Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(6): 155-161 (más artículos en esta revista)

Apical Localización de sodio-dependiente de glucosa SGLT1 Transporter es mantenido por el colesterol y microtúbulos

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Takeshi Suzuki [1], Toshiyuki MATSUZAKI [1], Haruo Hagiwara [1], Takeo Aoki [1], Yukiko Tajika-Takahashi [1], Kuniaki Takata [1]
[1] Departamento de Anatomía y Biología Celular, Universidad de Gunma Graduate School of Medicine, Maebashi, Gunma 371-8511, Japón

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Resumen

A las buenas prácticas agrarias con etiqueta de sodio dependiente de glucosa SGLT1 transportista (SGLT-GFP) fue transfectadas en células MDCK. SGLT-GFP fue localizada en la membrana apical de las células confluentes. Cuando el colesterol celular fue agotado por metil-β-ciclodextrina (M β CD) el tratamiento, la localización de SGLT-GFP poco a poco pasado de apical a toda la membrana plasmática. Time-lapse microscopio reveló que el efecto de M β CD apareció dentro de los 30 min, y que la transición de SGLT-GFP a toda la membrana plasmática se completó dentro de 2 horas después de la administración. Microscopía de inmunofluorescencia reveló que el apretado nudo marco se mantuvo constante durante este proceso. El efecto de M β SGLT en CD-GFP localización se vio contrarrestada por la adición de colesterol en el medio de cultivo. Interrupción de microtúbulos de colcemid también perturbado SGLT-GFP localización. SGLT-GFP localizada a toda la membrana plasmática de colcemid el tratamiento y la localización apical fue restaurado dentro de 1 hora después de la eliminación de colcemid. La inhibición de la síntesis de proteínas de cycloheximide no tuvo ningún efecto sobre la transición de SGLT-GFP inducida por el M β CD o colcemid. Estos resultados indican que la localización apical de SGLT-GFP es mantenido por celular de colesterol y microtúbulos, posiblemente con un mecanismo de reciclaje apical.

I. Introducción

El sodio-glucosa dependiente transportista, SGLT1, se localiza en la membrana plasmática apical en células epiteliales de absorción del intestino delgado proximal y las células del túbulo renal, donde se desempeña papeles fundamentales en la absorción y la reabsorción de azúcares, respectivamente [14, 16 - 18 , 20, 21]. Localización de SGLT1 a la membrana apical es fundamental en el transporte vectorial de azúcares a través de la capa de células epiteliales. El mecanismo de localización apical de SGLT1 aún no se ha dilucidado plenamente.

Se ha informado de que SGLT1 se asocia con detergente-membrana resistente microdomains [10]. La interrupción de estos detergentes resistentes a la membrana microdomains de agotamiento agudo celular de colesterol mediante el tratamiento con metil-β-ciclodextrina (M β CD) disminuyó SGLT1 abundancia de proteínas en estos microdomains, y fue acompañado de una disminución de sodio-glucosa dependiente de la actividad de transporte. La exposición de los túbulos proximales del riñón de células sphingomyelinase, que agota tanto sphingomyelin y el colesterol en la membrana plasmática, también disminuyó la actividad de transporte de glucosa [19]. Este efecto fue contrarrestado por la reposición de colesterol con el colesterol enriquecido liposomas.

Orientación polarizada a la membrana plasmática apical integrante de proteínas de la membrana se asocia con diversos factores intracelulares. El apretado cruce que separa la apical y la membrana basolateral dominios impide la difusión lateral de proteínas de membrana integral. También se ha informado de que elementos citoesqueleto participar en la constitución de lípidos microdomains [1, 5 - 7, 9], y que microtúbulos desempeñan un papel esencial en el tráfico de lípidos microdomain proteínas asociadas a la membrana apical [4, 12] .

Para examinar si tales factores intracelulares, es decir, ajustado cruce de fronteras, el colesterol, y microtúbulos, participar en la localización apical de SGLT1, construido MDCK células transfectadas con GFP marcado SGLT1 gen (SGLT-GFP). La localización de SGLT-GFP poco a poco pasado de apical a toda la membrana plasmática luego de M β CD tratamiento. Interrupción de microtúbulos de colcemid también perturbado SGLT-GFP localización. El apretado nudo marco se mantuvo constante durante el transcurso de estas transiciones de SGLT-GFP. Estos datos sugieren que la localización apical de SGLT-GFP es mantenido por el colesterol y los microtúbulos, con un posible reciclado de maquinaria apical.

II. Materiales y Métodos
Construcción de SGLT-GFP-expresando células MDCK

Rat cDNA de SGLT1 fue un regalo del doctor M. Kasahara (Kasahara y Mori, GenBank D16101). Para generar las buenas prácticas agrarias marcado SGLT1, un fragmento de PCR de cDNA de rata SGLT1 se insertó en el XhoI-EcoRI sitios de pEGFP-N3 vector (BD Biosciences Clontech Japón, Tokio, Japón). El primer tipo incluye adelante XhoI el sitio justo antes del inicio del codón SGLT1 marco de lectura abierta, y el reverso incluye el primer sitio EcoRI en lugar del codón de parada. La secuencia de DNA se verificó con una secuenciación del ADN. MDCK células se mantuvieron en la Dulbecco modificado a medio Eagle (DMEM; D5796, Sigma-Aldrich Japón, Tokio, Japón), complementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB), penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 μ g / ml), bajo una atmósfera de 5% CO 2 y el aire a 37 ° C. SGLT-GFP cDNA fue transfectadas en células MDCK por medio de LipofectAmine Plus transfección reactivo (Gibco BRL, Life Technologies, Tokio, Japón).

Time-lapse microscopía de fluorescencia

MDCK células fueron cultivadas en 35 mm de vidrio a base de platos (Techno Asahi Glass, Tokio, Japón). Los platos se fijaron en una cultura de cámara en el microscopio con una atmósfera de 5% CO 2 y el aire a 37 ° C. Las células fueron observadas con un microscopio de fluorescencia invertido (IX70, Olympus, Tokio, Japón) equipado con un enfriado de cámara CCD (Coolsnap fx, Nippon Roper, Chiba, Japón). Las imágenes fueron capturados y procesados con IP Laboratorio (Scanalytics, Fairfax, VA, EE.UU.).

Ca 2 +-switch experimento

MDCK células fueron cultivadas confluently a los 35 milímetros de cristal los platos a base de tratados y la noche a la mañana (20 ~ 24 horas) en Ca 2 + sin soporte (DMEM sin cloruro de calcio, 21068-028, Gibco BRL) que contiene 0,2 mM EDTA, 10% FBS. Los platos fueron montadas en una cámara de microcultivos en el microscopio y observó. Durante la observación, el medio se cambió a los convencionales medio que contiene Ca 2 +.

M β CD tratamiento

M β CD y soluble en agua colesterol (colesterol equilibrado con M β CD) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (C4555 y C4951). MDCK células fueron cultivadas confluently, y time-lapse imágenes fueron capturados después de que el medio para cambiar el soporte de 15 mm M β CD, o 15 mM β M CD y 30 μ g / ml de colesterol.

Colcemid tratamiento

Colcemid fue adquirido de Gibco-BRL (KaryoMAX colcemid solución). MDCK células fueron cultivadas confluently. Colcemid (200 ng / ml) se añadió, las células y se muestrearon y fijo para microscopía de inmunofluorescencia.

La tinción de inmunofluorescencia y la microscopia confocal láser

Anti-péptido antisueros se suscitaron en un conejo o un conejillo de SGLT1 contra la rata [15, 16]. Mouse monoclonal anti-anticuerpos occludin fue adquirido de Zymed Laboratories (San Francisco, CA, EE.UU.). Rat monoclonal anti-ZO-1 anticuerpo fue adquirido de Chemicon International (Temecula, CA, EE.UU.). Mouse monoclonal anti-gp135 de anticuerpos (3F2) fue un regalo del doctor GK Ojakian [8]. Mouse anticuerpo monoclonal contra el pollo α-tubulina fue adquirido de Sigma-Aldrich. FITC (isotiocianato de fluoresceína) y conjugado con burro anti-IgG de conejo, conjugado con FITC burro anti-conejillo de IgG, LRSC (lissamin rodamina sulfonil cloruro) y conjugado con burro anti-rat IgG, rodamina Red-X-burro conjugado anti-IgG de conejo, Rodamina Red-X-burro conjugado anti-ratón IgG se compraron Immunoresearch de Jackson (West Grove, PA, EE.UU.). Inmunofluorescencia tinción de células MDCK se llevó a cabo, básicamente, como se describe anteriormente [13, 15]. Los especímenes fueron montados en una lucha contra el blanqueamiento incorporación de mediano [11], y observó con un Axioplan 2 microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un MRC-1024 láser confocal sistema (Nippon Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japón) . Las imágenes fueron capturados y procesados con LaserSharp (Bio-Rad) y Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) software.

Medición de la resistencia eléctrica transepithelial (TER)

MDCK células fueron cultivadas en confluently la Transwell filtros (12 mm de diámetro, Ref. N º 3401; Corning Coster Japón, Tokio, Japón). TER se midió utilizando un Millicell-ERS (Millipore Ltd Nihon, Tokio, Japón), tal como se describe en otro lugar [3]. Los valores TER se calculará restando el fondo los valores de los filtros en blanco y se indica como porcentaje de los valores en t 0.

III. Resultados
Localización de SGLT-GFP durante la formación de polaridad celular

Cuando las células fueron cultivadas confluently, SGLT-GFP fue localizada en la membrana plasmática apical como se ha visto en SGLT1 tipo salvaje (Fig. 1 A) [13]. Desde la localización apical de SGLT1 depende de la formación del estrecho marco cruce entre el apical y basolateral membranas plasmáticas [13], por primera vez comprobado la localización de SGLT-GFP en el curso de formación de polaridad celular y el estricto marco de la salida. Cuando las células MDCK, cuyo número era suficiente para la cultura confluente Se sembró en el Ca 2 +-libre medio de 24 Horas, las células fibroblastos expuesto formas similares a las células epiteliales y las hojas no fueron formados (Fig. 1 B). SGLT-GFP fue localizada principalmente a los compartimentos citoplásmico perinuclear (Fig. 1 D). Cuando el medio se cambió a Ca 2 + que contienen convencionales medio, la célula a célula contacto fue gradualmente formado por 30 min después de cambiar el medio. De 2 horas, epiteliales se formaron hojas (Fig. 1 C), y el apretado nudo marco también se construye poco a poco (datos no presentados). Después de la noche a la mañana posterior cultura, la célula epitelial polarizado hojas se terminaron. Durante el curso, la localización de SGLT-GFP cambió gradualmente, y una hora después del cambio medio, SGLT-GFP aparecido a lo largo de toda la membrana plasmática (Fig. 1 E). De 2 horas, SGLT-GFP gradualmente acumulado en la membrana apical (Fig. 1 F). Cuando las células fueron cultivadas en la noche a la mañana convencionales medio después de que el Ca 2 +-switch, SGLT-GFP se limitaba a la membrana apical (Fig. 1 G).

Efectos de la M β CD en apical localización de SGLT-GFP

Para examinar si el colesterol participa en el mecanismo de localización apical de SGLT-GFP, colesterol celular fue eliminado por completo de CD M β tratamiento. Cuando las células MDCK confluyentes fueron tratados con 15 mM β M CD de 2 horas, la localización de SGLT-GFP fue perturbado y poco a poco el pasado de apical a toda la membrana plasmática. Microscopía de inmunofluorescencia reveló que el patrón de tinción el apretado nudo marco se mantuvo constante a lo largo del curso de la transición de SGLT-GFP localización (Fig. 2 A-C). El efecto de M β SGLT en CD-GFP localización fue totalmente compensada por la adición de colesterol (30 μ g / ml) para el medio de cultivo (Fig. 2 D). Estos resultados sugieren que la localización apical de SGLT-GFP es mantenido por un sistema asociado con el colesterol celular.

Efectos de las perturbaciones en microtúbulos apical localización de SGLT-GFP

Para aclarar si la localización apical de la SGLT-GFP se asocia con la microtúbulos del citoesqueleto, microtúbulos fueron perturbadas por colcemid tratamiento. Cuando las células confluentes fueron tratados con colcemid (200 ng / ml), microtúbulos en las células fueron interrumpidas en 1 hr (Fig. 3 A-C). La localización apical de SGLT-GFP, por otra parte, se mantuvo en 1 hr (Figs. 3 B, 4 B). Después de 2 horas de colcemid administración, basolateral señales para SGLT-GFP aumentado gradualmente, y SGLT-GFP fue localizado en toda la membrana plasmática de 4 hr (Figs. 3 C, 4 C). Durante el proceso de transición de SGLT-GFP de localización apical a toda la membrana plasmática, el patrón de tinción el apretado nudo marco no fue afectado (Fig. 4 A-C). Cuando el colcemid se lavan a cabo con el soporte convencional después de 4-Horas colcemid tratamiento, las redes de microtúbulos fueron reconstruidos y volvió a la forma normal de 2 horas (Fig. 3 D). Apical localización de SGLT-GFP también fue restaurado acompañado con la reversión de las redes de microtúbulos. Estos resultados sugieren que la localización apical de SGLT-GFP es mantenida por el microtúbulos del citoesqueleto.

Efectos de la M β CD y colcemid apretado nudo en función

Para examinar si la función de la brevedad de los cruces se ve influida por M β CD o colcemid tratamiento, hemos examinado TER y la localización de otros apical y basolateral marcador de proteínas. El valor medio de TER del confluente de células MDCK fue 1618 ± 23 Ω cm 2. Colcemid tratamiento no afectó TER, mientras que la M β CD rápidamente el tratamiento redujo el TER de células MDCK (Fig. 5]. Curiosamente, occludin y ZO-1 fueron localizados en el apico-lateral aspecto de las células y exhibió el típico cruce marco estricto como se ha visto en el control de las células o bien después del tratamiento con β M CD de 2 horas o colcemid para 4 hr (Fig. 2 B-C y Fig. 4 B-C). Por otra parte, el polarizado de localización apical glicoproteína gp135 no se vio afectado por cualquiera de tratamiento (Fig. 6]. Estos resultados sugieren que la función para la prevención de la difusión lateral se mantiene con normalidad durante la M β CD para el tratamiento de 2 horas o colcemid tratamiento durante 4 horas, y que el CD M β tratamiento sólo podrán afectar a la función barrera de los cruces apretado.

Basolateral SGLT-GFP se transporta de aspecto apical de la membrana plasmática

Debido a los resultados obtenidos plantear una pregunta en cuanto a la fuente de la basolateral SGLT-GFP, para lo cual hay dos respuestas posibles: uno es que la basolateral SGLT-GFP se transporta apical de la membrana plasmática de dominio, y la otra es que la nueva síntesis SGLT-proteína GFP es nonspecifically transportados a toda la membrana plasmática. Para evaluar estas posibilidades, de novo la síntesis de proteínas es inhibida por la administración cycloheximide durante el colcemid o M β CD tratamiento. Administración de cycloheximide (2 μ g / ml) no afectó la transición de apical SGLT-GFP a toda la membrana plasmática en colcemid tratados con células (Fig. 4 D). Cycloheximide también no afectar la transición de apical SGLT-GFP a toda la membrana plasmática de β M CD tratamiento (datos no presentados). Estos resultados indican que la basolateral SGLT-GFP se plantea apical de la membrana plasmática, posiblemente, por un transcytosis-como mecanismo acompañada con la destrucción de un sistema para su localización apical.

IV. Discusión

SGLT-GFP localizados en la membrana plasmática apical depende de la formación del estrecho marco de cruce como se ve en el medio silvestre tipo SGLT1 [13]. Esta observación indica que SGLT-GFP es útil como una sonda fluorescente membrana apical de las moléculas en las células MDCK vida. Cuando las células fueron cultivadas en Ca 2 +-libre medio de 24 Horas, las células no pueden formar uniones intercelulares y la mayor parte de SGLT-GFP señales fueron localizados en el citoplasma vesículas en la región perinuclear. Estos SGLT-GFP-positivas vesículas comenzado a transferir a toda la membrana plasmática 1 hora después de que el Ca 2 +-switch. SGLT-GFP vesículas puede ser lanzado a toda la membrana plasmática por un sistema de transporte vesicular que es estimulada por una señal de transducción de la construcción tras la adhesión de los cruces por el Ca 2 +-switch. SGLT-GFP señales poco a poco en el acumulado de la membrana apical de dominio que acompaña a la formación de los cruces apretado, y preferentemente localizada en la membrana apical después de la noche a la mañana posterior cultura. Estos resultados indican que la localización de SGLT-GFP a la membrana apical depende de la formación del estrecho marco cruce, y que el patrón de localización de SGLT-GFP durante la formación de la polaridad celular es similar a la de tipo salvaje SGLT1.

Se ha informado de que SGLT1 se asocia con detergente-membrana resistente microdomains, y perturbación de estos microdomains de M β CD disminuyó la cantidad de detergente en SGLT1 resistente membrana microdomains, un cambio que fue acompañado de una disminución de sodio-glucosa dependiente de la actividad de transporte [10 ]. Estos resultados sugieren que el colesterol celular podría ser importante para la localización de SGLT1. Se ha informado de que el colesterol celular fue rápidamente agotado del 60% al 50% dentro de 30 minutos a 2 horas después del tratamiento con β M CD [2], y que la orientación apical de la membrana de proteínas HA asociados con lípidos balsa fue perturbado [4, 12]. Cuando confluently cultivadas MDCK células fueron tratadas con M β CD, la localización de SGLT-GFP fue perturbado y apical de conmutación para toda la membrana plasmática. Esta respuesta parece dentro de los 30 minutos, y la transición de SGLT-GFP a toda la membrana plasmática se terminó de 2 hr. Desde los patrones de tinción por inmunofluorescencia apretado nudo de la proteína ZO-1 y apical de proteínas gp135 marcador no cambió durante la transición de SGLT de GFP-M β CD tratamiento, el cambio de localización no se debe a la difusión lateral de la destrucción de lo ajustado del cruce de fronteras. El efecto de M β CD para la transición de SGLT-GFP fue totalmente compensada por la adición de colesterol. Este resultado indica que el colesterol celular es esencial para la localización apical de SGLT-GFP.

Citoesqueleto pistas son esenciales para el transporte vesicular y la selección de proteínas de la membrana. Apical orientación HA de la gripe se vea perturbado acompañada con la destrucción de microtúbulos nocodazol filamentos de tratamiento [4, 12]. Se examinó la posible participación de microtúbulos en la localización de la maquinaria SGLT-GFP. De 1 hora después del tratamiento con colcemid, microtúbulos redes fueron completamente perturbado, mientras que la localización apical de SGLT-GFP se mantuvo. Apical localización de SGLT-GFP fue poco a poco perturbada y SGLT-GFP localizada a toda la membrana plasmática de 4 hr. Microtúbulos se reconstruyeron las redes y volvió a la normalidad dentro de la forma 1 hora después de la eliminación de colcemid. La localización apical de SGLT-GFP fue restaurado acompañado concomitantemente con la reversión de los microtúbulos filamentos. Desde los patrones de tinción por inmunofluorescencia de ZO-1 y gp135 no cambió durante la transición de SGLT-GFP colcemid de tratamiento, se considera que la transición no se debe a la difusión lateral de la pérdida de cerca la función de la brevedad de los cruces. Cuando las células fueron tratadas con colcemid y cycloheximide, la transición de SGLT-GFP a toda la membrana plasmática se observó también. Este resultado indica que el basolateral SGLT-GFP se origina a partir de que en la membrana apical de plasma en lugar de partir de una nueva síntesis fuente. La destrucción de los microtúbulos de colcemid tratamiento puede perturbar el sistema de retención apical para SGLT-GFP y la posterior transcytosis-como el transporte apical de SGLT-GFP a la membrana basolateral, por lo que en toda la membrana de distribución del mismo.

A partir de estos resultados, se concluye que la localización apical de SGLT-GFP es mantenido por celular de colesterol y microtúbulos. Localización de SGLT-GFP a la membrana apical puede mantenerse con el reciclaje continuo de exocitosis y endocitosis, y el colesterol microdomains y microtúbulos desempeñan un papel importante en el reciclaje de máquinas.

Esta obra fue financiada en parte por subvenciones de Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, y una subvención de la Kato Bioscience Memorial Foundation. Damos las gracias al doctor M. Kasahara (Universidad Teikyo, en Tokio, Japón) para ofrecer la rata SGLT1 cDNA, el doctor GK Ojakian (SUNY Downstate Medical Center, Brooklyn, NY) para la lucha contra la gp135 de anticuerpos.