PPAR Research, 2006; 2006: (más artículos en esta revista)

La identificación de un gen de compartir un Promotor y un proliferador de peroxisoma-Con los elementos de reacción Acyl-CoA Oxidase Gene

Hindawi Publishing Corporation
Mst. Hasina Akter [1], Md Abdur Razzaque [2], Liu Yang [1], Toshio Fumoto [1], Kiyoto Motojima [3], Tomohiro Yamaguchi [1], Fumiko Hirose [1], Takashi Osumi [1]

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Resumen

Muchos genes de mamíferos se agrupan en los genomas y, por tanto, los genes en el mismo grupo puede ser regulado a través de un elemento normativo común. Estamos en efecto, puso de manifiesto previamente que el gen α perilipin/PEX11 par es transactivated tejido-selectiva de PPAR γ y PPAR α, respectivamente, a través de un sitio de unión común. En el presente estudio, hemos identificado un gen, llamado GSPA, vecinos canónica PPAR objetivo, acyl-CoA oxidasa (AOX) de genes. GSPA expresión es inducida por un proliferador de peroxisoma, Wy14, 643, en el hígado de tipo silvestre ratones, pero no PPAR-α nulo ratones. GSPA AOX y compartir el promotor y dos proliferador de peroxisoma-los elementos de respuesta. GSPA mRNA también se encuentra en el corazón y músculo esquelético, así como 3T3-L1 las células. GSPA codifica una proteína de 161 aminoácidos que se enriquece en 3T3-L1 las células. Incluso otros pares de genes podría ser regulado a través de secuencia de elementos comunes, y en cambio sería interesante la manera en que cada gen es regulado adecuadamente en las agrupaciones.

INTRODUCCIÓN

Análisis recientes de humanos y de otros genomas de mamíferos han puesto de manifiesto que inesperadamente un gran número de proteínas de los genes codificantes se agrupan en [1], está organizado de cabeza a cabeza, cola a la cabeza, o cola-cola. Más recientes estudios globales [2] reveló que más del 60% del genoma del ratón se transcribe en ARN, a menudo por ambas vertientes en las mismas regiones. Muchos de los productos de ARN no parece que el código de proteínas [3], y la mayor parte de esos noncoding RNAs son aún uncharacterized.

Habida cuenta de tales disposiciones agrupadas transcritas de las regiones, sería inferir que dos o más genes agrupados (o transcripcional unidades) son posiblemente común regulado por elementos cis-en número considerable de casos. Agrupadas genes con funciones relacionadas con la formada por la duplicación de genes, por ejemplo, la β-globina grupo de genes [4] y albúmina / α-fetoproteína par de genes [5], se sabe que es regulado de común potenciadores. Sin embargo, se espera que incluso funcional y estructuralmente no relacionadas genes pueden ser reguladas por un mecanismo común, simplemente porque un elemento regulador de un gen se encuentra cerca de la otra en un clúster. Nos han informado de que los genes de PEX11 α, un factor de peroxisoma la biogénesis, y perilipin, una gota de lípidos-revestimiento de proteínas, están regulados por un proliferador de peroxisoma activados por los receptores (PPAR) subtipos común a través de un elemento cis-[6]. El PEX11 α y perilipin genes están dispuestos en tándem en este orden, con la misma orientación transcripcional. Un proliferador de peroxisoma elemento de respuesta (PPRE), que sirve como un sitio de unión de PPAR / RXR heterodimer [7], se encuentra dentro de la región espaciador, el 8,4 kb abajo de la PEX11 α promotor, mientras que 1,9 kb aguas arriba del promotor perilipin . En el hígado, este PPRE confiere la acción de PPAR α, dando lugar a la inducción de PEX11 α de la ligandos de PPAR α, peroxisoma proliferadores. Por otra parte, en el tejido adiposo, el mismo se reconoce PPRE de PPAR γ, por lo que resulta en la expresión de perilipin dependientes de la adipogenesis. La regulación diferencial de estos genes es probablemente alcanzado por la expresión diferencial de los dos subtipos de PPAR en el hígado y tejido adiposo, y también por las diferencias en las posiciones y / o distancias de la PPRE en relación con los promotores. Diferencial interacciones con otros factores de transcripción parecen también importantes [8]. Uno de esos factores es NF-I, que se requiere para la activación del gen perilipin de PPAR γ, pero no para que de PEX11 α gen de PPAR α.

Para examinar la generalidad de tales mecanismos de regulación común para agrupan los genes, se realizaron búsquedas en las bases de datos de EST ratón para que comiencen las transcripciones de las posiciones cerca de los conocidos promotores de los genes PPAR objetivo. Presentamos aquí la identificación de un gen que es transcrito por el contrario la orientación de la promotora de acyl-CoA oxidasa (AOX) de genes, un objetivo canónica de PPAR α. Este gen también comparte el objetivo PPAR α sitios con el gen AOX.

MATERIAL Y MÉTODOS
Construcción de plásmidos reportero

En primer lugar, en busca de un gen que está asignada cerca de PPAR objetivo establecido genes en el genoma del ratón. El uso de NCBI Mouse de Recursos Genómicos, hemos encontrado un gen, llamado GSPA en este trabajo, que está situado justo arriba del gen AOX en la orientación opuesta (ver "resultados"). Para la construcción de plásmidos reportero, que proceda de ADN amplificado por PCR fragmentos de un ratón clon BAC, RP23-174D24. Por GSPA, fragmento que abarca posiciones -161 a través de 483 (posición de los números, ver la Figura 1 (b)], que contenía el promotor basal, el exón 1, y la primera parte del intrón 1, fue amplificado con los primers 1F, 5'-AGGAGGTGGCGACAGAAGTG -3 'Y 1R, 5'-CAACGACAATGAACCGTCTCC-3'. Este fragmento se inserta en el sitio EcoRV de pBluescript KS (-) (Stratagene), dando plásmidos, pBSfr1-1 y pBSfr1-2. El fragmento se inserta en orientaciones opuestas en estos plásmidos, el sitio HindIII multicloning de la región en la corriente arriba y corriente abajo las partes en relación con la inserción, respectivamente. Otro fragmento genómico, que abarca desde la posición 340 pb aguas arriba del intrón 1/exon 2 frontera a la 39 ª posición del exón 2 de GSPA, fue amplificado utilizando un par de primers 2F, 5'-ACCTCTGCAGGCCCATGCTG-3 'y 2R, 5'-ACCAGGATCCAAATCGTTGGC -3 '. Este fragmento se inserta en el sitio EcoRV de pBluescript SK-(-), dando pBSfr2, en el que el sitio HindIII del vector se encuentra en el lado ascendente. El inserto de pBSfr1-2 fue exfoliados con HindIII y SalI, y se incluirán entre los HindIII SalI y sitios de pBSfr2. El plásmido resultante, pBSfr1 / 2, contiene secuencias GSPA basal para el promotor, el exón 1, partes del intrón 1, uno de los cuales contienen las dos putativo PPREs, y una parte del exón 2 antes de la iniciación putativo codón. Un tramo de 5133 bp en la porción media del intrón 1 fue retirado, para reducir el tamaño del plásmido. Se esperaba que transactivation de PPAR α se observó incluso con esta parcialmente suprimido construir, si la supuesta PPREs tiene suficientes funciones como en la rata AOX gen. pBSfr1 / 2 fue exfoliados con APAI, romo-terminó con Klenow fragmento y, a continuación, exfoliados con BamHI. El GSPA derivados de la secuencia se aisló y se incluirán entre los SmaI y BglII sitios de un promotor-menos luciferase reportero vector, pGVB Δ, en la que el SV40 T pequeño intrón fue eliminado de pGVB (Toyo Ink) para prevenir aberrante empalme [9]. El producto final, pGSPAluc, se utilizó para el reportero de ensayo para controlar la activación de PPAR α. Para la construcción de AOX el reportero, la inserción del pBSfr1-1 se exfoliados con SmaI y HindIII, y se incluirán entre los SmaI y HindIII sitios de pGVB Δ, dando pMmAOXluc, cuando la marca "mm" se asigna para la construcción de una discriminación de la rata AOX reporteros ya descritos [10]. En esta construcción, los derivados del genoma secuencia se insertó en el vector, en la misma orientación que la de AOX, es decir, inversa a la de GSPA. Un plásmido reportero truncado, pMmAOXBluc, fue construido por la supresión de la región entre las posiciones 21 y 483 de pMmAOXluc, la explotación de un interior KpnI sitio (véase la figura 1 (b)]. pMmAOXBluc carecían de ambos putativo PPREs, manteniendo a la vez la secuencia correspondiente a la rata mínima promotor AOX [11].

Sitio de mutagénesis dirigida

Mutant reportero construye en que el putativo PPREs, PPRE-1, PPRE-2, o ambos, fueron destruidos fueron creados por la PCR basada en la superposición de extensión método [12]. Los siguientes oligonucleótidos llevando base sustituciones en el PPRE-1 o PPRE-2 parte se utilizaron: mutPPRE-1F, 5'-AAAGGGTAAC ctcgagAAGGTTA CGT-3 '; mutPPRE-1R, TAACCTTctcgag GTTACCCTTT ACG-3'; mutPPRE-2F, 5 ' - AAAGCA AGGTAAAAGcgat AGGGAC-3 ', y mutPPRE-2R, 5'-GTCCCT atcgCTTTTACCTT GCTTT-3', donde destaca indican las secuencias correspondientes a PPREs, las pequeñas letras que representan a las bases mutado. Otros dos primers diseñados de tal manera para que coincida con el vector de secuencias fuera de las inserciones también se utilizaron: pGVB uni-, 5'-TGTATCTTATGGTACTGTAACTG-3 ', situado aguas arriba del polylinker región; Luc-rev, 5'-ATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3', situado justo abajo del codón luciferase inicio en la dirección antisentido. Por PPRE-1 mutación en el GSPA reportero, la primera PCR se realizó a través de pares de primers, pGVB-uni/mutPPRE-1R y mutPPRE-1F/Luc-rev, que emplean a pGSPAluc como una plantilla. Los productos de PCR fueron mixtos desnaturalizados, reannealed, y sometido a la segunda ronda de PCR, utilizando un par de primers, pGVB-uni/Luc-rev. El producto fue digerido con PstI, y se utiliza para sustituir a las correspondientes PstI / PstI región de pGSPAluc, dando la PPRE-1 mutante construir, pGSPA (mutPPRE-1) Luc. Por PPRE-1 mutación en los AOX reportero, oligonucleótido pares pGVB-uni/mutPPRE-1F y mutPPRE-1R/Luc-rev fueron utilizados como cebos, y pMmAOXluc como una plantilla, en la primera ronda de PCR. La segunda PCR se realizó como se indica más arriba, y el producto se utiliza para sustituir al SmaI / HindIII pMmAOXluc de la región, dando pMmAOX (mutPPRE-1) Luc. El PPRE-2 mutantes, pGSPA (mutPPRE-2) y luc-pMmAOX (mutPPRE-2) luc, fueron construidas por procedimientos similares al anterior, salvo para el uso de mutPPRE-2F y mutPPRE-2R primers en lugar de mutPPRE-1F y mutPPRE - 1R, respectivamente. La doble mutación construcciones, pGSPA (mutPPRE1 / 2) y luc pMmAOX (mutPPRE1 / 2) luc, fueron creados por mutación PPRE-2 de pGSPA (mutPPRE-1) y luc-pMmAOXluc (mutPPRE-1) Luc. Todos los procedimientos de PCR se realizaron con KOD-plus ADN polimerasa (Toyobo), y la presencia de mutaciones deseado y la ausencia de mutaciones inesperadas fueron confirmadas por secuenciación del ADN.

Reportero ensayos

Células HeLa fueron cultivadas en 12 pozos de placas y transfectadas con el ADN por un método de fosfato de calcio. Para cada bien, transfección se realizó utilizando el plásmido mezclas compuestas de 0,8 μ g de un reportero plásmido, 0,1 μ g de PPAR α un vector de expresión, pNCMVPPAR α, según sea necesario, y 0,2 μ g de pCMV β como un control interno. Monto total de ADN se mantuvo en el 1,5 μ g / bien mediante la adición de la cantidad adecuada de un vector vacío, pCMX. Otras condiciones experimentales fueron tal y como se describe anteriormente [6].

Transcripción reversa (RT)-PCR

Expresión de GSPA en los tejidos de tipo silvestre y PPAR-α nulo ratones se estimó mediante RT-PCR. Los animales fueron alimentados ad libitum con un laboratorio chow contienen o no contienen un proliferador de peroxisoma, Wy14, 643. RNA de indiferenciado y diferenciado 3T3-L1 las células fueron también analizados. Los siguientes se utilizaron cebadores: GSPA-F, 5'-GAAGCACACTGCGAACATTTG-3 ', y GSPA-R, 5'-TGTCACTGGGAATCGATTGAG-3'. Otras condiciones experimentales y primer secuencias fueron tal y como se describe anteriormente [13].

Western Blot

Expresión de la proteína GSPA (GSPAp) en los tejidos de ratón así como 3T3-L1 preadipocytes adipocitos y se calcula a través de Western Blot. Un anticuerpo a GSPAp se planteó en conejos, utilizando glutatión S-transferasa (GST)-fundido GSPAp expresado en Escherichia coli. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE utilizando un 13% en gel de poliacrilamida. Otros procedimientos experimentales, tal como se describe anteriormente [13].

Electroforesis en gel de cambio-la movilidad de ensayo (EMSA)

A 32-P-doble etiquetado hundidos que contienen ADN de la rata AOX PPRE-1 se utiliza como una sonda, tal como se describe en [10]. Los oligonucleótidos que abarque ratón AOX / GSPA PPRE-1, PPRE-2, mutante y sus versiones fueron utilizados como competidores. Se compone de las siguientes secuencias y los respectivos complementos: PPRE-1, 5'-AAAGGGTAAC AGGACAAAGGTTA CGT-3 '; mutPPRE-1, 5'-AAAGGGTAAC ctcgagAAGGTTA CGT-3 '; PPRE-2, 5'-AAAGCA AGGTAAAAGGTCA AGGGAC -3 ', Y mutPPRE-2, 5'-AAAGCA AGGTAAAAGcgat AGGGAC-3'. Los ensayos se llevaron a cabo tal y como se describe en [10], utilizando una proteína de unión maltosa (MBP) fundido PPAR-α y GST fundido RXR-α.

RESULTADOS
Identificación in silico de un gen en común con el promotor el gen AOX

Se realizaron búsquedas de un gen que se encuentra cerca de un conocido objetivo gen PPAR en el NCBI mapa del genoma del ratón. Varios EST clones derivados de la misma transcripción (por ejemplo, AK009156 (Riken 2310004N24)) resultaron ser mapeado en la región aguas arriba de AOX gen (Acox1; GI: 66793428) (Figura 1 (a)], en el cromosoma 11 del ratón. El gen correspondiente a Riken 2310004N24 y los AOX gen parecen compartir el promotor, al ser transcritas en las orientaciones opuestas. Por lo tanto, llamado el gen correspondiente a Riken 2310004N24, GSPA (g ene s Haring a p romoter con la A OX gen). GSPA está constituido por cuatro exones, de 17, 268 bp. Una vez más estrecha de inspección de la región promotora, la primera de exones GSPA y AOX se superponen entre sí (Figura 1 (b)], de acuerdo con la RefSeq mRNA de AOX (NM 015.729,2). Sin embargo, una gran mayoría de ratón AOX EST clones comenzará a las posiciones más abajo (por ejemplo, AK054446.1; Figura 1 (b)] y, por lo tanto, con respecto a las principales AOX sitio web inicial, el GSPA y AOX genes están dispuestos cabeza - a cabeza, separadas por un pequeño espacio. Las secuencias de nucleótidos de la GSPA / AOX promotor regiones están bien conservadas entre ratón y rata (cromosoma 10). El principal sitio de inicio de transcripción de la rata AOX gen ha sido mapeado más abajo en comparación con la del gen del ratón AOX, con varios sitios de iniciación menor posicionada más arriba [14], cerca de los principales sitios de inicio de AOX gen del ratón. GSPA tiene un ORF a partir de la primera terna de ATG situado en el exón 2, la codificación de una hipotética proteína de 161 aminoácidos residuos (BAB26112; Figura 1 (c)], que es el más largo ORF previsible de la secuencia de cDNA.

GSPA es un objetivo del gen PPAR α

El PPRE de AOX gen de rata que es mejor caracterizado, entre otros, se encuentran 560 a 572 nucleótidos río arriba de la tapa principal del sitio, lo que corresponde a PPRE-1 en la Figura 1 (b] [11, 15]. Este elemento se conserva en el genoma del ratón, con una desviación de nucleótido único. Estos elementos de la rata y el ratón tienen uno y dos desajustes en comparación con la secuencia consenso PPRE (AGGTCA N AGGTCA) [7], respectivamente. En el genoma del ratón, otro PPRE-como secuencia, PPRE-2, se encontró en las posiciones 161 a 173 nucleótidos antes de comenzar la AK054446.1 sitio. Este elemento se conserva en la rata con una sola base de la misma, y la desviación de la PPRE consenso es una secuencia para el ratón y dos para la rata, respectivamente. Aunque PPRE-1 está situado en el primer intrón con respecto a GSPA, PPRE-2 abarca la 1/intron exón 1 cruce de GSPA. Estudios anteriores establecieron que la rata AOX gen está regulado por el PPAR α a través de la PPRE-1 [10, 11, 15], mientras que el papel de PPRE-2 no se indique lo contrario. Debido a que el ratón AOX gen también está regulada por PPAR α, PPRE-1 y / o PPRE-2 era probable que servirá como PPREs funcional, y también se espera que GSPA también está regulada por el mismo mecanismo a través del mismo PPRE (s) .

Para examinar esta posibilidad, se estudió la inducción de la expresión GSPA por un proliferador de peroxisoma, Wy14, 643, en comparación con la de AOX. Hígado RNA fue preparado a partir de la de tipo salvaje y PPAR-α ratones knockout, alimentados con o sin Wy14, 643, y analizó el contenido de la expresión génica mediante RT-PCR (Figura 2]. En la de tipo salvaje ratones, GSPA fue notablemente inducido por la droga, mientras que en el PPAR-α nulo ratones, no se observó inducción. Por AOX, PPAR-α depende de la inducción Wy14, 643 se confirmó que se informó anteriormente [6, 16]. Por lo tanto, GSPA es un objetivo de buena fe de PPAR α.

Ambos PPRE-1 y PPRE-2 están implicadas en la regulación transcripcional de GSPA y AOX

Para evaluar las funciones de estos putativo PPREs, hemos realizado ensayos de gen reportero con respecto a ambos AOX GSPA transcripcional y orientaciones. Por AOX, una región que contiene aguas arriba, tanto PPRE-1 y PPRE-2, así como la región basal del promotor (posiciones de nucleótidos -161 a 483 en la Figura 1 (b)] se colocó arriba de la luciferase reportero gen (Figura 3 (a )]. Por otra parte, para GSPA, una región que abarca el promotor basal a partir de -161, exon1, intrón 1, y la primera parte del exón 2 hasta el 8 de nucleótidos antes del inicio codón se insertó en un vector luciferase reportero. Las inserciones se orientaron a fin de que la transcripción se producirían en la misma dirección que las de los naturales y AOX GSPA, respectivamente. Mutantes se han creado en estos reportero plásmidos, en el que uno de los sitios de media se rompió para PPRE-1, PPRE-2, o ambas cosas. Por AOX, un reportero construir llevando solamente la mínima promotor (posiciones 21 a -161 en la Figura 2], pMmAOXBluc, también fue creado. En reportero ensayos con células HeLa, el reportero de expresión fue significativamente mayor de cotransfection de PPAR α un vector de expresión, que es más promovido por la adición de Wy14, 643 para ambos y AOX GSPA (Figuras 3 (b] y 3 (c)] . La activación de PPAR α se redujo significativamente por una sola mutación de una u otra PPRE-1 o PPRE-2, y aún más disminuida por el doble de mutaciones que participan PPRE-1 y PPRE-2, tanto para AOX y GSPA. El residual transactivation de PPAR α y Wy14, 643 de la doble mutante se construyen posiblemente debido a aún uncharacterized elemento (s) en la región estudiada del genoma, o crípticos PPRE (s) en el vector. Estos resultados sugieren que PPRE-1 y PPRE-2 en la función transcripcional de activación de PPAR α para los AOX y GSPA, sinérgica. Cabe señalar que la actividad luciferase de pMmAOXluc fue unas 10 veces más alto que el de pGSPAluc, los valores de la presencia de ambos PPAR α y ligando. Por lo tanto, comparte las funciones de promotor mucho más eficiente para la transcripción en la dirección de AOX que no sea la de GSPA. Este resultado fue coherente con la de RT-PCR (Figura 2], en la que GSPA requiere más ciclos de PCR en comparación con los de AOX, comparable a obtener intensidades de las señales.

PPAR α / α heterodimer RXR se une a ambos PPRE-1 y PPRE-2

Para examinar si estas putativo PPREs son reconocidos por PPAR α / RXR α heterodimer, hemos realizado EMSA, utilizando proteínas de fusión MBP PPAR-α y GST RXR-α. Rat AOX PPRE fue utilizado como una sonda, y el tipo silvestre, así como mutantes PPRE-1 y PPRE-2 se les realizó pruebas de la capacidad de competir con la sonda de carácter vinculante. Bajo las condiciones experimentales, PPAR α por sí solo no exhiben una banda con la sonda, aunque RXR α hizo, probablemente, en representación de homodimeric vinculante (Figura 4, carril 3). Además Mixta de PPAR y RXR α α dado otra banda correspondiente a la heterodimer (carril 4). Esta banda se compitió de manera eficiente sin etiqueta de la sonda en sí, PPRE-1, y PPRE-2 (carriles 5, 6 y 8), pero no por la secuencia mutante de PPRE-1 o PPRE-2 (carriles 7 y 9). De este modo, tanto PPRE-1 y PPRE-2 sirvió como eficaz PPAR α / RXR α sitios de unión in vitro.

Expresión de GSPA transcripción y el producto proteico

PPAR α es también abundantemente expresado en tejidos de ratón que no sea el hígado, por ejemplo, el corazón [15]. Además, el tejido adiposo es un importante sitio de PPAR γ acción. En consecuencia, hemos examinado la expresión de GSPA ratón en el corazón y músculo esquelético, así como 3T3-L1 preadipocytes y adipocitos, en comparación con expresión AOX (Figura 5 (a)]. Por RT-PCR, los AOX transcripción resultó ser inducida por Wy14, 643 en el corazón y músculo esquelético como en el hígado, siendo consistentes con un resultado anterior [13]. En 3T3-L1, AOX RNA aumentó significativamente a la diferenciación. GSPA La transcripción también se encontró en todos estos tejidos y células, con niveles comparables ya que en el hígado. Doble inducción de GSPA ARN de Wy14, 643 en el corazón y músculo esquelético fue menor que en el hígado, debido a una mayor expresión basal en el corazón y músculo esquelético. Similares niveles de mRNA GSPA se detectaron diferenciados e indiferenciados 3T3-L1 las células. De este modo, la expresión basal de AOX y GSPA parece ser regulados diferencialmente en diferentes tejidos y células, aunque dirigida por el promotor común.

A continuación examinó si GSPA codifica una proteína. Con este fin, hemos planteado un anticuerpo para predecir GSPA producto proteico (GSPAp), utilizando un GST-GSPAp proteína de fusión expresada en E. coli como un antígeno. El antisuero reconocido GSPAp efectivamente, a juzgar por la reacción con la de proteínas de fusión con GST GSPAp y las buenas prácticas agrarias (datos no presentados). Presencia de GSPAp fue examinado por Western Blot, para las muestras de proteínas desde el corazón y el hígado de ratones alimentados con o sin Wy14, 643, así como 3T3-L1 preadipocytes y adipocitos. El anticuerpo reconoce una banda extra para el extracto de células HeLa transfectadas con un vector de expresión GSPA en comparación con la del control de las células (Figura 5 (b); carriles 1 y 2). Hemos juzgado esta banda que se representa a GSPAp, aunque la estimación de tamaño (27 kDa) de la banda fue aparentemente mayor que el calculado masa molecular de GSPAp (18,1 kDa). Una banda se detectó por 3T3-L1 muestras en la misma posición con la de GSPAp, a niveles similares a los adipocitos y preadipocytes, en consonancia con el resultado de RT-PCR. Una gran parte débil banda del mismo tamaño también se observó para el corazón y el hígado muestras, al parecer, está inducida por Wy14, 643. Por otro lado, una banda no se detectó de músculo esquelético (datos no presentados). Así pues, en efecto, GSPA codifica una proteína producto, pero el contenido de la proteína es muy variable entre los tipos de células, a pesar de los niveles de mRNA comparables.

DISCUSIÓN

En el presente trabajo, hemos identificado un gen del ratón, GSPA, como nuevo objetivo de PPAR α en el genoma del ratón. GSPA está situado en las inmediaciones de la AOX de genes, transcritos en la orientación opuesta a esta última. El sitio web inicial transcripcional de GSPA está separado por menos de 70 nucleótidos de la predominante sitio web inicial de AOX, o las transcripciones de estos genes, incluso se solapan, por lo que respecta a los menores AOX transcripción. Por lo tanto, estos genes están impulsadas por un promotor, que es rica en GC, mientras que carecen de un TATA-box. Se ha señalado que esa TATA-less promotores a menudo confieren bidireccional transcripción de menos definidas inicio sitios [17, 18].

GSPA y AOX También compartimos la PPREs. Dos PPREs, PPRE-1 y PPRE-2, se encontraron en el primer intrón de GSPA, mientras que en la región aguas arriba de AOX principales transcripcional sitio web inicial. Ambos son funcionales, que actúan sinérgicamente en la transcripción de conducción de ambos GSPA y AOX. En los estudios previos a la rata AOX, sólo un elemento correspondiente a PPRE-1 se señala en el gen reportero ensayos [11]. En comparación con la secuencia ideal de los receptores nucleares vinculante de media página, AGGTCA, ratón PPRE-1 se desvió en dos posiciones, una en cada mitad de sitio, mientras que el ratón PPRE-2 en una sola posición. Por otra parte, rata PPRE-1 se desvía de un solo nucleótido del consenso, mientras que la rata PPRE-2 lleva dos desajustes en uno de los sitios de media. Estas diferencias en las secuencias de nucleótidos, probablemente debido a las diferentes funciones de estos elementos en la regulación transcripcional en las dos especies.

Este es el segundo ejemplo de PPRE (s) compartidos por dos genes. En el primer caso, el PEX11 α / perilipin par de genes, los dos genes están orientadas en la misma dirección, y cada gen es activado por PPAR α y PPAR γ, selectivamente en un pañuelo de papel de manera específica [6]. Por el contrario, en el presente caso, los dos genes están orientados a la direcciones opuestas, y ambos genes se activan de PPAR α. En vista de los recientes informes de que muchos mamíferos, los genes se agrupan en los genomas [1], y más de un 60% las regiones del genoma del ratón se transcribe [2], cualquier PPREs, así como otros sitios de regulación transcripcional puede ser por casualidad coloca cerca a más de dos genes. Por lo tanto, aún más casos de elementos reguladores compartido se encuentra en el futuro. De hecho, por ejemplo, un promotor bidireccional se ha informado recientemente de Gabp α / ATP sintasa factor 6 de acoplamiento genes [19]. Si los vecinos son los genes funcionalmente relacionadas, serían adecuadamente regulada por mecanismos similares a través de elementos comunes de reglamentación. Conexos genes, sin embargo, puede que no necesariamente tienen funciones conexas. En tales situaciones, un par de genes deben ser regulados independientemente, y, por tanto, la influencia de un determinado elemento regulador debe limitarse a un gen, mientras que los otros genes deben estar aislados adecuadamente de ella. Elementos que tengan funciones similares a las de "aisladores" o "potenciador bloqueadores", que suelen ser imaginado en función de bloqueo de largo alcance potenciador acciones [20], podrían también estar involucrados en cerca de reglamentación más interacciones.

A pesar de la secuencia en la conservación GSPA / AOX promotor región entre el ratón y rata, no está claro si en la actualidad GSPA se transcribe en ARN en la rata. Aunque gran número de secuencias de cDNA aparentemente derivado de esta región genómica se han depositado en la rata EST bases de datos, la mayoría de ellos están anotados para ser orientado frente al ratón GSPA. En humanos, por otro lado, un clon EST homólogas a GSPA se encuentra en la base de datos (BC047782). Además, otro de secuencias EST (AK097104) ha sido depositado, lo que amplía aún más que el ratón GSPA cDNAs en el 3 ', continua en el exón vecino de secuencias de genes, CDK3. Parece dudoso que este último cDNA humanos representa una transcripción fisiológicamente relevantes. Secuencia de la región promotora de los AOX es menos conservadas en comparación con el ratón y la rata de contraparte, ni PPRE-1 ni PPRE-2 se mantenga. AOX Humanos no es probable que sea inducida por la proliferación de peroxisoma [21], aunque una posible secuencia PPRE se ha observado en una región mucho antes [22].

Se encontró que GSPA se expresó ampliamente en los tejidos donde PPAR α desempeña un papel regulador, como el hígado, corazón y músculo esquelético. La dependencia de PPAR α ligando fue menos significativo en el corazón y músculo esquelético que en el hígado, debido a una mayor expresión basal. GSPA También se expresa en 3T3-L1 las células, aunque en apariencia independientes de la diferenciación. Por lo tanto, no está claro si PPAR γ participa en la regulación de GSPA expresión en estas células. Por lo tanto, GSPA es, posiblemente, incluso se expresa en otros tejidos, aunque la expresión no puede ser activado por PPARs. Por otro lado, encontramos significativa expresión de la proteína GSPA producto en 3T3-L1 adipocitos y preadipocytes. En el corazón y el hígado, la abundancia de la proteína fue mucho más bajo, a pesar de los niveles de mRNA comparables. Por lo tanto, GSPA expresión también debe ser regulada en un nivel posttranscriptional.

¿Cuál sería la función de GSPA? En el GSPAp secuencia de aminoácidos, ni una proteína conocida motivo ni un previsible-que abarca la membrana de dominio se señaló. A GFP-fundido versión de GSPAp expresado en células HeLa fueron distribuidas a lo largo de las células, sin acumular en cualquier compartimentos subcelulares (datos no presentados), sugiriendo un citosólicas naturaleza de la proteína. Enriquecimiento de GSPAp en 3T3-L1 las células de otros tejidos más parece prometedor para los estudios funcionales. Sería una interesante cuestión de si la abundante expresión de GSPAp es característico en el adipocito linaje. Otras cuestiones importantes cómo se GSPAp expresión es posttranscriptionally regulado, y si la proteína se acumula en el hígado, corazón, y otros tejidos en condiciones específicas. Cabe señalar que, por el homólogo humano cDNAs, aún más breve secuencia de la proteína de 122 aminoácidos residuos, el 62% idéntica a la secuencia del ratón, se prevé, debido a un marco codón de parada en una posición más arriba. Por lo tanto, es cuestionable si la función de GSPA se conserva en humanos. La función de GSPA debe ser cuidadosamente investigado también desde el punto evolutivo de vista.

Esta obra fue financiada en parte por subvenciones de Investigación Científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia y la 21st Century Centro de Excelencia (COE) del Programa.