Journal of Molecular Signaling, 2006; 1: 8-8 (más artículos en esta revista)

Rac inhibe la trombina inducida por la activación Rho: pruebas de un Pak que dependen de GTPase crosstalk

BioMed Central
Hans Rosenfeldt (Hans.Rosenfeldt @ fda.hhs.gov) [1], Maria Domenica Castellone (mcastell@unina.it) [1], Paul A Randazzo (randazzp@mail.nih.gov) [2], J Silvio Gutkind (sg39v@nih.gov) [1]
[1] oral y Pharyngeal Cancer Branch, National Institute of Dental y Craneofacial Research, National Institutes of Health, DHHS, Bethesda, Maryland 20892-4330, EE.UU.
[2] Laboratorio de Oncología Celular, CCR, National Cancer Institute, National Institutes of Health, DHHS, Bethesda, Maryland, 20892-4340, EE.UU.

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen

La estricta espacio-temporales de control de Rho GTPasas es un factor crítico para muchas funciones celulares, entre ellos la motilidad celular, la contractilidad, y el crecimiento. En este sentido, el prototipo de la familia Rho GTPasas, Rho, el RAC, Cdc42 y regular la actividad de unos a otros por un mal entendido todavía mecanismo. De hecho, encontramos que constitutivamente formas activas de RAC inhibir el estrés y la formación de fibra Rho estimulación de la trombina. Sorprendentemente, un mutante de RAC que no es capaz de activar Pak1 no para inhibir la trombina de señalización para Rho. Para explorar el mecanismo subyacente, que investigó si Pak1 podría regular el intercambio de nucleótidos guanina factores (GEFs) para Rho. Se encontró que Pak1 asociados con P115-RhoGEF pero no con PDZ-RhoGEF o mayor, y tumbar experimentos reveló que P115-RhoGEF desempeña un papel importante en la señalización de los receptores de la trombina a Rho en células HEK293T. Pak1 vincula a los DH-PH dominio de RhoGEF-P115, con lo que sugiere un mecanismo por el cual RAC Pak1 estimulación de los receptores puedan interrumpir dependiente de Rho señalización. De acuerdo, expresión de un dominante-negativo-Pak inhibitoria de dominio potenció la activación de Rho de la trombina, e impidió que la inhibición de Rho de CCR. Estos resultados indican que interfiere con RAC-dependiente del receptor de la estimulación a través de Rho Pak1, proporcionando así un mecanismo para la transferencia de hablar entre estas dos pequeñas GTPasas.

Fondo

La familia Rho GTPasas de control de una amplia variedad de funciones críticas de células que son importantes en el desarrollo, la inmunidad, y las enfermedades que van desde los procesos de oncogénesis, la hipertensión y el asma. Estos comportamientos incluyen células migración, proliferación, póngase en contacto con la inhibición-, y la contracción [1]. La correcta ejecución de estos procesos celulares depende de la multa espacio-temporales regulación de las pequeñas GTPasas dentro de una celda. Esto se consigue mediante la regulación coordinada de guanidina factores de cambio (GEFs), que estimulan las proteínas Rho, y la activación de proteínas GTPase (BPA) y los inhibidores de la disociación del PIB (GDIs), que terminar o inhibir su función [2]. La gran mayoría de GEFs contener una homología Dbl-(DH) de dominio, por el que se unen y estabilizar las pequeñas GTPasas en un nucleótido-estado libre, y el uso de 10 veces el exceso molar de GTP intracelular sobre el PIB para promover su posterior unión a GTP [2]. GAP proteínas, por otra parte, ejercer una regulación negativa de asociarse con GTP-obligado proteínas Rho y la mejora de su actividad GTPase. GDIs también inhiben la actividad Rho GTPase, de carácter vinculante inactivos PIB sujetos a las proteínas y la estabilización de Rho GTPasas en este "despegue" del Estado [3]. De estos pequeños GTPase reguladores, DH-FMAM que contengan proteínas han sido la mejor manera de describir los mediadores de señalización de los receptores de la superficie celular, incluyendo la proteína G unida receptores y los receptores de tirosina quinasas, a las pequeñas GTPasas [4].

Los cambios en el comportamiento global de células resultantes de la activación de Rho GTPasas de GEFs se reflejan en una serie de bien descrito alteraciones morfológicas, incluida la formación de actina lleno de protuberancias como filapodia y lammellipodia, y el montaje de cables paralelos de actina (estrés - fibras) [1, 5]. Entre estas estructuras celulares, los dependientes de Rho formación de fibras de estrés ha sido implicado en la contractilidad de fibroblastos cultivados [6]. Polarizar las células móviles durante quimiotaxis en la dirección y rastrero bordes que se caracterizan por Cdc42 y RAC actividad a la vanguardia y la actividad Rho a la retracción final de la celda [7]. La presencia de un compartimiento subcelular de retracción de juego contrapunto a la rica lammellipodia vanguardia es un rasgo distintivo de la polarización y la movilidad celular. La inhibición de Rho dependiente de señales con inhibidores farmacológicos o mutantes dominantes negativos, destruye esta polarización, que produce alteración chemotactic respuestas [7].

Desde la descripción inicial de la proto-típico de la familia Rho GTPasas, Rho, el RAC, y Cdc42, se ha reconocido que estas moléculas regulan cada actividad de la otra parte. En Suiza las células 3T3, los efectos de un exceso de activos Rho, el RAC, y Cdc42 mutantes citoesqueleto de actina a las características morfológicas de una cascada donde Cdc42 activa CCR, que a su vez activa Rho [5]. Estudios más recientes que utilizan otros tipos de células, sin embargo, han demostrado que Rho y RAC puede tener efectos opuestos sobre la migración celular y el crecimiento del cono de extensión [7 - 10]. En consonancia con estas últimas, encontramos que el RAC Rho impide la activación y el estrés de fibra formación en respuesta a la trombina en tanto las células endoteliales y células HEK293T. Aunque a explorar el mecanismo subyacente, se observó que el RAC de dominio efector mutantes que no de obligar a Pak1, un rac efector, no para inhibir la trombina inducida por el estrés y la formación de fibra Rho activación. Como se puede estimular la trombina Rho a través de la α heterotrimeric subunidades de proteínas G de la G 12/13 de familia, hemos examinado si Pak1 puedan interactuar con los miembros de la RGS-que contiene la familia de Rho FMAM, PDZ-RhoGEF, mayor y P115RhoGEF, que actúan corriente abajo α de G 12/13 [11, 12]. De hecho, encontramos que Pak1 puede obligar a la DH-PH dominio de P115RhoGEF, para formar un complejo molecular in vivo. Por otra parte, aportar pruebas de que Pak1 puede representar un punto de señal que permitan la integración de RAC para inhibir el receptor-dependiente de Rho estimulación.

Resultados
Rac inhibe la trombina inducida por el estrés y la formación de fibra activación de Rho

Con el fin de investigar la interacción entre Rho y RAC de señalización, hemos probado si la trombina que dependen de estrés fibra formación fue sensible a RAC de señalización (Figura 1A]. La incubación de células endoteliales con la trombina mostró sorprendentes aumentos en el estrés de las fibras. Estas estructuras aparecieron como los cables de actina de espesor en funcionamiento a lo largo de la longitud de la célula. En lugar de ello, RAC-transfectadas las células tuvo una invariante en forma redondeada, exhibió un alto nivel de actina cortical, y no el estrés de forma fibras trombina a la estimulación. Estos resultados sugieren que el CCR de señalización fuertemente afectado la capacidad de la trombina para estimular Rho. Para investigar esta afirmación, nos pregunta si la presencia de RAC constitutiva de modulación de la señalización intracelular de los niveles de Rho obligado a GTP. Como se muestra en la figura 1B, transfección de una forma activa de CCR en las células HEK293T impedido la acumulación de Rho-GTP en respuesta a la estimulación de la trombina. En conjunto, estos datos revelaron que el RAC de señalización abroga la trombina de señalización para Rho.

De examinar más a fondo que vías de señalización corriente abajo del RAC podría ser la inhibición de la trombina de señalización a Rho, que tomó ventaja de la disponibilidad de RAC activado mutantes portadores de mutaciones adicionales que restringen su capacidad de señalización. Como se muestra en el gráfico 2, un mutante que faltan RacV12 la inserción de la región Rac1-α dominio que está implicado en RAC-dependiente de la activación de especies reactivas del oxígeno (ROS), sin embargo, fue eficaz en el bloqueo de estrés fibra estimula la formación de trombina [13]. Por el contrario, RacV12C40, un dominio efector de RAC mutante que no es vinculante ni activar Pak, no pudo evitar el estrés de fibra formación en respuesta a la trombina (Figura 2A] [14]. Se confirmó estos resultados con Rho-menú desplegable ensayos para detectar los niveles relativos de Rho-GTP después de la trombina estimulación. Tanto el control de células y células transitoriamente el exceso de expresar RacV12C40 acumulado niveles similares de Rho-GTP después de la estimulación de trombina (Figura 2B]. No obstante, tanto la RacV12 y RacV12 Δ ins mutantes impedido el tratamiento de la trombina creciente Rho-GTP niveles, paralela a los efectos observados con el estrés de fibra formación.

Pak1 interactúa con P115RhoGEF

Como RacV12C40 mutante es incapaz de obligar a Pak1, por lo tanto, se centró en determinar si Pak1 podrían participar en el RAC de trombina la inhibición de señalización para Rho. Rho activación estimulada por G 12/13 de receptores acoplados como receptores de la trombina se ha demostrado que se producen a través de la RGS-Rho GTP que contienen factores de cambio, una familia de proteínas que incluye PDZ-RhoGEF, mayor, y P115RhoGEF [12, 14, 15] . Curiosamente, en un reciente estudio hemos observado que Pak4, pero no Pak1 y Pak2, inhibe la actividad funcional de PDZ-RhoGEF a unirse a su C-terminal de reglamentación región [16]. Sobre la base de esta observación, que investigó si hubo una interacción física entre RGS contienen RhoGEFs y Pak1. Como se muestra en la figura 3A, P115RhoGEF, pero no PDZ-RhoGEF o mayor, co-immunoprecipitated con Pak1, y esta interacción fue reforzada por la presencia activa de CCR. Molecular asociación entre Pak1 y P115RhoGEF también podría ser detectados cuando P115RhoGEF se immunoprecipitated (Figura 3B]. Por otra parte, immunoprecipitated completa P115RhoGEF fue eficiente fosforilados por Pak1 (Figura 3C].

Para evaluar la contribución de la trombina en P115RhoGEF señalización a Rho, hemos utilizado siRNA oligonucleótidos a P115RhoGEF desmontables en las células HEK293T (Figura 3D]. El agotamiento de P115RhoGEF en estas células Rho afectada en gran medida de activación en presencia de trombina. Aunque P115RhoGEF desmontables total disminuyó ligeramente los niveles de Rho, ECL cuantificación de los riesgos de estos experimentos utilizando NIH Image ™ demostró que P115RhoGEF desmontables inhibido> 60% de Rho-GTP acumulación en respuesta a la trombina tratamiento. Para definir mejor la interacción entre P115RhoGEF, hemos utilizado un conjunto de construcciones P115RhoGEF supresión para determinar dónde se une Pak1 (Figura 4A]. Co-immunoprecipitation estos experimentos con mutantes reveló que la supresión de la P115RhoGEF N-terminal facilitado en gran medida vinculante para Pak1 (Figura 4B]. Por el contrario, la supresión de la C-terminal produce una proteína que todavía se rige por el RAC. El C-terminal región, que ya ha sido descrito como un sitio de proteína-proteína interacción en RGS GEFs, fue incapaz de obligar a Pak1. Estos resultados reducido la región de interacción entre Pak1 y P115RhoGEF a una región entre los aminoácidos 351 y 771. Es interesante señalar que estos residuos constituyen la DH y PH dominios de P115RhoGEF. Para comprobar si directamente Pak1 podría enlazar este motivo, nos pregunta si Pak1 podría obligar a la DH-PH P115RhoGEF de dominio, así como los aislados DH-PH de dominios PDZ-RhoGEF y mayor. De estas tres proteínas, sólo el DH-PH dominio de P115RhoGEF fue capaz de obligar a Pak1 (Figura 4C]

RAC requiere Pak1 para Rho inhibición in vivo

Estamos próximos en tela de juicio la noción de que Pak1 función es necesaria para RAC mediada por la inhibición de Rho. En el descanso, unstimulated, las células Pak1 existe como homodimer en la que cada socio vinculante inhibe la quinasa de dominio de los demás [17]. La región de Pak1 que se une e inhibe la quinasa de dominio ha sido aislado. Este dominio Pak1 inhibitoria (PID) puede utilizarse para bloquear la actividad Pak1 y los efectos biológicos de Pak1 señalización, tales como la disociación de RAC de RhoGDI [18, 19], GPCR que dependen de la transformación celular y estrógeno-dependientes de la transcripción en células del cáncer de mama [20, 21]. De hecho, transfección con este PID dominio aumentado de manera dramática la Rho respuesta a la trombina (Figura 5A]. Es importante destacar que la expresión de Pak1 PID dominio invertido la capacidad de RAC señalización para inhibir la trombina activación de Rho (Figura 5B]. Estos datos Pak1 fuertemente implicado como mediador de la inhibición de la RAC trombina señalización para Rho.

Discusión

La RAC y Rho GTPasas tienen efectos opuestos en muchos tipos de células, incluidas las endoteliales, músculo liso y células neuronales, y puede anular las señales unas de otras, dependiendo de tipo de células [8 - 10, 22]. En este estudio, mostramos que la capacidad de la trombina para promover el estrés de fibra y estimular la formación de Rho puede ser inhibida por activar las formas de CCR. En la búsqueda de mecanismo subyacente, encontramos que el RAC de dominio efector mutantes que no pueden interactuar con Pak1 dejar de bloquear la trombina de señalización para Rho. De hecho, la inhibición de uno de Pak-Pak inhibitoria construir el mayor grado de activación de Rho tratamiento después de la trombina, y ha impedido co-transfectadas RAC de bloquear el aumento de Rho-GTP. Por otra parte, aportar pruebas de que el RAC promueve la formación de un complejo molecular entre Pak1 y P115RhoGEF en vivo, una molécula de señalización que se requiere para la mayor parte de la trombina de señalización a Rho, proporcionando así un probable mecanismo por el cual puede restringir RAC Rho activación.

Los informes recientes han implicado Pak familia quinasas en la regulación de Rho GEFs. En particular, un período de dos híbridos pantalla enfoque para obligatorias las moléculas de C-terminal de reglamentación de dominio PDZ-RhoGEF identificado Pak4, Cdc42 un efector que es miembro de la clase II Pak familia como un socio vinculante [16, 23]. Del mismo modo, el FMAM-H1, una microtúbulos localizados Rho Exchange Factor, Pak1 se une a su C-terminal, y el FMAM-H1 un sustrato para esta quinasa [24]. Por otra parte, Cdc42 activado Pak1 puede estimular la fosforilación del FMAM-H1 in vitro, lo que sugiere un posible papel para Pak1 en la regulación del FMAM-H1 abajo de receptores celulares. Recientemente, Alberts y sus colegas informaron de la fosforilación inhibitoria de NET1 las afueras de su DH-PH de dominio, por Pak1 [25]. Así pues, aunque no podemos descartar que los CCR podrán regular RhoGDIs o RhoGAPs a través de Pak1 Rho, lo cual inhibe la activación de la trombina, nuestros resultados sugieren que este efecto inhibidor de RAC pueden ser ejercidas a través de la unión de Pak1 a P115RhoGEF.

El mecanismo exacto por el cual Pak1 regula P115RhoGEF función es en la actualidad desconocidos. Aunque Pak1 puede obligar a la aislados DH-PH dominio de P115RhoGEF, Pak1 no phosphorylate este dominio cuando se expresa y se purifica de E. coli in vitro en ensayos de cinasa, ni la unión de Pak1 afectar a la in vitro de intercambio de GTP actividad de RhoA en p115RhoGEF (no se muestra). Del mismo modo, no se observan cambios en la Rho in vitro de actividad del FMAM P115RhoGEF cuando su supresión diferentes construcciones se expresaron junto con Pak1 en células 293T (no se muestra), que está alineado con la acumulación de pruebas que indican que la actividad in vitro de RGS Rho-GEFs que contiene no refleja plenamente su probable compleja regulación in vivo. Por ejemplo, estos Rho GEFs están mal activados in vitro por α G 12, a pesar de la fuerte evidencia de que α 12 G interactúa y se activa el FMAM actividad de esta clase de Rho GEFs in vivo [26, 27]. Del mismo modo, la supresión de la potente actividad inhibitoria ejercida por la C-terminal de la región p115RhoGEF, PDZ-RhoGEF, y mayor en vivo no se traduzca en el aumento de la capacidad de estos GEFs para estimular el intercambio de nucleótidos en Rho in vitro [28]. Por lo tanto, es posible que las moléculas adicionales podrán participar en la regulación de P115RhoGEF de Pak1 en vivo, Pak1 o que pueden interferir con la orientación de p115RhoGEF activado por G 12/13 a una determinada fracción subcelular o membrana microdomain, cuyas consecuencias funcionales no se refleja en la actividad del FMAM p115RhoGEF in vitro.

Por otro lado, la constatación de que la une Pak1 DH-PH dominio de P115RhoGEF puede tener importantes consecuencias reglamentarias a la proteína G-link activación de los receptores. Estudios anteriores han demostrado que el dominio de RGS P115RhoGEF regula el PH-DH actividad catalítica [26]. En este modelo, el dominio de RGS P115RhoGEF se une el DH-PH intramolecularly dominio, obstaculizando así sterically su capacidad de interactuar con las proteínas Rho. Pak1 vinculante para larga duración P115RhoGEF es estimulada por la presencia activa de Rac1, lo que sugiere que la activación de Pak1 de CCR aumenta la interacción entre Pak1 y P115RhoGEF. Sin embargo, este reglamento se suprime cuando el N-terminal de 351 aminoácidos de P115RhoGEF, que incluyen la RGS dominio, se suprimen. Por otra parte, los aislados DH-PH dominio de P115RhoGEF une Pak1 constitutivamente en vivo. Esto puede ser reflejo de lo que es probable que se produzca a ligando inducida por la activación de P115RhoGEF. En este escenario, la estimulación de GPCRs, como receptores de la trombina, activa G α 12/13 subunidades que luego se unen el dominio de RGS P115RhoGEF de la represión-y exponer su DH-PH dominio, estimulando así las proteínas Rho [27]. Esto expuso DH-PH dominio puede ser más accesible para su interacción y la inactivación de Pak1, si es concomitante RAC activado. De hecho, muchos son los receptores acoplados a ambos el G 12/13 y G i vías, por lo que es posible que el mismo receptor puede activar a través de Rho G 12/13 y CCR a través de Gi, la última regulación de los temporales y espaciales de activación de Rho.

En este sentido, aunque los mecanismos subyacentes de interferencias entre la señalización de receptores celulares siendo difícil, hay una creciente literatura que describe las interacciones entre G y 12/13 G i sistemas de señalización y la necesidad de este co-regulación en la correcta ejecución de las células comportamientos como la migración celular y la extensión neurite [7]. Por ejemplo, el péptido bacteriano methionyl-formil-leucina-fenilalanina (fMLP) es un fuerte chemoattractant de neutrófilos [29]. Esta molécula se une un G i receptor acoplado, y se activa Gi-dependientes, como las vías de RAC, PI-3-cinasa, y AKT en neutrófilos y células que se asemejan a este tipo de células diferenciadas como HL-60 células [30, 31]. Sin embargo, Xu et al. recientemente han demostrado que también estimula fMLP Rho en estas células, y que la toxina pertussis no tratamiento para inhibir la activación de este Rho, mientras que el cierre total de señalización a rac [7]. De este modo, el receptor fMLP se suma a las dos y 12/13 G G i en células HL60. Estos hallazgos conducen a un modelo en el que un solo receptor utiliza la doble G i G 12/13 y acoplamiento a crear una polarización de células que migran. Diafonía entre G y 12/13 G i también puede ocurrir cuando varios subtipos de receptores que presentan distintos capacidad de acoplamiento se activan por su ligando, como los de lysophosphatidic ácido (LPA) y sphingosine-1-fosfato (S1P), que son preferentemente junto a G i, G 12 / G 13 y G i, o G q [32], y puede ser activado también indirectamente por otros receptores de la superficie celular, como los receptores tirosina quinasas [33, 34]. Estos ejemplos de G 12/13 y G i co-regulación de la misma celda comportamiento de relieve la necesidad de estas dos vías para modular mutuamente, y Pak1/P115RhoGEF compleja formación puede proporcionar ese vínculo.

Conclusión

La conclusión de que el RAC regula la asociación de Pak1 con RhoGEF-P115 puede representar un potencial mecanismo de la cooperación transfronteriza, hablar entre Rho GTPasas, en la que el efector de un Rho GTPase regula la función del FMAM para otro pequeño GTP de la proteína de unión. De hecho, este parece ser un tema emergente en biología celular, documentada por estudios recientes que demuestran la remoción de la represión de p190RhoGAP por un ROS mediada por mecanismos estimulada por la persistente y prolongada expresión activa de CCR, la regulación negativa de RAC mediada por ROS formación de Cdc42, la interacción entre Pak4 y PDZ-RhoGEF, y la interacción entre Pak1 y el FMAM-H1 y NET1 [16, 22, 24, 25, 35]. Teniendo en cuenta la importancia de la adecuada coordinación de Rho GTPase función clave para el desarrollo de muchos procesos fisiológicos y [4], podemos esperar que el pleno esclarecimiento de los mecanismos que sustentan la coordinación de activación / inactivación de Rho GTPasas puede en última instancia ayudar a explicar la forma en que la actividad de dysregulated Rho de proteínas puede contribuir a enfermedades humanas.

Métodos
Materiales

Albúmina sérica bovina (ácidos grasos libres) Dulbecco modificada a medio Eagle (DMEM), la tripsina / EDTA solución, y suero fetal bovino (SFB) fueron adquiridos a Sigma (St. Louis, Mo); anti-ratón-HRP secundaria de anticuerpos fue vinculado ICN de los productos farmacéuticos (Aurora, Ohio) y Glutatión-sepharose bolas se compraron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Anti-GFP, AU5, y AU1 anticuerpos fueron adquiridos de Covance (Princeton, NJ). El Anti-Rac1 anticuerpo se compró BD Transducción de Laboratorios (Franklin Lakes, NJ).

Construcciones de ADN

pCMV6M-Pak1 fue amablemente proporcionada por J. Field [36]. pCEFL-AU1-P115RhoGEF y supresión se construye subcloned tal como está descrita anteriormente [28]. El RAC Q61L, G12V RAC, RAC G12V, Y40C mutantes se generaron utilizando PCR basada en la mutagénesis (Stratagene, La Jolla, CA) y subcloned en pCEFL-AU5. El RAC V12 Δ ins mutante se construyó mediante la supresión de 124-135 aminoácidos que forman la región de insertar RAC mediante el uso de una superposición primer enfoque de extensión [37]. El dominio inhibitorio Pak1 codificación aminoácidos 67-147 de Pak1 fue amplificado por PCR y subcloned en pCEFL-GFP. El P115RhoGEF DH-PH secuencia de codificación de aminoácidos 351-771 ha sido trasladada BglII / Noti fragmentos en pGEX-4T3 generar el pGEX-P115RhoGEF DH-PH clon que se expresó en E. coli.

Inmunohistoquímica

Porcino las vías respiratorias endotelial (PAE), las células fueron cultivadas en 6 y placas en cubreobjetos y co-transfectadas con pCEFL-EGFP y pCEFL-AU5-RAC construcciones. Las células fueron suero de hambre durante 16 horas y luego estimulada con la trombina (5 U / ml) (Sigma-Aldrich, Inc, St Louis, MO), lavados dos veces con tampón fosfato salino (PBS), fijado con el 3,7% paraformaldehido en PBS y entonces permeabilized con PBS que contenía 0,5% Tritón X-100. Tras 30 minutos de incubación en PBS que contenía 1% de BSA, las células fueron teñidas con TRITC-phalloidin (Invitrogen sondas moleculares, Carlsbad, CA), tras las instrucciones del fabricante. Cubreobjetos fueron montados utilizando Vectashield medio de montaje para fluorescencia (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y visualizado mediante microscopio Axioplan2 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc, Thornwood, NY). GFP y TRITC fluorescencia se detectó el uso de tecnología Chroma (Rockingham, VT) y filtro establece 41002B y 41001, respectivamente.

Transfección, Immunoprecipitations y el Western Blot

De embriones humanos riñón 293T (HEK293T) las células se han mantenido en Dulbecco modificada de Eagle el medio suplementado con 10% suero bovino fetal. Porcino las vías respiratorias endotelial (PAE), las células fueron cultivadas en medios de comunicación F12 que contiene 10% de suero fetal bovino. Transfections se realizaron en 60 mm o de 100 mm de cultivo celular platos utilizando LipofectAMINE reactivo Plus ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El importe total de ADN se ajustó a 3 μ g / placa con pCEFL-EGFP cuando sea necesario. Transfección de siRNA oligonucleótidos se logró utilizando el reactivo Hyperfect ™ (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El P115RhoGEF sentido y oligonucleótidos antisentido siRNA se r (GCA CUG CGU AGA GCA ACG A) y dTdT r (UUG CCG UUC UCA GAG CUG C) dTdG, respectivamente. Sentido y antisentido control negativo siRNA oligonucleótidos se r (UUC UCC GAA CGU GUC ACG U) dT dT y r (ACG UGA CAC GUU CGG AGA A) dT dT, respectivamente. Immunoprecipitations y el Western Blot se realizaron tal como está descrita anteriormente [38].

Rho-menú desplegable ensayos

Citosólica se prepararon extractos de células HEK293T transfectadas con el vector de expresión o plásmidos. Rho-menú desplegable ensayos utilizando un GST-Rhotekin proteína de fusión se realizaron esencialmente como se informó anteriormente [39].

Los ensayos quinasa

Pak1 autophosphorylating, PAM y fosforilantes P115RhoGEF DH-PH fosforilantes quinasa se evaluó la actividad in vitro, en esencia, tal como se describe anteriormente para la señal extracelular-quinasa regulada ensayos con otra quinasa de amortiguación (12,5 mM MOPS, pH 7,5, 1 mM beta-glicerofosfato, 10 mM MgCl 2, 3 mM MnCl 2, 0,5 mM NaF, 0,5 mM orto-vanadato, 0,5 mM EGTA, 3 mm de TDT, 20 μ M ATP, 250 μ Ci / ml ATP γ P 32) [40].

Ensayos de intercambio de nucleótidos

Rho GTP intercambio reacciones para medir la actividad catalítica de la P115RhoGEF DH-PH se realizaron a 1 × quinasa de amortiguación complementado con GTP S γ recombinante y Su-Rho (12,5 mM MOPS, pH 7,5, 1 mM beta-glicerofosfato, 10 mM MgCl 2, 3 mM MnCl 2, 0,5 mM NaF, 0,5 mM orto-vanadato, 0,5 mM EGTA, 3 mm de TDT, 20 μ M ATP, 4 μ M GTP γ S, 2 μ Ci / ml GTP γ 35 S 1 μ M-Su Rho) en un volumen final de 70 μ l . En t = 0 1 1 μ M de GST-P115RhoGEF DH-PH + / - 0.5-3 μ M-GST Pak1 fue agregado a experimental y tubos de muestras se trasladaron a 30 ° C baño de agua. Después de cada punto de tiempo, 10 μ l de cada reacción se añadió a 2 ml de solución de lavado en frío (100 mM Tris, pH 7,5, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM DTT, 1 mg / ml BSA). Cada muestra fue filtrada al vacío más de nitrocelulosa y enjuagarse × 4 con 2 ml de solución de lavado. Los filtros se colocaron en 20 ml scintillation líquido (Cytoscint, ICN) y 35 S actividad se determinó en un Beckman LSC 6000C Scintillation contador.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, NIDCR.