Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(6): 163-172 (más artículos en esta revista)

El sevoflurano Estimula MAP quinasa de transducción de señales a través de la activación de la PKC α y β II en Fetal Rat Cerebral Cortex cultivadas de la revista Neuron

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Junio Hasegawa [1], Susumu Takekoshi [2], Hidetaka Nagata [2], R. Yoshiyuki Osamura [2], Toshiyasu Suzuki [1]
[1] Departamento de Anestesiología, Tokai University School of Medicine, Isehara, Kanagawa 259-1193, Japón
[2] Departamento de Patología, Tokai University School of Medicine, Isehara, Kanagawa 259-1193, Japón

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Resumen

Proteína kinasa C (PKC) es una enzima clave que participa en diversas funciones neuronales. PKC también ha sido identificado como una molécula objetivo para las acciones anestesia general. Raf, mitogen-activated proteína quinasa (MEK) y la señal extracelular-quinasa regulada (ERK1 / 2) han sido considerados como objetivo efectores de PKC. En el presente estudio, hemos intentado evaluar el efecto del sevoflurano en PKC / cascada de señalización MAPK cultivadas fetal en ratas neuronas de corteza cerebral, preparado a partir de embriones día 18 fetos. Los efectos de sevoflurano en la translocación, de 7 de PKC isoformas (α, β I, II, β, γ, δ, ɛ y ζ) fueron observadas por inmunotransferencia utilizando isoforma selectivo anticuerpos frente a PKCS. El tratamiento de neuronas inducida con sevoflurano la translocación de PKC α y β PKC II especies de la concentración citosólica de la membrana fracción, lo que indica la activación de estas isoformas PKC. Por el contrario, no había una clara modificación en la distribución de otras isoformas PKC. A continuación examinó si la activación específica de PKC α y β II de sevoflurano podría estimular la MAP quinasa vía de señalización en las neuronas cultivadas. Raf se aumentó la fosforilación de la administración de sevoflurano 0,25 mm. La fosforilación de proteínas Raf alcanzó un máximo a 5-10 min. Posteriormente, la fosforilación de proteínas MEK se aumentó a 10-15 minutos después de sevoflurano tratamientos. Que las proteínas de ERK se indujo a 15-60 min. Por otra parte, la fosforilación de ERK inducida por sevoflurano se redujo significativamente por el tratamiento de inhibidores de PKC (staurosporine) y el inhibidor de MEK (PD98059). Por otro lado, el contenido total de Raf, MEK y ERK proteínas eran relativamente constante en todo momento examinados. Para examinar la localización de fosforilados-ERK proteínas, tinción inmunohistoquímica de sevoflurano tratada con neuronas cultivadas se realizó. El fosforilados proteínas ERK-fueron marcadamente acumulado en el citosol de la célula y el cuerpo en la neurites células neuronales con el tiempo después de 0,25 mm sevoflurano tratos. Estos resultados demostraron que el sevoflurano inducida por la fosforilación de la MAP quinasa en cascada a través de la activación de la PKC α y β PKC II especies.

I. Introducción

La proteína quinasa C (PKC) la familia se compone de más de 11 fosfolípido dependientes de serina / treonina cinasas que tomar parte en las respuestas celulares a distintos agonistas, incluyendo hormonas, algunos factores de crecimiento y neurotransmisores [1, 2, 16, 17, 25]. PKC es abundante en el sistema nervioso central y desempeña un papel importante en la regulación de las funciones neuronales [22, 26]. Muchos estudios han demostrado que la PKC podrán participar como un blanco potencial molécula en acciones anestésico general [8, 15]. Halotano y el propofol estimular la activación de rata parcial purificado PKC en la presencia de relevantes fisiológicamente bilayer vesículas in vitro [4]. Halotano también estimula la actividad de PKC en la rata cerebrocortical synaptosomes [6]. A pesar de que estos informes sugieren que los anestésicos pueden funcionar en el cerebro a través de PKC de transducción de señales, poco se sabe acerca de las modalidades efectos de los anestésicos en PKC señalización en las células neuronales.

Múltiples discretos isoformas de PKC se han identificado. Estas isoformas muestran sutilmente diferentes enzymological propiedades, expresión diferencial de tejido, específico y localización intracelular [16, 18]. La PKC isoformas se dividen en los siguientes tres grupos de acuerdo a su sensibilidad hacia los activadores: PKCS convencionales (cPKC: α, β1, β2, γ) son dependientes de calcio, y estimulado por DAG; novela PKCS (nPKC: δ, ɛ, η, θ) son calcio-independiente, pero se diacylglycerol (DAG)-stimulatable; PKCS atípicas (aPKC: ζ, μ) requieren ni calcio ni DAG para la óptima actividad. Varios informes han demostrado que los PKCS mediar en diferentes procesos biológicos en la célula. En la activación fisiológica de cPKC isoformas de DAG, vinculante de DAG aumenta la afinidad de cPKC de Ca 2 + y phosphatidylserine, facilita cPKC translocación y vinculante para las membranas celulares, y aumenta la actividad catalítica cPKC [30]. En cultivos de músculo liso vascular células, isoflurano, un anestésico volátil, evoca la translocación de PKC ɛ, pero no PKC α del citosol a la membrana fracción [29]. Este resultado sugiere que los anestésicos activar isotipo específico de PKC vascular en células musculares lisas. Isoflurano también estimula la fosforilación de la señal extracelular regulada quinasa (ERK) en células musculares lisas [29]. ERK es un componente de la mitogen-activated proteína (MAP) quinasa vía de señalización junto con las proteínas G pequeñas como Raf y MAP quinasa quinasa (MEK). Sin embargo no está claro si isoflurano ERK inducida por fosforilación está mediada por la Raf-MEK cascada. PKC es un importante promotor de la MAP quinasa vía de señalización en el sistema nervioso central [20]. Sin embargo, aún no está claro cuál de las isoformas PKC se activan específicamente por los anestésicos volátiles en las células neuronales.

El sevoflurano es más frecuentemente usado como anestésico volátil porque tiene una baja en la sangre-gas coeficiente de partición y la más baja pungencia de los disponibles comercialmente anestésicos inhalados. A pesar de las numerosas investigaciones dirigidas a esclarecer la función sevoflurano en los últimos años, todavía hay numerosas preguntas sin respuesta en relación intercelular de transducción de señales en las células neuronales. El objetivo de este estudio fue examinar los efectos del sevoflurano sobre la PKC-MAP quinasa vía de señalización en la corteza cerebral de rata cultivadas neuronas utilizando bioquímicos y morfológicos procedimientos. Nuestros resultados indican que el tratamiento con sevoflurano dirigido específicamente a la activación de la PKC α y β II seguido por la estimulación de señalización MAP quinasa, acompañado por la fosforilación de ERK en el cuerpo celular y neurites de las neuronas.

II. Materiales y Métodos
Materiales

El sevoflurano fue adquirido de Abbott Japón (Tokio, Japón). DNasa-I (D-4527), polyethyleneimine, Poly-L-lisina (0,01% Solución); PD98059 y staurosporine de Sigma Chemical Co (St. Louis, MO); tampón fosfato salino (PBS) de Dainippon Seiyaku (Osaka, Japón); α-medio mínimo esencial (MEM-α) y suero de caballo Invitrogen Japón KK (Tokio, Japón); neurobasal medio y B27 suplemento de Tecnologías de la Vida (Gaithersburg, MD); Lab-Tek Diapositivas de la Cámara Nalgen Nunc Internacional ( Naperville, IL). Anti-Raf y de anticuerpos anti-PKC anticuerpos (α, β I, II, β, γ, θ, δ, ɛ, η, ζ, μ) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Anti-fosforilados-Raf (Raf-p), MEK, p-MEK, p-ERK y ERK anticuerpos fueron adquiridos de New England Biolabs, Inc (Beverly, MA). Lucha contra el ratón y conejo anti-anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano se compraron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Cultivo celular

La Universidad de Tokai Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comité aprobó todos los estudios con animales. Wistar embarazadas-Imamichi ratas fueron adquiridos de Imamichi Instituto de Reproducción Animal, Tsukuba, Japón. Primaria corteza cerebral de rata cultivadas neuronas se establecieron a partir del día 18 de embriones fetos. Brains fueron extirpados aséptica y tejido septal zonas fueron disecados a cabo con un par de bisturí. Disociación se hizo bajo un estereomicroscopio de acuerdo a la descripción del cerebro fetal de ratas anatomía. Después de disociación usando 10 unidades / ml papaína (Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) y 0,01% DNasa I, fragmentos de tejido se sedimentado después de la adición de unos pocos mililitros de suero de caballo. El precipitado fue resuspendido en un medio que contiene un 5% (v / v) inactivado por calor suero de caballo (HS, Gibco BRL, Grand Island, NY), el 5% (v / v) precolostrum de suero de ternera recién nacido (Centro de Nakashibetsu Suero, Mitsubishi Chemical Industria, Tokio), α-MEM que contienen 1,9 mg / ml de bicarbonato de sodio, 100 U / ml penicilina y 100 μ g / ml estreptomicina sulfato. La suspensión celular fue aprobada a través de dos tamaños diferentes de puntas de plástico. Las células fueron sembradas en polyethyleneimine recubiertos de 60 mm en placas de 10 6 células / cm 2. Revestimiento se llevó a cabo utilizando una solución de 1 mg / ml polyethyleneimine en 150 mM tampón borato sódico, pH 8,4, durante 3 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con agua destilada estéril y luego dos veces con el suero que contienen medio. Fueron cultivados en un humidificado 10% de CO 2 -90% del aire ambiente a 37 ° C, y el medio se cambió a neurobasal soporte de B-27 suplemento. El sevoflurano fue disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO). La concentración final de DMSO en cada medio fue del 0,1%. PD98059 y staurosporine se disolvió en DMSO como 10 mM y 1 mM solución madre que, cuando sea necesario, se diluye aún más para llegar a final de las concentraciones.

Determinación de la viabilidad celular

Célula de viabilidad se determinó mediante el uso de una célula Contar Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón). Al final del periodo de tratamiento, 10 μ l de 5 mM EAM-8, 0,2 mm 1-metoxi SPM, 150 mM NaCl se añadió a cada pocillo. Las placas fueron colocadas a 37 ° C durante 4 horas en la oscuridad y la absorbancia a 450 nm fue leído utilizando un Termo Max Lector de microplacas (Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Por lo general, repetir cuatro pozos se utilizará para cada grupo de la prueba. Los pozos que contienen medio, pero no sirvió como células en blanco. El sevoflurano concentraciones de 0,25 y 0,5 mM corresponden a 0.3125 y 0,625 concentración alveolar mínima (MAC), respectivamente [10]. Estas concentraciones son más bajo que el de uso clínico.

El análisis por inmunotransferencia

Las células fueron zadas en 2 ml de helado hipotónico amortiguador de lisis (10 mM HEPES buffer-NaOH a pH 7,4, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 1 μ g / ml leupeptina) de la homogeneización con un vaso / Teflon homogeneizadora con cinco arriba y hacia abajo los accidentes cerebrovasculares. El homogenado se centrifuga a 200000 g durante 15 minutos a 4 ° C para producir el sobrenadante ( "citosol") y pellet ( "membrana") fracciones, que fueron recogidos por separado. El precipitado fue resuspendido fracción y homogeneizada en 1 ml de tampón de lisis que contiene 0,5% (v / v) Nonidet P-40 y se incubaron en hielo durante 30 minutos para extraer la actividad PKC. Después de un 1 ml de amortiguador de lisis fue agregado a disminuir la concentración de detergentes, el precipitado se centrifugó a 200000 g durante 15 minutos a 4 ° C, y la fracción sobrenadante fue removido. Total de contenido en proteínas del sobrenadante y precipitado solución se determinó a través de la Bio-Rad proteína kit de ensayo. En cada experimento, las muestras fueron probados en la igualdad de las concentraciones de proteínas totales, que varió de 20 a 30 μ g. Las muestras fueron hervidas en la muestra buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, 10% 2-mercaptoetanol) y separadas por SDS-PAGE (10% geles de poliacrilamida) y, a continuación, electro-transferido a membranas de nitrocelulosa . Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con 5% de materia grasa no seca la leche, el 0,1% de Tween 20 a 0,01 M Tris-buffer salino (TBS) de 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados con 0,05% de Tween 20 a 0,01 M tampón fosfato salino (PBS-T), las membranas fueron incubadas con anticuerpos específicos contra isoformas de PKC (PKC α, β I, II, β, γ, δ, ɛ y ζ a 1:400 ) Por 1 hora a temperatura ambiente. Membranas se lavaron cinco veces con T-PBS y se incubaron con peroxidasa de rábano conjugada con anti-conejo de anticuerpos Ig 1:5000 diluido con PBS-T de 1 hora a temperatura ambiente. Después de cinco lavados con PBS-T, bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando el método de quimioluminiscencia mayor (ECLplus Amersham Biosciences). El análisis cuantitativo se realizó mediante análisis de imágenes de software (NIH Image).

Las células se raspó en 0,1 M tampón fosfato de sodio (pH 6,8) conteniendo 1% Tritón X-100, 1 mM PMSF, 1 mg / ml aprotinina y 10 mg / ml leupeptina. Cell homogeneizado se vortexed de 1 hora a 4 ° C y centrifugada a 12000 g durante 15 minutos. Cuantificación de proteínas, la separación por SDS-PAGE, immunoblotting y se realizaron como se ha descrito anteriormente utilizando anticuerpos primarios (anti-Raf, MEK, ERK1 / 2, PRAF, pMEK y pERK1 / 2, diluido 1:400) y secundaria de anticuerpos (peroxidasa de rábano - conjugada anti-Ig de ratón y conejo anti-anticuerpos Ig, 1:5000 diluido con PBS-T).

Inmunohistoquímica

Las células fueron cultivadas en Poly-L-lisina recubierto Lab-Tek Sala de Diapositivas. Las diapositivas se prefijado en el 4% de paraformaldehído, glutaraldehído al 0,05% a 0,1 M cacodylate buffer, pH 7,4, en un horno microondas durante 45 segundos a 35 ° C. Posteriormente fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, 0,03% Triton X-100 en 0,1 M cacodylate buffer, pH 7,4, a 4 ° C durante 1 hora. Después de diez lavados con PBS 0,01 M, las diapositivas fueron incubadas con anticuerpos anti-fosfato-ERK anticuerpo diluido 1:400 con el 3% BSA-PBS que contenía 0,03% Tritón-X-100 a 4 ° C por 12 hr. Después de diez lavados con PBS 0,01 M, las diapositivas fueron incubadas con anticuerpos anti-mouse IgG Alexa-488 anticuerpo diluido 1:200 con 1% BSA-PBS que contenía 0,03% Tritón-X-100 a 4 ° C por 12 hr. Después de diez lavados con PBS 0,01 M, las diapositivas se examinaron con un láser confocal de microscopía de barrido (LSM-410, Carl Zeiss, Jena, Alemania)

El análisis estadístico

Los resultados de las pruebas se expresan como un porcentaje de control como la media y SD. Las diferencias en los resultados se evaluaron para la importancia de Student's t-test. Estadística significaciones de las diferencias como se indica * P <0,01, ** p <0,001, *** P <0,0001.

III. Resultados
Efectos del sevoflurano sobre la viabilidad celular y características morfológicas de las neuronas en cultivo primario

La viabilidad de sevoflurano tratados primaria neuronas cultivadas se examinó. Células neuronales fueron tratados con 0,5 mM sevoflurano para diversas ocasiones (0, 3, 30, 60, 120 min) como se ilustra en la Figura 1 A, y 120 minutos con sevoflurano diferentes concentraciones (0, 0,25, 0,5 mM) como se ilustra en la Figura 1 B. El sevoflurano no afectó la viabilidad celular. Además, a la luz a nivel microscópico, las células parecían sanos y sin vacuolización o otras pruebas de daños (Fig. 1 C y D). Estos resultados demostraron que el sevoflurano ha citotoxicidad no detectables y no significativamente estimular las neuronas en cultivo primario.

El análisis por inmunotransferencia isoformas de PKC en el citosol y la membrana fracciones

Una de las características de PKC señalización es la translocación de la PKC de la concentración citosólica de la membrana fracción. Los efectos de sevoflurano en la translocación de isoformas PKC cultivadas fetal en ratas neuronas de corteza cerebral fueron examinados por inmunotransferencia utilizando isoforma PKC-anticuerpos específicos. PKC isoformas (α, β I, II, β, γ, δ, ɛ y ζ) fueron enriquecidos en el citosol fracción en comparación con la fracción de membrana bajo el control de las condiciones (Fig. 2]. El tratamiento con sevoflurano inducida por la translocación de PKC α y β II especies de la concentración citosólica de la membrana fracción que indica la activación de estas isoformas. Sin embargo no hubo claros cambios en la distribución de PKC β I, γ, δ, ζ ɛ o en tratados con sevoflurano células neuronales. El análisis cuantitativo isoformas de PKC en el citosol y la membrana fracciones se muestran en la Figura 3. Cuando las células neuronales fueron tratados con sevoflurano para diversas ocasiones (2,5, 5, 10, 15, 30, 60, 120 min), un aumento significativo de la cantidad relativa de PKC α y β isoformas II en la membrana y disminuye la fracción en el citosol fracción se produjo en un momento que dependen de manera (Fig. 3 A, C).

El sevoflurano aumenta la fosforilación de Raf, MEK y ERK1 / 2 en células neuronales

A continuación examinó si la activación específica de PKC α y β II sevoflurano estimulado por la MAP quinasa vía de señalización cultivadas fetal en ratas neuronas de corteza cerebral (Figs. 4 y 5]. Un aumento de fosforilación de Raf se observó en 2,5 ml de la administración de sevoflurano 0,25 mm (Fig. 5 A). Posteriormente, el nivel de proteína fosforilados MEK se aumentó a 10-15 minutos después de sevoflurano tratamiento (Fig. 5 C). Además, la fosforilación de ERK1 / 2 proteínas alcanzó un máximo en 15-90 min (Fig. 5 E). Por el contrario, el contenido total de Raf, MEK y ERK1 / 2 proteínas eran relativamente constante en todo momento examinados (Fig. 5 B, D, F). Estos datos demuestran que la activación de la cascada de MAP quinasa se produjo después de administración de sevoflurano en células neuronales.

Efectos de staurosporine y PD98059 en sevoflurano ERK inducida por fosforilación

Los inhibidores de PKC (staurosporine: 100 nm) y el inhibidor de MEK (PD98059: 20 μ M) disminuyó significativamente la fosforilación de ERK1 / 2 inducida por el tratamiento con sevoflurano (Fig. 6]. Este resultado firmemente demostrado que el sevoflurano inducida por ERK1 / 2 mediada por fosforilación de la activación de la PKC y MEK fetal en ratas corteza cerebral de neuronas cultivadas.

Inmunohistoquímica

Con el fin de examinar la localización de fosforilados-ERK1 / 2 (pERK1 / 2) de proteínas, estudios de inmunohistoquímica sevoflurano tratados con células neuronales cultivadas se realizaron. En el control de las neuronas a 0 minutos después de tratamiento con sevoflurano, la célula cuerpos fueron débilmente teñidas con anticuerpos específicos de la pERK1 / 2 proteínas (Fig. 7]. pERK1 / 2 proteínas se aumentó notablemente tanto en el cuerpo celular y la neurites después de 0,25 mm sevoflurano tratos.

IV. Discusión

Anestésicos volátiles, entre ellos halotano, isoflurano y sevoflurano, producen los efectos conductuales asociados con alteraciones de las funciones neuronales [14]. A pesar del uso generalizado de estos anestésicos, su mecanismo de acción a través de sus efectos sobre las vías de señalización intracelular sigue siendo oscuro. La PKC familia comprende la transducción de señales enzimas formados por varias isoformas que están altamente concentradas en el sistema nervioso y han estado implicados en la modulación de la transmisión sináptica neuronal [9, 19, 21]. Por otra parte, muchos estudios han implicado PKC como un blanco potencial para los efectos de anestesia general en diversos tejidos. Además, es bien documentado que PKC es un importante promotor de la MAP quinasa de señalización, lo que se considera para mediar en numerosas funciones celulares como proliferación, diferenciación y también la volatilidad inducida por la anestesia farmacológica preacondicionamiento [27]. Sin embargo, los efectos de los anestésicos volátiles en PKC y MAP quinasa de señalización, especialmente PKC moléculas que son responsables, en las células neuronales siguen sin estar claros. Los resultados de este estudio demuestran claramente que en cultivos de neuronas de la corteza cerebral de rata, un anestésico volátil, sevoflurano, inducida por la fosforilación de una serie de proteínas relacionadas con la MAP quinasa señalización, incluida la Raf, MEK y ERK1 / 2. Este sevoflurano inducida por la activación de la MAP quinasa vía fue iniciada por la isoforma-específicos de activación de PKC α y β II, que son Ca 2 + dependiente de PKC moléculas.

Fosforilación de proteínas específicas es una reacción bioquímica clave en la regulación de muchos aspectos de la función neuronal. Varias líneas de evidencia han implicado PKC mediada por fosforilación de proteínas como un objetivo para efectos de la anestesia general en el sistema nervioso central [4, 23]. In vitro bioquímicos experimentos han demostrado que los anestésicos generales afectan directamente a la actividad PKC [4, 5, 23, 28 ]. Estos estudios demostraron la capacidad de los anestésicos volátiles y anestésicos por vía intravenosa para inducir un aumento significativo en la sensibilidad del cerebro PKC purificada para su activadores endógenos phosphatidylserine, diacylglycerol, y Ca 2 + in vitro. Once isoformas de PKC se han identificado en los tejidos de mamíferos. Individual PKCS mediar diferentes procesos biológicos en la célula, y, en consecuencia, estas isoformas difieren en su distribución tisular, la distribución regional en el cerebro, localización subcelular, y la sensibilidad a varios activadores [2, 24]. Estudios anteriores utilizando isoforma selectivo anticuerpos frente a PKC α, β PKC o PKC γ demostrado que halotano, un anestésico volátil, promueve la translocación de las tres isoformas PKC convencionales de la concentración citosólica de la membrana fracción de synaptosomes [7]. Por otro lado, y Zhong Su informó de la activación de la PKC ɛ novela, pero no convencionales de PKC α de isoflurano vascular en células musculares lisas [29]. También puso de manifiesto que el isoflurano activados por ERK1 / 2 en cultivos de células musculares lisas se inicia de nuevo PKC. Por otra parte, en corazón de rata, PKC δ y PKC ɛ mediar isoflurano inducida preacondicionamiento [12]. Estos informes indican que los anestésicos volátiles activar PKC isoformas específicas en diversos tejidos bajo ciertas condiciones. En el presente estudio, uno de nuestros objetivos era identificar las isoformas PKC activada por sevoflurano en las neuronas cultivadas derivados de la corteza cerebral de rata. También se evaluó la localización intracelular de los distintos isoformas PKC antes y después del tratamiento con sevoflurano. El principal hallazgo del presente estudio fue que el sevoflurano específicamente activa PKC α y β II PKC, lo que resulta en su translocación intracelular a distintos sitios en la corteza cerebral de rata cultivadas neuronas, como lo demuestra el uso selectivo isoforma anticuerpos frente a PKC α, β PKC I, II PKC β, PKC γ, δ PKC, PKC ɛ y PKC ζ. Este resultado sugiere que la PKC α y β PKC II moléculas tienen un papel importante en la función de los anestésicos volátiles en las células neuronales. Hemmings et al. Halotano demostrado que no tenía efectos significativos sobre la PKC translocación γ, mientras que los efectos significativos de halotano se observaron en las distribuciones de PKC α y β en el citosol y la membrana [7]. Este informe sugiere que los anestésicos volátiles estimulado la translocación propio proceso, tal vez por el aumento de la afinidad de PKC activada para su receptor específico de membrana en particular las células.

Se ha informado de que los altos niveles de activación de la PKC puede causar neurodegeneración y son coherentes con la posibilidad de que las alteraciones en la señalización celular patológico contribuido a la degeneración neuronal en cultivos de neuronas corticales humanos [13]. Por otra parte, se ha informado de que δ PKC está involucrada en el óxido nítrico inducido por la muerte de las células dopaminérgicas [11]. Estos informes claramente sugiere que las alteraciones en la señalización intracelular, tales como el exceso de activación de PKCS, provocan la degeneración celular neuronal. En este estudio, se puso de manifiesto que el tratamiento de sevoflurano inducida por la activación de PKC α y β específicamente II. Sin embargo, los datos sobre viabilidad celular después de sevoflurano tratamiento más demostrado que no hay detectable citotoxicidad fetal en ratas de las neuronas cerebrales en respuesta al sevoflurano en el rango de 0.25-0.5 mm para 2 hr.

Este es el primer estudio para evaluar los efectos del sevoflurano en la cascada de MAP quinasa en la corteza cerebral de rata neuronas. La activación de PKC afecta a varios objetivos incluyendo abajo MAP quinasa cascada de proteínas. Entre la cascada de MAP quinasa, ERK1 / 2, se encontró a participar en anestésicos volátiles inducida preacondicionamiento [12]. Además, el aumento de isoflurano ERK1 / 2 fosforilación vascular cultivadas en células musculares lisas, lo que ERK1 / 2 es la señalización corriente abajo de PKC señalización [29]. La activación de MAP quinasa señalización está regulada por la fosforilación, y este proceso ha demostrado ser PKC-dependiente. En el presente estudio, se determinó la MAP quinasa señalización en sevoflurano tratados con células neuronales. Secuencial de fosforilación de las proteínas MAP quinasa, como Raf, MEK y ERK, como resultado del tratamiento con sevoflurano y la posterior activación de PKC. Por otra parte, la fosforilación de ERK inducida por sevoflurano se redujo significativamente por el tratamiento de staurosporine (inhibidor de PKC) y PD98059 (inhibidor de MEK). A partir de estos resultados, se concluye que la isoforma específica de PKC obtener Mayo activación secuencial de activación de los distintos pasos de la vía MAP cinasa. Por otra parte, este resultado sugiere también que la señalización MAP quinasa puede estar implicada en la función del anestésico en el cerebro. Para examinar la localización intracelular de activado (fosforilados)-MAP quinasa proteínas antes y después de la exposición al sevoflurano, el análisis inmunohistoquímico de fosforilados-ERK1 / 2 (pERK1 / 2) las proteínas se realizó mediante la fosforilación de anticuerpos específicos. En el cuerpo celular y neurites de las neuronas del córtex cerebral, la fosforilación de ERK1 / 2 se incrementó en un momento que dependen de manera sevoflurano después de tratamiento y regresó hacia el nivel básico en 90 min. pERK1 / 2 fue localizado en la región citosol de la célula en el cuerpo y neurites. Estos resultados demuestran claramente que el anestésico volátil sevoflurano activar la vía MAP cinasa en corteza cerebral de rata neuronas cultivadas. El anestésico volátil isoflurano reduce aguda y el retraso en la muerte de neuronas en modelos in vitro de la isquemia cerebral [3]. Este isoflurano inducida neuroprotección requiere la fosforilación de los componentes de MEK-ERK vía. Además, la activación de la PKC ɛ y ERK1 / 2 es importante para cardioprotection de anestésicos volátiles desflurano inducida preacondicionamiento. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la activación de MAP quinasa de señalización a través de PKC es crucial para anestésico volátil celular inducida por la protección.

Los autores desean dar las gracias al doctor Takayuki Tokimasa (Kurume Rehabilitación del Hospital) por su aliento y apoyo. También queremos dar las gracias al Dr Johbu Itoh por su excelente fotografía de asistencia, y el doctor Yoshiko Itoh por su experto análisis inmunohistoquímico. Esta investigación ha sido financiada en parte por subvenciones de Investigación Científica del Ministerio de Educación, Ciencia, Cultura y Deportes, del Ministerio de Salud y Bienestar de Japón, y de la Tokai University School of Medicine, del Proyecto de Investigación ( Takekoshi a S).