Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(6): 183-192 (más artículos en esta revista)

La cuantificación de mRNA PERF 15 en las secciones de tejido de los testículos de ratas

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Takashi Kogami [1], Yukari Miki [1], Teruo Yamada [1], Teruo Umegaki [1], Makoto Nishimura [1], Takashi Amo [1], Jun Kosaka [1], Junzo Sasaki [1]
[1] Departamento de Citología e Histología, Okayama University Graduate School of Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas, 2-5-1 Shikatacho, Okayama 700-8558, Japón

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Resumen

Anteriormente realizó la investigación básica para cuantificar hibridación in situ (ISH) de señales en testículos de ratas. En este modelo experimental, se seleccionaron RNA ribosómico (rRNA) hybridizable como el ARN en las secciones de parafina, ya que nos permitió analizar fácilmente ISH señales expresadas con digoxygenin (DIG)-etiquetados a través de sondas cuantitativamente "posterization" de las imágenes. Hemos aplicado este método para analizar la cuantificación de transcripción, PERF 15 mRNA. PERF 15 se expresa específicamente en los testículos y localizados en el citoesqueleto estructura rígida de la cabeza espermática, y ha sido considerado para participar en el proceso de apoptosis de las células espermatogénica. La cuantificación de las señales que pueden ayudar a aclarar la función detallada de PERF 15. Asimismo, analizaron las señales concomitante con un láser confocal de barrido microscopio. El pico de 15 PERF expresión mRNA se encontró en diplotene espermatocitos, y la cantidad de mRNA PERF 15 fue mayor a finales de pachytene y diplotene espermatocitos y espermátidas temprana, seguida de principios de pachytene espermatocitos, y luego finales de espermátidas. PERF 15 podrán participar en los acontecimientos que dieron lugar a la división meióticas, en la que la apoptosis es también participan. El presente estudio puede ayudar a determinar la concentración de ARNm en las secciones de tejido.

I. Introducción

Se estudió la expresión de genes de especies reactivas del oxígeno (ROS) relacionados con las enzimas en los órganos reproductivos mediante hibridación in situ (ISH) histoquímica y encontró que Hidroperóxido desempeña un importante papel en la función de macho y hembra los órganos reproductivos [20, 21, 30] . La hipótesis de que las actividades de ROS en los órganos reproductivos son objeto de regulación durante el ciclo estral y la espermatogénesis en el nivel transcripcional. Por lo tanto, trató de estimar el monto de cada una transcripción en ciertos tipos de células, sin embargo, esas estimaciones tienden a ser subjetivo. A continuación, realizamos la investigación básica para cuantificar el ISH señales en testículos de ratas [14], un órgano adecuado para la cuantificación porque las células germinales someterse desarrollo sincronizado y mostrar etapa específica de la expresión génica. En este modelo experimental, un bien conservado segmento de rRNA [39], fue seleccionada como la hybridizable ARN en las secciones de parafina. Las muestras fijadas con fijador de Bouin y DIG hibridó con sondas de marca podría ser fácilmente analizada cuantitativamente a través de "posterization" de las imágenes. El importe de rRNA hibridada con la sonda fue mayor en los primeros espermatocitos primarios, seguido de pachytene espermatocitos, entonces diplotene espermatocitos secundarios y, por último, espermatocitos y espermátidas. Los importes alcanzado niveles bajos en la metafase, anafase y telofase de división meióticas y principios de espermátidas el paso 1, y luego aumentó ligeramente durante spermiogenesis. ISH rRNA tinción [39] es un parámetro útil para evaluar el análisis cuantitativo de mRNA y los niveles de ARN hybridizable en secciones de tejido. En el presente estudio, hemos aplicado el método para cuantificar la cantidad de rRNA para la cuantificación de ARNm 15 PERF. PERF 15, a 15 kDa proteína que se encuentra en la perforatorium jefes de esperma [22 - 25], se identifica como una prueba de lípidos-proteína de unión (TLBP) [32] que se expresa específicamente en testículos de ratas a pesar de que su función fisiológica detallada sigue siendo desconocido. Para investigar la función de PERF 15 en testículos de ratas, hemos utilizado el análisis cuantitativo de las señales de ISH. Las señales fueron detectados por el método posterization y microscopía de fluorescencia utilizando un tyramide sistema de amplificación de señal.

II. Materiales y Métodos

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Experimentos con Animales de la Okayama University Graduate School of Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas. Todos los reactivos son de la más alta calidad disponible comercialmente.

Preparación de tejidos

Adultos ratas Wistar macho (Clea, Tokio, Japón), ocho semanas de edad, 200-220 g, fueron anestesiados por una inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Los testículos fueron perfundidos con fijador de Bouin y sumergido en el mismo fijador por más de 6 horas, deshidratados en etanol, sustituido con xileno, y embebidos en parafina. Parafina secciones (5 μ m de espesor) fueron montados en silano revestido con diapositivas [31]. Serial secciones fueron montadas en varias series de tres diapositivas. La primera diapositiva se utiliza para la ISH utilizando DIG marcado sondas, el segundo para la tinción de PAS y el tercero para ISH Tyramide utilizando un kit de amplificación de señal, tal como se describe en la sección de hibridación. Después de los experimentos, una serie de diapositivas se analizó para la cuantificación de las señales.

Preparación de sondas

Para aislar los fragmentos de ADN de codificación PERF 15, RT-PCR se llevó a cabo tal y como se describe anteriormente [15, 34]. Total RNA fue extraída de los testículos de ratas por el ácido guanidium tiocianato-fenol-cloroformo método de extracción [2]. Una serie de oligonucleótidos (PERF 15-PERF p1 y p2-15) fue utilizado como primers. PERF 15-p1 tenía la secuencia 5'-AGGGAACTGGGAGTGGAATGTGAAC-3 », correspondientes a los nucleótidos de 83-107 PERF 15 (TLBP, número de GenBank U07870) [32]. PERF 15-p2 tenido la secuencia 5'-CATCTTTGGATCTGGATCATTGACCC-3 », correspondientes a los nucleótidos 287-312. Complementarias de ADN fue sintetizado a partir de ARN total de testículos de ratas con un kit de cDNA (Takara Biomédicas, Shiga, Japón), y los fragmentos de ADN fueron amplificados en un 150 μ l de mezcla de reacción con un termociclador de ADN (Astec Co, Fukuoka, Japón) usando Taq ADN polimerasa en 30 ciclos de 30 seg de desnaturalización a 94 ° C, 1 min recocido a 60 ° C y 1 min síntesis a 72 ° C. El producto de PCR purificado fue subcloned en el sitio EcoRV de p Bluescript KS (-). La secuencia de nucleótidos se confirmó por el uso de la Sanger dideoxynucleotide la cadena de terminación de los métodos [29]. El mismo fragmento de PERF 15 se había utilizado en el ADN array (B14 i: Atlas Rat 1, 2, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y su especificidad sonda ya ha sido confirmado por el fabricante.

El resultado de ADN plásmido se linearized con EcoR I y Hind III. DIG-etiquetados para riboprobes PERF 15 mRNA se sintetiza con una transcripción in vitro kit, en presencia de T3 o T7 RNA polimerasa acuerdo con las instrucciones facilitadas por el fabricante (Roche Diagnostics Co, Mannheim, Alemania). Después de DNasa tratamiento, el producto fue precipitado con etanol y el precipitado fue resuspendido en la mezcla de hibridación. Esta sonda se utilizó para los dos borrones del Norte y la hibridación in situ.

Del Norte blot

ARN mensajero se purifica a partir de ARN total de testículos de ratas con una Oligotex-dT30 Super kit de purificación de ARNm (Takara Bio, Shiga, Japón). Diez μ g de poli (A) + RNA se separaron por electroforesis en un 1,5% de agarosa / formaldehído gel [28]. El ARN fue trasladado a Hybond-N + (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) y fijos a los filtros de hornear a 120 ° C durante 15 min. Hibridación se realizó a 65 ° C durante 16 horas utilizando DIG cRNA marcado con las sondas en DIG Easy Hyb solución (1603558, Co Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Baja rigor lavados fueron seguidas por una final de alto rigor lavar en la cooperación Sur-Sur 0,2 × (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M de citrato de sodio), el 0,1% de sulfato de sodio dodecyl a 65 ° C durante 30 min. La membrana fue tratado con RNasa y luego reaccionó con una fosfatasa alcalina (AP)-conjugadas anti-DIG anticuerpos. AP actividad se detectó un producto químico utilizando el método de luminiscencia, CDP-Star (Co Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).

Hibridación

Las secciones se dewaxed con tolueno y el etanol, y luego sucesivamente tratados con 0,2 N HCl, 1 μ g / ml de proteinasa K en 2 mM de CaCl 2 y 20 mM de Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 mg / ml de glicina en Dulbecco's tampón fosfato salino y acetilado con 0,25% de anhídrido acético 0,1 M triethanolamine (pH 8,0) para prevenir inespecíficos vinculante de las sondas. Las diapositivas fueron lavadas con 2 × la cooperación Sur-Sur y, a continuación, prehybridized en una solución que contenga 50% formamida y 2 × SSC a 50 ° C durante más de 1 hr. Hibridación se realizó en las diapositivas utilizando 20 μ l de una hibridación mezcla que contiene 50% formamida, 2 × SSC, 1 mg / ml tRNA, 0,5 mg / ml sonicated ADN de esperma de salmón, 2 mg / ml de suero bovino de albúmina, dextrano 10% y el sulfato riboprobe (alrededor de 2 μ g / ml) a 50 ° C durante 16 horas en una cámara húmeda. Las diapositivas fueron luego enjuagar tres veces con 2 ¥ cooperación Sur-Sur y el 50% formamida a 50 ° C durante 20 minutos cada uno y tratados con RNasa solución.

Después de más de lavado de los portaobjetos, con 0,1 ¥ cooperación Sur-Sur, la detección de señales se realizó con dos protocolos. En el primer protocolo, AP-conjugado anti-DIG anticuerpos (1:2500) se colocó en las secciones a temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez aclarado las diapositivas, la enzima-reacción catalizada color la noche a la mañana se continuó con 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolyl y nitroblue tetrazolium sal de acuerdo a las instrucciones que se proporcionan con el kit. Las secciones fueron teñidas con verde de metilo y observó con un microscopio de luz. En el segundo protocolo, y conjugado con peroxidasa anti-DIG anticuerpos (1:1500) se colocó en las secciones a 4 ° C durante la noche. Actividad peroxidasa se detectó mediante un Tyramide Kit de amplificación de señal (TSA directa; NEN Life Science Products Perkin-Elmer, Boston, MA), de acuerdo con las instrucciones que se proporcionan con el kit. En breve, un fluoróforo marcado tyramide amplication reactivo (TSA-fluoresceína) se añadió a temperatura ambiente durante 15 minutos en una habitación oscura, enjuagar y montadas con Slowfade anti-fade reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA) [38]. Las diapositivas se observaron con un láser confocal Zeiss Microscopio de Barrido (LSM510).

Clasificación de la espermatogénesis

Cuando la fase de clasificación de la espermatogénesis en los testículos de ratas se investigó, la serie fueron teñidos con ácido periódico de Schiff hematoxilina-[8, 27].

La cuantificación de las señales

En el primer protocolo, las secciones fueron teñidas observadas con un microscopio Zeiss Axioplan mediante un Plan-Neofluar 20 × lente. Etapas de más de 230 túbulos se identificaron en la sección, de los cuales cinco a seis por túbulos etapa se analizaron por el primer protocolo. Fotos obtenidos con una cámara CCD AxioCam se guardan en la etiqueta de formato de archivo de imagen (TIFF) en un tamaño de 1300 × 1030 píxeles (~ 3,8 MB). Hemos guardado las imágenes que incluyó más de cuatro túbulos, en la que los túbulos de la etapa XII-XIII estaban presentes, porque diplotene espermatocitos siempre mostró señales fuertes. Las imágenes fueron separados en cinco tonos de oscuridad a la luz con posterization herramientas de Adobe Photoshop 5.0 (Adobe Systems, Tucson, AZ). Estos cinco tonos se expresan como números de categoría 5 (más fuertes) a grado 1 (cero intensidad): negro 5 º grado, grado 4 gris oscuro, gris grado 3, grado 2 gris claro, y grado 1 en blanco. El valor en cada población de células y se obtuvo el valor medio se expresó en 0,5 intervalos de ocho años de gradiente de densidad, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 de blanco a negro (Fig. 4]. En el segundo protocolo, las secciones fueron teñidas observadas con un LSM510 mediante un Plan-Neofluar × 40 / 0,75 lente. Entre los túbulos investigados en el primer protocolo, dos a tres túbulos de la Etapa V, VI, VII, IX, Xy XII-XIII en las secciones de serie fueron seleccionadas, y la intensidad de la señal de más de ocho puntos en el citoplasma de cada célula espermatogénica (primaria y secundaria espermatocitos y espermátidas) se midió por un programa informático para la LSM510 (LSM 5 Navegador de imágenes). Un histograma de la intensidad se obtuvo de las regiones de interés en el citoplasma, definido por el dibujo cerrado y elementos extraídos, luego, se convierten a tablas y se transferirán a una hoja de cálculo de Excel. La intensidad de la señal se obtuvo mediante el cálculo y expresando como la intensidad media pixel (0-255) y restando el valor del fondo. El detector de ganar era lo suficientemente disminuido de modo que sólo había una pequeña cantidad de píxeles que muestran la máxima intensidad.

El análisis estadístico

La intensidad de las señales en las células espermatogénica fueron analizados por la prueba estadística se describen a continuación para comparar con el valor del fondo y los valores de espermatogénica células en diferentes etapas. Una forma ANOVA se utilizó para examinar si existen diferencias estadísticas entre los grupos y, a continuación, Tukey HSD de comparaciones múltiples se utilizó para encontrar los pares de que grupos eran diferentes. Los valores de p <0,05 se consideró significativo.

III. Resultados

La especificidad de la sonda para PERF 15 mRNA fue confirmada por Northern blot. Cuando la poli (A) + RNA de los testículos de ratas adultas se hibridó con la sonda, una única banda correspondiente a 0,8 kb fue detectado (Fig. 1]. Este resultado es coherente con un informe anterior [26]. Por lo tanto, hemos utilizado esta sonda para localizar y cuantificar PERF 15 mRNA en la ISH estudio.

Señales positivas que muestra la localización de 15 PERF mRNA fueron detectables en todos los túbulos seminíferos de la rata cuando los testículos se hibridó con una sonda antisentido (Fig. 2 B). Un color marrón indica la expresión de genes de 15 PERF mRNA. Señales específicas no se observaron cuando los testículos de ratas se hibridó con una sonda sentido (Fig. 2 A).

Para cuantificar el ARN señales, que determinó que las señales se distribuyeron equitativamente entre los túbulos seminíferos. Cuatro túbulos de las etapas II-III, dos de la etapa V, nueve de VII-VIII, dos de X-XI, seis de las etapas XII-XIII y cinco de la etapa XIV se observaron (Fig. 2 B). En estos túbulos, pasos 2-3 espermátidas en la fase II-III, el paso 5 espermátidas en la fase V, pasos 7-8 espermátidas en la fase VII-VIII, pachytene espermatocitos en las etapas X-XI, y pachytene o diplotene espermatocitos en etapas XII - XIII puso de manifiesto la igualdad de los niveles de mRNA 15 PERF expresión. En los cinco túbulos de la etapa XIV, espermatogénica células mostraron distintos niveles de mRNA 15 PERF expresión en función de su fase de división mitótica.

Figuras 3 y A 3 EX muestran un alto aumento opiniones de los túbulos seminíferos hibridó con sondas antisentido para PERF 15 mRNA. Utilizando una serie de la sección manchada con hematoxilina-PAS (Figs. 3 y D 3 H), las etapas en las figuras 3 y A 3E fueron identificadas como II-III, IV, V y XIV en la Fig. 3 D-II y III, VIII , X, XII-III y XIV en la Fig. 3 H.

La expresión de mRNA PERF 15 a principios de pachytene espermatocitos de las etapas II-III, IV y V (Fig. 3 A, puntas de flecha) fue bajo, pero se hizo evidente a mediados pachytene espermatocitos de la etapa VIII (Fig. 3 E, punta de flecha) y marcó a finales de espermatocitos pachytene X de la etapa y tarde pachytene y diplotene espermatocitos de las etapas XII-XIII y XIV (Fig. 3 E, flechas). La expresión de mRNA PERF 15 fue baja en las células que exhiben división mitótica (Figs. 3 y A 3 EX, asterisco). Después de la división meióticas, espermátidas redondas (pasos 2-3, 4, 5 y 8 en Figs. 3 A y 3 E) mantiene altos niveles de mRNA 15 PERF expresión, sin embargo, alargada espermátidas (medidas 10, 10-12, 14, 16 y 17) disminuyó su expresión como la diferenciación avanzado. Las imágenes fueron separados en cinco tonos de oscuridad a la luz (Figs. 3 y B 3 F) y se expresan como números de grado 5 a grado 1, tal y como se describe en Materiales y Métodos. El valor medio de cada población celular se obtuvo de cinco o seis túbulos y se expresan como ocho gradiente de densidad, tal como se resume en la figura 4. La cantidad de mRNA PERF 15 hibridada con la sonda fue mayor en los últimos pachytene y diplotene espermatocitos (grado 4-4.5, gris oscuro a negro), seguido de principios de espermátidas y espermatocitos mediados pachytene (grado 3-3.5, gris), luego a principios pachytene fines de espermatocitos y espermátidas (2.5-1 grado, de color gris claro a blanco). Los importes alcanzado niveles bajos en la metafase, anafase y telofase de división meióticas, y luego aumentó durante spermiogenesis.

Figuras 3 y C 3 G mostrar imágenes de alta magnificación de los túbulos seminíferos hibridó con sondas antisentido para PERF 15 ARNm y detecta con y conjugado con peroxidasa anti-DIG de anticuerpos y un Tyramide Kit de amplificación de señal. Figuras 3 A, 3 D y 3 C, las figuras 3 E, 3 y H 3 G son las secciones de serie (Figs. 3 A y 3 C, y Figs. 3 y E 3 G insertada Fig. 3 D y Fig. 3 H, respectivamente). El 15 PERF patrón de expresión mRNA en túbulos seminíferos detectados por la autopista AP-conjugadas anti-DIG anticuerpos (Figs. 3 y A 3 E) es compatible con el que detectado por la peroxidasa conjugada anti-DIG-anticuerpo y una amplificación de señal Tyramide Kit (Figs 3. C y 3 G). La intensidad de la señal en el citoplasma de cada célula espermatogénica (primaria y secundaria espermatocitos y espermátidas) se midió como se describe en Materiales y Métodos, y los resultados se resumen en la Figura 5. La intensidad de señal para PERF 15 mRNA en espermatocitos primarios y diplotene espermatocitos de las etapas IX, X, XII-XIII y los pasos 5-7 espermátidas fueron significativamente más altos que los de pachytene espermatocitos de las etapas V, y VII, espermatocitos en metafase (de mí en la Fig. 5] y finales de espermátidas (medidas 9 y más adelante). Sin embargo, los resultados obtenidos mediante el segundo protocolo no eran completamente idénticas a los resultados obtenidos mediante el primer protocolo. Aunque pachytene espermatocitos en la etapa X expresaron señales más fuertes que espermatocitos en la etapa IX o los pasos 5 y 7 espermátidas con el primer protocolo, no hubo diferencias significativas entre la intensidad de la señal de la etapa X espermatocitos (141,0 ± 7,8) y los de la etapa IX espermatocitos ( 142,0 ± 6,4), el paso 5 espermátidas (139,4 ± 12,1) y el paso 7 espermátidas (133,9 ± 12,9). Intenso se observaron señales de mediados pachytene espermatocitos a espermátidas redondas durante la espermatogénesis.

IV. Discusión
La cuantificación de las señales de ISH

Hemos utilizado los testículos de ratas para la investigación básica para cuantificar las señales ISH espermatogénica porque las células en someterse a este órgano el desarrollo sincronizado y mostrar etapa específica de la expresión génica, lo que permite las diferencias en la intensidad de señal entre los grupos de células espermatogénica a quedar claramente demostrado [14]. En este modelo experimental, se seleccionaron un bien conservada segmento de rRNA [39] como la hybridizable ARN en las secciones de parafina y llegó a la conclusión de que ISH rRNA y la tinción posterization de la intensidad de la señal de parámetros son útiles para el análisis cuantitativo de ARNm, en otras palabras , Para la detección del total de la actividad transcripcional en los cortes de tejido. En el presente estudio, hemos aplicado este método para la cuantificación de las transcripciones y seleccionados PERF 15 mRNA como el ARN hybridizable PERF 15 porque es una nueva proteína que se expresa específicamente en los testículos y su función fisiológica es todavía poco clara. Asimismo, las señales fluorescentes utilizados para cuantificar las transcripciones. Casi los mismos resultados se obtuvieron con las dos estrategias: la posterization intensidad de la tinción (Fig. 4] y la cuantificación de las señales fluorescentes (Fig. 5]. Estos resultados apoyan los datos anteriores de Oko y Morales [24], en el que declaró que la expresión de mRNA PERF 15 se puso de manifiesto en pachytene espermatocitos en las etapas III y VI, moderadas en espermatocitos primarios en las etapas IX y XII, intenso y en los pasos 3 espermátidas y 6, si bien no se observó en el paso 18 espermátidas, espermatogonias o leptotene espermatocitos, a pesar de las señales con 3 H-etiquetados sondas no distingue entre grupos de células espermatogénica al igual que los que utilizan la etiqueta DIG-sondas.

Localización y función de PERF 15

La localización y la cantidad patrón de las transcripciones nos ha llevado a considerar la importancia de PERF 15 en la etapa posterior de la meiosis y la primera etapa de spermiogenesis. El pico de 15 PERF mRNA expresión se observó a finales de pachytene a diplotene espermatocitos en las fases XII-XIV, justo antes de meióticas división se produjo, y fue elevado a espermátidas redondas, lo que puede afectar el proceso de apoptosis espontánea que se produjo principalmente en la etapa XIV fisiológicas en la espermatogénesis [ 11] o afectar el propio proceso de meióticas.

PERF 15 fue originalmente encontrado en el perinuclear del caso de los espermatozoides cabeza [3, 22, 25]. El perinuclear del caso es el área que cubre la totalidad del núcleo, a excepción de la zona perifossal, y se divide en dos partes diferenciadas: la perforatorium, que subyace en el sistema acrosomic, y las basales-situado postacrosomal lámina densa. El 15 PERF proteína pertenece a los componentes de bajo peso molecular polipéptidos y se localiza en la porción más gruesa apical de la perforatorium y el interior de la zona ventral espolón. El perforatorium contribuye a la forma de la cabeza del espermatozoide y el perinuclear del caso; acrosomic tanto el sistema de membrana celular y están estrechamente vinculados, jefe de mantenimiento de la estructura compacta, y se consideran una rígida estructura citoesqueleto [3, 22, 24 , 25]. PERF 15 es un miembro de la celular lipofílicas superfamilia de proteínas de transporte que incluye el adipocito de lípidos-proteína de unión (ALBP), celulares ácido retinoico-proteína de unión (CRABP) o la mielina P2. ALBP ha sido implicado en la absorción y el transporte de lípidos en el tejido adiposo [37], por lo PERF 15 puede servir funciones similares en el desarrollo de espermatozoides [32].

Recientemente, Kido y Namiki [12] encontró firmemente PERF 15-positivas las células germinales en etapas concretas mediante inmunohistoquímica y demostraron que TUNEL-positivos son a menudo las células de alta PERF 15 expressers. Informaron que la exposición al ácido methoxyacetic (MAA), conocido para inducir apoptosis en espermatocitos, aumentó el número de firmeza PERF de 15 células positivas en 25 días de edad los testículos de ratas, y sugirió que la expresión de PERF 15 está relacionada con testicular germinal apoptosis de las células. En ratones transgénicos que firmemente overexpressed PERF 15, la muerte celular programada se produjeron en la etapa de espermátida alargada [13].

En mamíferos, los testículos, la apoptosis de células germinales y normalmente se produce continuamente a lo largo espermatogénesis [1, 11] y trabaja para reducir el número de células germinales y coincidir con la capacidad de apoyo de células de Sertoli. Nos informó de que ROS mitocondrial y vías estuvieron involucrados en el mecanismo de cola de renacuajo desaparición, un típico tipo de muerte celular programada [6, 7, 10] y di (2-etilhexil) ftalato (DEHP) inducida por la apoptosis en testículos de ratas [9 ]. La participación de ROS y una vía mitocondrial Se informó también de estrógenos durante la apoptosis inducida por los testículos de ratas [19]. El papel de PERF 15 en el proceso de apoptosis no está claro, pero ROS pueden estar involucrados, ya que los testículos son ricos en lípidos. PERF 15 también tiene una doble función, como Ursini et al. Informó en el caso de fosfolípido Hidroperóxido de glutatión peroxidasa [36]. Para clarificar el importante papel de PERF 15 y la participación de las mitocondrias o ROS, un análisis más detallado de las drogas inducida por el proceso apoptótico en los testículos es necesaria [4, 9, 12].

Para mayor cuantificación de las señales

La medición de la intensidad de fluorescencia en el presente estudio supera varios puntos débiles de otros esfuerzos encaminados a cuantificar las señales ISH. En un artículo anterior, nos describe varios problemas que se habían superado en la cuantificación de ARNm en las secciones de tejidos [14]. Estos problemas fueron: 1) si hubo o no linealidad entre la sonda y la concentración ISH señales, 2) si o no el número de moléculas sonda por unidad de superficie o por célula sección transversal refleja con exactitud el contenido celular del mRNA [17], 3 ) Que había diferencias en la accesibilidad de las sondas de ARNm entre los mRNAs, 4) que la diferencia en el grado de fijación refleja el grado de accesibilidad de las sondas entre los diferentes cortes de tejido [5], y 5) proteolíticas que depende de permeabilización el grado de fijación y es fundamental [16, 33], mientras que diferentes tipos de células a menudo tienen diferentes optima de permeabilización. Por otra parte, enzimáticos etiquetado a menudo como resultado la heterogeneidad de etiquetado de moléculas sonda. La "actividad específica" de tales sondas representó a la media de una amplia gama de diferente etiqueta sonda moléculas [16]. El problema más importante era que la medición exacta de los cambios en volumen celular, el volumen de la estructura, o el número de células de la etiqueta era necesaria para evaluar el cambio exacto en la expresión de genes de un determinado tejido [18]. El uso de láser confocal de barrido microscopio puede ayudar a resolver estos problemas, ya que nos permite determinar cada célula del volumen y el número de células, así como la accesibilidad de las sondas en el eje Z de profundidad, con este tipo de microscopía. Anteriormente, Tsukasaki et al. Realizó análisis de imágenes de las señales detectadas por DIG-etiquetados sondas y aplicó el semi-método de cuantificación para las muestras clínicas [35]. Expresaron el importe de la transcripción como la relación de rRNA en la sección de serie. En el presente estudio se introduce un fluorocromo-sistema de detección para expresar los valores numéricos de las señales, y nos mostró que resultados similares se obtuvieron entre nuestro método y el posterization. Tsukasaki et al. Manchado DIG-etiquetados para sondas de rRNA, de 10 -12 g / μ l con 10 -8 g / μ l, en las membranas de nylon y detectó estas manchas immunohistochemically [35]. Por el contrario, hemos hecho de cristal que se desliza en una sección de tejido y las filas de ADN de manchas fueron colocados para determinar la concentración de ARNm en una sección de tejido. Estas manchas, 110 μ m de diámetro, consta de 1 nl de sentido y antisentido secuencias de rRNA, de 0-1 × 10 -6 M de 500 M. Se trató de comparar la intensidad de la señal en la sección de tejido con la intensidad de la señal en los puntos que contienen concentraciones conocidas de la rRNA dado. El presente estudio puede ayudar a establecer este método.

En conclusión, hemos localizado y cuantificado PERF 15 ARNm a nivel celular en los testículos. En vista de los presentes resultados, le recomendamos que PERF 15 obras de meióticas el proceso para la formación de espermatozoides cabeza y durante los eventos apoptóticos en los testículos. La cuantificación de las señales ISH puede convertirse en un poderoso instrumento para definir la función desconocida de las moléculas en el período postgenomic.

Apoyado en parte por subvenciones de las ayudas para la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Estamos agradecidos al doctor Da-Hong Wang, del Departamento de Salud Pública, Okayama University Graduate School of Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas de sus sugerencias en relación con el análisis estadístico y el Sr Shigeto Kanda, Departamento de Citología e Histología, Okayama University Graduate School of Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas, por su asistencia técnica.