mediada por la represión [27].

Un tejido-o del ciclo celular específica de la fosforilación puede alterar MIXL1 actividad. Futuros estudios dilucidar si la fosforilación de proteínas mediada por las interacciones proteína-debido a la excepcional PRD en humanos, ratón y pollo Mix-al igual que las proteínas de hecho sustitutos de la diversidad funcional alcanzado por varios miembros de Xenopus Laevis.

Agradecimientos

Damos las gracias al apoyo de Abraham J y Phyllis Katz fundación. La Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center Servicio de Secuenciación de DNA cuenta con el apoyo de NIH núcleo concesión CA-16672.