Journal of Burns and Wounds, 2006; 5: (más artículos en esta revista)

La modulación del sistema del complemento Humanos de β-Defensin 2

Abrir las ciencias Company, LLC
Satyanarayan Bhat [a], Yau-Song Hau [a], Carl Abogado [a], Stephen M. Milner [a]
[a] El Instituto de Cirugía Plástica y Reparadora, en el sur de Illinois University School of Medicine, Springfield, IL
[b] Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD

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Resumen

Objetivo: Human β-defensin (HBD) y el sistema del complemento son dos importantes mecanismos de inmunidad innata activa contra una amplia gama de quemar la herida y agentes patógenos. Sin embargo, excesivo o no la activación del complemento, a raíz de lesiones térmicas, contribuye al daño tisular. Estudios anteriores de nuestro laboratorio sugiere una disminución de expresión de HBD-2 a quemar las heridas y su falta de grabación en blister líquido. Estudios anteriores han demostrado que los neutrófilos humanos péptido puede obligar al componente C1q del sistema del complemento y prevenir la activación del complemento. El objetivo de este estudio fue determinar si HBD-1 y HBD-2 también puede obligar al componente C1q y modulan la actividad del complemento. Métodos: La unión de eficiencia HBD-1 y HBD-2 para el componente C1q se determinó mediante la utilización de punto blot hibridación. El efecto de HBD-2 en la activación del sistema del complemento de las clásicas vías alternativas y se determinó de CH50 y AP50 ensayos. Además, la capacidad de HBD-1 y HBD-2 para inhibir la actividad de C1q se predijo de una comparación con la conocida C1q inhibidor del péptido 2J en un ordenador DNAStar modelado estudio. Resultados: C1q vinculante para HBD-2 era fuerte, mientras que la unión a C1q HBD-1 es débil. HBD-2 inhibe la vía clásica, sin afectar significativamente la vía alterna. Además, un equipo de modelado estudio también reveló homología estructural de HBD-2 conocidos con C1q inhibidor secuencias de HBD-2. Conclusión: HBD-2 inhibe la vía clásica. La sustitución de los desaparecidos defensin, un inhibidor natural del sistema del complemento, pueden tener una doble función protectora, no sólo como un agente antimicrobiano, sino también a proporcionar protección contra la activación incontrolada del sistema del complemento.

Grabar herida sepsis es un común ya menudo mortal secuela en los pacientes que sufren de lesiones térmicas importantes. 1 Muy quemado la piel deja de desempeñar su función protectora natural y se rinde a sí mismo como un nido y portal para la invasión bacteriana. Fracaso multiorgánico síndrome sigue siendo un problema en pacientes con quemaduras extensas de profundidad. La activación de una cascada proinflamatoria después de lesión por quemaduras parece ser importante en el desarrollo posterior de la disfunción inmune, susceptibilidad a la sepsis y fallo multiorgánico. 1 - 5 La mayoría de estrategias terapéuticas dirigidas específicamente hacia la neutralización de los mediadores de la inflamación o citocinas para controlar la sepsis han fracasado en los ensayos clínicos, y el tratamiento del órgano establecido fracaso no suele ser un éxito. 2 A pesar de diversos tópicos actuales regímenes de tratamiento destinadas a eliminar la carga bacteriana en la herida quema, la sepsis sigue siendo la principal causa de muerte en unidades de grabación de todo el mundo. 1 - 3

La agresión térmica se asocia con supresión inmunológica, que incluye tanto innata y adaptativa sistema inmunológico. 4 - 6 inmunidad innata es en gran medida otorgada por el sistema del complemento, leucocitos, y recientemente caracteriza péptidos antimicrobianos, que incluyen defensinas y cathelicidins. 7 - 9 surge un problema si los mecanismos de inmunidad innata son hiperactivo, una característica observada en quemaduras 8.

Defensinas, una gran familia de amplio espectro péptidos antimicrobianos, se expresan en la superficie celular y funcionan como una barrera contra la bioquímica infección microbiana mediante la inhibición de la colonización de una amplia gama de microorganismos patógenos, incluida la herida quema los agentes patógenos. 7, 9, 10 En los seres humanos , Defensinas se clasifican en 2 familias designadas α y β sobre la base de distintivo, aunque similares, tri-disulfuro de vínculos. Seis α-defensinas, péptidos de neutrófilos humanos (PNH), la Policía Nacional-1 a la Policía Nacional Haitiana-4, human defensin 5 (HD-5), y HD-6-y 4-β-defensinas humanas β-defensinas, HBD-1 a HBD - 4-se han identificado en los seres humanos. Las defensinas también están implicados en potenciando innata y la inmunidad adaptativa; Se ha demostrado que induce la liberación de histamina por los mastocitos, 10 chemoattract neutrófilos, macrófagos, monocitos, linfocitos T y células B, así como las células dendríticas, y alterar la producción de anticuerpos. 11, 12

La activación del sistema del complemento es una importante primera línea de defensa contra la infección microbiana. 8, 13, 14 Su papel principal es el reclutamiento de células inflamatorias y el asesinato o opsonization de microorganismos. El sistema del complemento consta de más de 30 suero y las proteínas celulares. La activación del sistema se produce por 3 vías bioquímicas, la clásica, la alternativa, y la mannin vinculante lectina (MBL) (Fig 1]. La vía clásica se inicia cuando los anticuerpos se unen a antígenos en la superficie del microbio. La posterior unión de este anticuerpo al complejo C1, el primer componente del sistema del complemento, se divide en C1 subcomponentes C1q, C1r, y C1s. Liberado C1r y C1s son las proteasas que activan la cascada. El MBL vía se activa por la unión de la MBL en el suero a los polisacáridos en la superficie del microbio y la activación de MBL-serina proteasas asociadas. La vía alterna se inicia por la deposición de las generadas espontáneamente componente C3b en la superficie bacteriana. Todos los 3 pasos terminar en una vía final común, en última instancia conduce a la formación de la membrana ataque complejo que lyse microorganismos. El fragmento C3b depositado en la superficie microbiana puede servir como un opsonin para promover la fagocitosis. 9 de activación del sistema del complemento está bien controlado internamente. Su overactivation es principalmente impedido por una serie de inhibidores de origen natural, como el inhibidor de la C1, C1-INH, que inhibe la serina proteasas C1r y C1s de la vía clásica.

Se ha demostrado que los neutrófilos humanos defensinas predominantemente obligar al primer componente C1 y C1-INH, 15 lo que sugiere que la formación de complejos entre C1 y defensinas inhiben la activación del sistema del complemento y también pueden inhibir la actividad citolítica de defensinas. 15 En nuestros estudios anteriores hemos demostrado que la expresión de HBD-2 se reduce a la piel quemada y ausente en blister quemar líquido. 16 - 19 La ausencia de HBD-2 puede dar lugar a una disminución de acción antibacteriana local y la falta de inhibición de un hiperactivo sistema del complemento, lo que podría predisponer a la persona para el desarrollo de sepsis y fallo de varios órganos. La interacción entre HBD y complementar el sistema no ha sido descrito previamente. Por lo tanto, hemos estudiado la unión de HBD-1 y HBD-2 a C1q, a fin de evaluar si esta interacción afectará a la clásica y complementar las rutas alternativas. También hemos comparado la homología estructural entre HBD-2 y el conocido C1q vinculante secuencia de complementar los inhibidores de modelado utilizando la computadora.

MATERIAL Y MÉTODOS
Dot blot hibridación

De larga duración HBD-1 y HBD-2 péptidos fueron sintetizados en la Louisiana State University Medical Center, Laboratorio Core. Péptidos (20 mg / mL) se disolvieron en el 88% de ácido fórmico. Los niveles de unión de larga duración HBD-1 y HBD-2 a C1q péptidos se determinó por la hibridación dot blot. Cuatro microlitros de péptido (HBD-1, HBD-2, o albúmina sérica bovina [BSA]) diluido con muestras tris-buffer salino (TBS) para alcanzar las concentraciones requeridas se borró Trans mancha en la transferencia de membrana (0,2 μ m, Bio-Rad, Hercules, Calif). Todas las incubaciones fueron a temperatura ambiente a menos que se indique otra cosa. Las membranas se enjuagarse en 20 mL de tris-salina tamponada con Teween-20 (TBST), bloquearon con 20 mL de ~ 5% nonfat seco de leche en TBST durante 1 hora, y enjuagarse brevemente con TBST. Todas las incubaciones TBST contienen más del 1% nonfat seca la leche. La membrana se incubó con C1q humano (Quidel, San Diego, Calif, 10 μ g / ml) durante 3 horas. La membrana se lava y se incubaron con conejo antihuman anticuerpos C1q (Dako, Carpinteria, Calif) diluido 1:1000 en el 1% nonfat seco de leche en TBST. Después del lavado, la membrana se incubó con cabra antirabbit IgG, HRP (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) a una dilución de 1:500 durante 1 hora. La membrana se lavan de nuevo y la señal se detectó mediante el sistema ECL (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). La membrana se vio expuesto a CH-pantalla durante 45 minutos, y la imagen fue cuantificado usando el Fósforo Imager (SG-250, Bio-Rad, Hercules, Calif).

Complemento actividad

El CH50 y AP50 hemolítica ensayos fueron adaptadas de la publicación procedimiento de Roos et al 20 para determinar la activación del sistema del complemento por la clásica y la vía alterna, respectivamente, y para estudiar las propiedades inhibidoras de prueba de péptidos en la activación del complemento. El ensayo hemolítico CH50 y AP50 hemolítica ensayo se adquirieron kits de Investigación de Tecnologías de Avanzada (San Diego, Calif) y se utiliza según las instrucciones del fabricante instrucción.

Para los ensayos hemolítica vía clásica de la activación del complemento, ovejas glóbulos rojos se sensibilizó de conejo antisheep glóbulos rojos anti-bodycoated los eritrocitos. Para el análisis de la vía clásica actividad, una actividad hemolítica de la vía clásica componente (CH50) se realizó la prueba, en la que 1 × 10 7 eritrocitos se incubaron en presencia de suero humano normal diluido en dextrosa gelatina Veronal de amortiguación (0,5 × VBS, 0,05 % De gelatina, 167 mM de glucosa, 0,15 mM CaCl 2, 0,5 mM de MgCl 2; volumen final ~ 200 μ l). Del mismo modo, un C1q que dependen de hemólisis prueba se realizó a través de C1q agotado suero humano, diluido 1 / 75, y una limitación de cantidad de C1q purificado. Para el análisis de la vía alterna la actividad, una actividad hemolítica del complemento vía alternativa (AP50) ensayo se realizó, en la que 1 × 10 7 eritrocitos de conejo fueron incubadas con suero humano diluido en dextrosa gelatina Veronal una solución tampón que contiene 10 mM MgEGTA. En todos estos ensayos, HBD-2 fue puesto a prueba por una premezcla las concentraciones adecuadas de HBD-2 se complementan con la fuente antes de la adición de la mezcla a los eritrocitos, seguida de 60 minutos de incubación a 37 ° C. Tras la adición de 1,5 mL de tampón fosfato salino (PBS) y centrifugado, hemólisis se evaluó midiendo la densidad óptica (DO) a 414 nm. La actividad lítico de la condición x se expresa en valores Z: Z =-ln (1 - [OD 414 (x) - OD 414 (0%) / (OD 414 (100%) - OD 414 (0 %))]} , En la que OD 414 (0%) representa la incubación de los eritrocitos con amortiguación. OD 414 (100%) se evaluó tras la adición de H 2 O. El importe del complemento añadido se elige de modo tal que el valor Z en la ausencia de inhibidores es de entre 0,5 y 1,5. En general, el suero fue diluido 1 / 200 para un ensayo de CH50 y 1 / 10 para un ensayo AP50. Los resultados se expresan como relativa actividad hemolítica y se calculará como la relación entre la Z en valor la presencia del inhibidor y el valor Z en ausencia del inhibidor. En algunos experimentos, el porcentaje de lisis se determinó en relación con un reactivo en blanco y el 100% de lisis, expresada en unidades / mL (Z) y se convirtió al porcentaje de inhibición.

La comparación de homología de secuencia

Comparación de la hélice alfa de visualización de consenso secuencia del péptido 2J entre 21 y HBD-2 y su superposición se llevaron a cabo utilizando láser Gene software (DNAStar, www.dnastar.com ).

El análisis estadístico

Todos los datos se expresan como la media ± SEM de al menos experimentos separados, salvo indicación en la figura de leyenda. El análisis estadístico se realizó mediante 2 de cola de prueba t de Student para muestras unpaired con la desigualdad de las diferencias. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P <.05.

RESULTADOS
HBD-2 se une fuertemente a C1q que HBD-1 se une mal

Nuestros datos (Fig 2] muestran que HBD-2 se une fuertemente a C1q en un dependiente de la dosis de forma, mientras que HBD-1 se une mal. El volumen cuantificado cuenta de puntos en el fósforo de imágenes se ponen de manifiesto en el gráfico de barras en la Figura 2. HBD-2 obligado cantidades significativas de C1q, incluso en una concentración de 0,25 μ g, mientras que HBD-1 no mostró ningún detectable vinculante a esta concentración. La BSA, utilizado como control para detectar proteínas inespecíficas vinculante, no mostró ningún C1q vinculante, lo que indica que la unión de C1q a HBD-2 es específico.

HBD-2 inhibe la vía clásica se complementan sin que ello afecte a la vía alterna

El efecto de HBD-2 en clásico y vías alternativas de la activación del complemento fue estudiada mediante ensayos hemolítica. Nuestros datos (Fig. 3] muestran que vinculante de HBD-2 se acompaña de una inhibición de la vía clásica de la activación del complemento, sin afectar la vía alterna.

HBD-2 presenta homología con el conocido inhibidor de la activación de C1q

Roos y compañeros de trabajo 20 péptidos 42 seleccionados por su capacidad para inhibir la función de C1q. Estos péptidos fueron seleccionados de fagos-péptido está representada bibliotecas sobre la base de su C1q capacidad vinculante, y se constató que péptido 2J fue el más activo C1q inhibidor. Péptido 2J [CEGPFGPRHDLTFCW] inhibió la actividad hemolítica de C1q de humanos, chimpancés, monos rhesus, rata, ratón y con la misma relación dosis-respuesta. Comparación de la región homóloga ( "Consenso") [GXFGXXXDXXXC] entre HBD-2 [LP GVFGGIGDPVTC L] y péptido 2J [CEGPFGPRHDLTFCW] puede explicar la observó inhibición de C1q por tanto HBD-2 y péptido 2J. Este consenso es GXFGXXXDXXXC principalmente a un lado de una hélice alfa (Fig 4] y se encuentra en la región de HBD-2 que contiene la proteasa división sitio donde el péptido señal se elimina de los tejidos metalloprotease ( "matrilysin") para producir activa HBD - 2. De este modo, tanto péptido 2J y HBD-2 puede ser capaz de obligar a que el sitio activo de C1q (globulares cabeza) y actuar como (la proteasa) para producir inhibidores de la observó inhibición de la activación de C1q.

DISCUSIÓN

En este estudio, hemos demostrado que HBD-2 puede obligar al componente C1q del sistema del complemento y de inhibir la activación de la vía clásica. Un estudio de Van Den Berg y compañeros de trabajo ha demostrado que la unión de la Policía Nacional-1 a C1q inhibe la activación de la vía clásica como lo demuestran CH50 ensayo 22.

La activación del complemento es un aspecto muy importante inmune innato mecanismo de defensa contra los microorganismos invasores. Algunos de activación es necesaria para un eficaz aclaramiento de bacterias o sus productos, al tiempo excesivo o incontrolado de activación puede dar lugar a inflamación y daño tisular, como se ha visto con lesiones térmicas. 23 El C3a, C4a y C5a péptidos liberados durante la activación del complemento da lugar a una mayor inflamación respuestas. 24 - 26 Complemento componente C5a y complejo de ataque de membrana (MAC) han proinflamatory efectos tales como la acumulación y la estimulación de neutrófilos y puede aumentar la permeabilidad de las células endoteliales, mediada en parte por la histamina, y promover la coagulación de la inducción de expresión de factor tisular. C5a es capaz de inducir o aumentar la producción de citocinas IL-1, TNF y IL-6 por monocitos. La inhibición de la activación del complemento se considera un importante objetivo en el diseño de medicamentos y el tratamiento de la inflamación relacionados con los trastornos. 20, 21, 27 - 30 En un modelo porcino de lesiones térmicas, C1-Inh ha demostrado tener efectos beneficiosos en la fase aguda de la térmica perjuicio de la reducción de alteraciones de órganos, la mejora de la microcirculación, y en gran medida la prevención de la translocación bacteriana en el tracto gastrointestinal. 8 favorables efectos de C1-Inh administración a pacientes con quemaduras se han reportado.

La aplicación terapéutica de los inhibidores de complemento, para evitar los efectos indeseados de la activación del complemento, se encuentra actualmente en fase de desarrollo. El principal culpable de daño tisular es la vía clásica y una serie de inhibidores de esta vía han demostrado una eficacia en una serie de enfermedades tales como quemaduras y sepsis. Esto incluye el uso de C1-Inh e IgG. 8, 13 La forma soluble de receptor CR1 y Compstatin, un péptido sintético inhibidor de la C3, también se han mostrado complemento para prevenir los daños relacionados con. 29, 30

C1q es considerado uno de los principales objetivos trazados para complementar la inhibición. Recientemente, Lauvrak y compañeros de trabajo informó de las secuencias de péptidos que 42 fueron seleccionados de fagos mostrar las bibliotecas en función de su capacidad para unirse a C1q humano. 21 Estos péptidos son estudiados en detalle para su actividad anticomplemento. El péptido 2J (15 aminoácidos) mostró óptima C1q vinculante propiedades. Este péptido inhibe de C1q humanos, primates, roedores y orígenes y se propuso como un prometedor candidato para el desarrollo ulterior como un inhibidor de C1q terapéutico. 20 Uso de la computadora de modelado nos dimos cuenta de que HBD-2 cuotas de homología con el péptido 2J. Por lo tanto, postula que el HBD-2 califica como un complemento inhibidor.

En resumen, nos informe vinculante de HBD-2 para el componente C1q del sistema del complemento y su inhibición de la vía clásica. Computer modelado ha puesto de manifiesto importantes de homología entre HBD-2 y complementar conocido inhibidor del péptido 2J, la predicción de la interacción entre HBD-2 y C1q. A nuestro entender, este es el primer informe de la interacción de humanos defensinas beta y el sistema del complemento, las conclusiones que requieren un estudio detallado para estudiar la utilidad de este tipo de interacción en lesiones térmicas y la sepsis.