Journal of Biology, 2006; 5(5): 14-14 (más artículos en esta revista)

ERK1 y ERK2 mitogen-activated proteínas quinasas afectan a Ras-dependiente de células de señalización diferencialmente

BioMed Central
Chiara Vantaggiato (chiara.vantaggiato @ bp.lnf.it) [1], Ivan Formentini (formentini.ivan @ hsr.it) [1], Attilio Bondanza (bondanza.attilio @ hsr.it) [1], Chiara Bonini ( bonini.chiara @ hsr.it) [1], Luigi Naldini (naldini.luigi @ hsr.it) [1], Riccardo Brambilla (brambilla.riccardo @ hsr.it) [1]
[1] Istituto scientifico San Raffaele y la Università Vita-Salute San Raffaele, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Italia
[2] Dirección actual: Istituto scientifico E. Medea, 23848 Bosisio Parini, Italia

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

El mitogen-activated proteína (MAP) cinasas p44 ERK1 y P42 ERK2 son componentes cruciales de la maquinaria subyacente de regulación normal y la proliferación de células malignas. Un modelo aceptado actualmente sostiene que ERK1 y ERK2 son regulados de manera similar y contribuir a la señalización intracelular de fosforilantes un gran subconjunto común de sustratos, tanto en el citosol y en el núcleo.

Resultados

En este sentido, indican que la ablación de ERK1 en fibroblastos de embrión de ratón y células 3T3 NIH gen de la orientación y la interferencia por ARN se traduce en una mejora de ERK2 dependientes de señalización y en un crecimiento importante ventaja. Por el contrario, desmontables de ERK2 suprime casi completamente normal y Ras-dependiente la proliferación celular. Ectópico expresión de ERK1, pero no de ERK2 en células 3T3 NIH inhibe Ras oncogénico mediado por la proliferación y formación de colonias. Estos fenotipos son independientes de la actividad de quinasa ERK1, como expresión de una forma inactiva catalíticamente de ERK1 es igualmente eficaz. Por último, ectópico expresión de ERK1, pero no ERK2 es suficiente para atenuar Ras dependientes de la formación de tumores en ratones desnudos.

Conclusión

Estos resultados ponen de manifiesto una inesperada interacción entre ERK1 y ERK2 en transducing Ras-dependiente de señalización celular y la proliferación. Considerando que ERK2 parece tener un papel positivo en el control normal y Ras-dependiente la proliferación celular, ERK1 probablemente afecta a la señalización de salida de la célula de antagonizar ERK2 actividad.

Fondo

El pequeño Ras GTPase, sus familiares y sus efectores son fundamentales para la señalización de las redes que están involucrados en una gran variedad de procesos de regulación en la célula, de la proliferación y tumorigénesis para el desarrollo y la plasticidad sináptica [1 - 3]. La cascada de señalización que impliquen la Raf, MEK (mitogen-activated proteína (MAP) o señal extracelular regulada (ERK) kinasa) y ERK familias de quinasas está entre las mejores vías caracteriza abajo de Ras. Este módulo de Parejas de señalización mediada por receptores de activación de Ras al citoplasmáticas y nucleares hechos, dando lugar a la fosforilación de las principales estructural y normativa, componentes [4 - 8].

Aproximadamente el 15% de los cánceres humanos contienen la activación de mutaciones en uno de los genes Ras [1, 9]. Esta cifra representa en virtud de la real participación de Ras en vías de tumorigénesis, sin embargo, al igual que otros componentes de señalización corriente abajo, como la B-Raf, se encuentra con frecuencia en su forma oncogénico en tumores en Ras que no es en sí mutado [10]. Es importante destacar que, sin embargo, la inducción de mutaciones missense activar o supresiones en los dominios de reglamentación podría no ser el único mecanismo que conduzcan a la desregulación del Ras-ERK trayecto y malignidad. Aunque no hay pruebas hasta el momento para sugerir que cualquiera de MEK1 / 2 o ERK1 / 2 puede convertirse en proteínas oncogénicas en tumores espontáneos, su actividad es upregulated masivamente en varios cánceres humanos [11]. Por ejemplo, en muestras de leucemia humana, tanto MEKs y ERKs son a menudo hyperphosphorylated y activado, lo que sugiere una relación causal entre la estimulación de Ras-ERK vía y la tumorigénesis y proporcionar un marco conceptual para la orientación terapéutica potencial (tal como fue revisado en [12]].

Un aspecto importante de la regulación del Ras-ERK cascada es la especificidad, no redundante papel de la proteína isoformas en esta vía. Gene y las orientadas por las líneas de ratones transgénicos han demostrado ser muy valiosa en la determinación de fenotipos específicos asociados con la mayoría de los componentes de señalización en la vía, incluidas las líneas defectuosas en una de las tres proteínas Ras (K-ras, N-ras y H-ras), las isoformas Raf c-Raf-1, Raf-A y B-Raf, la MEKs MEK1 y MEK2, el barrio de Ras GTPase-activación de las proteínas GAP-1 y NF1, la guanina Ras de nucleótidos liberadora de factores RasGRF1 y RasGRF2, y el adaptador de proteínas Sos1, Grb2 y en situación especialmente difícil [1, 4, 13 - 24]. Por otra parte, para algunos componentes de la vía, tales como c-Raf-1 y B-Raf, importantes diferencias estructurales son la base no sólo de su regulación diferencial, sino posiblemente también de su potencial oncogénico [25].

Sorprendentemente, poco se conoce acerca de las posibles funciones específicas para las dos principales isoformas ERK, ERK1 (p44) y ERK2 (P42). Estas dos proteínas son co-expresados en prácticamente todos los tejidos, pero con una notable abundancia relativa variable, ERK2 siendo la isoforma predominante en el cerebro y las células hematopoyéticas [12, 26, 27]. Dada la amplia identidad de aminoácidos entre las dos moléculas y su aparentemente similares espacio-temporales reglamento, el actual modelo de trabajo considera fundamentalmente como intercambiables. Sin embargo, importantes pruebas recientes sugieren que podría haber diferencias cuantitativas en ERK1 y ERK2 dinámica y que estos podrían tener un papel importante en su regulación. ERK1-ratones deficientes son viables, sin compensación evidente upregulation de ERK2 los niveles de proteína, sino que muestran un déficit en thymocyte maduración [28]. Un reciente de células T específicas de eliminatorias de ERK2 además apoya un papel crucial para la MAP-kinasa de señalización en el sistema inmunológico [29]. Por otra parte, ERK2 mundial de ratones deficientes mueren temprana en el desarrollo, lo que demuestra que ERK1 no puede compensar en el embrión de ERK2 [30 - 32].

Una posible interpretación de estos datos es que, aunque ERK2 es esencial para la transducción de señales, en lugar ERK1 podría tener un papel accesorio, posiblemente, que permiten a un ajuste de ERK2 actividad. Dos líneas de evidencia apoyan firmemente la idea de que ERK1 actos de una manera compleja, por lo menos en ciertas circunstancias, atenuantes de ERK2 actividad. En primer lugar, tanto en fibroblastos y en neuronas derivadas de ERK1-ratones deficientes, estímulo que dependen de la activación de ERK2 (pero no su actividad basal) resultó ser significativamente upregulated, como puso de manifiesto por el aumento del nivel de fosforilación y ERK2 inmediata y principios de la transcripción de genes [28, 33]. En segundo lugar, la mejora de ERK2 dependientes de señalización en el sistema nervioso de los ratones mutantes ERK1 se ha relacionado con la mejora de ciertas formas de aprendizaje y memoria [33].

Para investigar si esos mecanismos, también están implicadas en el control de la proliferación celular, activación de ERK examinado y las tasas de crecimiento tanto en ratones genéticamente alterados fibroblastos y el uso de ARN de interferencia (RNAi) tecnología [34 - 36].

Resultados y discusión
ERK2 mejoramiento de la señalización en ERK1 mutante fibroblastos prevé un crecimiento importante ventaja

Nuestro propio trabajo previo [33] ha demostrado que las neuronas en el nivel primario del sistema nervioso central, neurotransmisores estimulación se traduce en un importante hyperactivation de ERK2 en la ausencia de ERK1. Sobre la base de estas conclusiones, hemos propuesto un modelo de competencia entre ERK1 y ERK2 en su interacción con las aguas arriba quinasa MEK. Según este modelo, especuló que, en ausencia de ERK1, ERK2 piscina de moléculas pueden ser activados de manera más eficiente, lo que resulta en un aumento de abajo transmisión de la señal [33].

Ahora hemos observado también que en el suero de hambre embrión de ratón fibroblastos (MEFs) estimulada con un 20% de suero, ERK2 activación fue más sostenida en ERK1 células mutantes que en el control de fibroblastos (Figura 1a]. Cuando el suero de hambre MEFs fueron estimulados con el 20% de suero, ERK2 activación fue más sostenida en ERK1 células mutantes que en el control de fibroblastos (Figura 1a]. La cuantificación de tres experimentos independientes ERK2 muestra que la activación es aproximadamente dos veces mayor en ERK1 células mutantes que en las de tipo salvaje células (Figura 1b]. Aumento de activación de ERK2 también dio lugar a un aumento de la transcripción inmediata de principios de los genes, tales como c-fos y Zif-268, como se indica en la Figura 1c. A medida que el cambio observado en ERK2 en la activación de ERK1 mutante MEFs podría tener consecuencias a nivel de la proliferación celular, se les practicó un ensayo comparando la proliferación de tipo salvaje y ERK1 células mutantes en dos diferentes concentraciones séricas. Los resultados en la figura 1d sugieren claramente no sólo que ERK1 podría ser prescindible para la proliferación celular, sino también que su ausencia podría proporcionar un importante crecimiento ventaja. En conjunto, estos datos sugieren que la eliminación de ERK1 podría facilitar ERK2 dependientes de señalización, el crecimiento celular y la proliferación global en MEFs. Es importante destacar que los mismos resultados se obtuvieron con MEFs derivados de los ratones, ya sea backcrossed a C57Bl / 6 de antecedentes (siete generaciones) o en un fondo mixto (C57Bl / 6 y 129 SvJ), descartando un efecto de fondo genético (datos no presentados).

Knockdowns específicas de ERK1 y ERK2 demostrar una diferencia de función para los dos quinasas en la celda de señalización

Una de las limitaciones de la genética mundial de la fijación de metas de enfoque es que las adaptaciones con el tiempo pueda ocurrir en el ratón, que podría producir fenotipos secundarios que no están directamente ligados a la mutación. Por lo tanto, confirmar de manera independiente y ampliar los hallazgos anteriores, que tomó ventaja de la tecnología RNAi transitoria mediante la introducción de knockdowns (KD) de ERK1 y ERK2 [37 - 40]. ERK1 y ERK2 específicos de corto horquilla RNAs (shRNAs) se expresaron por medio de un vector lentiviral (LV) en MEFs bajo el control de la H1 promotor (figura 2a]. Expresión de ERK2 se redujo a menos del 10% de los de tipo silvestre, mientras que ERK1 se convirtió esencialmente indetectable (figura 2a]. LV Después de la infección y la posterior puromycin-resistencia de selección, las células se mueren de inanición o de suero y, posteriormente, estimulado con el 20% de suero. Como se muestra en la Figura 2b, aunque ERK1 KD dado lugar a un aumento significativo de la activación de ERK2 perfil, la pérdida de ERK2 sólo marginalmente afectados ERK1 fosforilación. Una cuantificación y la normalización de los datos se encuentra en la figura 2c. Para determinar las consecuencias de estos genes ablación experimentos en el crecimiento celular se realizó curvas de crecimiento en un 10% de suero de ERK1 y ERK2 KD KD células (Figura 2d]. Considerando que la inhibición de ERK2 reduce drásticamente el crecimiento celular, la pérdida de ERK1 facilita significativamente la proliferación. Estas observaciones están de acuerdo con los datos obtenidos en la ERK1 - / - MEFs (ver Figura 1] y un mayor apoyo posible papel modulador de esta cinasa en las células de control de señalización. Es importante destacar que la ablación de ERK2 es suficiente para ralentizar significativamente la proliferación celular, un fenotipo que se asemeja fuertemente el efecto de los inhibidores de MEK como PD98059 o UO126 ([41, 42] y revisado en [43]].

Diferencial MEK-ERK1 y ERK2 MEK-interacciones

Para seguir estudiando los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos observados en la fisiología celular de las dos cinasas ERK, que generó estable-ERK1 y ERK2-KD clones específicos en las células 3T3 NIH. Como se indica en la Figura 3 bis (panel izquierdo), el silenciamiento de una u otra ERK1 o ERK2 fue tan eficaz en las células 3T3 NIH como en MEFs y no alteró la expresión de la isoforma restante (Figura 3a, panel derecho). Por otra parte, expresión de oncogénico H-Ras Q61L no tuvo ningún efecto sobre los niveles de proteína de cualquiera de ERK1 o ERK2 (Figura 3b, panel derecho), independientemente de los antecedentes genéticos (tipo silvestre, ERK1 y ERK2 KD KD). La última prueba nos permitió poner a prueba directamente las consecuencias de ERK-silenciamiento de los genes específicos en un Ras-sensibilizados antecedentes (ver más abajo y Figura 4].

Una de las hipótesis del modelo de competencia que se activan en células MEK-ERK complejos deben contener preferentemente ERK2. Por otra parte, en ausencia de ERK1 podemos esperar a observar un aumento significativo de la MEK-ERK2 interacciones. Para investigar esta posibilidad, así como para proporcionar un apoyo directo para el modelo, hemos realizado immunoprecipitation estudios con un anticuerpo específico que reconoce tanto MEK isoformas y luego determina la composición de ERK1 y ERK2 en el complejo con dos antisueros. Como se indica en la Figura 3b, en ausencia de ERK1, ERK2 vinculante de la MEK, pero parece ligeramente aumentado significativamente. La cuantificación de tres experimentos en la figura 3c demuestra que ERK2 niveles asociados con MEK en ausencia de ERK1 son 70% más altos que en los extractos de control. Hemos detectado una proporción mucho menor cambio en los niveles de ERK1 en las células ERK2 KD (20%), sin embargo. Esto podría ser debido a una combinación de varios factores: la presencia de algunos ERK2 residual detectable proteína en el complejo de MEK ERK2 KD células, un menor nivel de expresión de ERK1 en comparación con ERK2, o potencialmente menor afinidad de ERK1 para MEK1 / 2.

ERK1 desmontables en las células 3T3 NIH facilita el crecimiento, mientras que ERK2 desmontables que inhibe

Cell-la progresión del ciclo está muy regulada en los organismos multicelulares, y la pérdida de cualquier mecanismo de regulación puede dar lugar a la formación de tumor. Las células cancerosas pueden crecer en varias capas y de anclaje en condiciones independientes, mostrando menos ordenado de crecimiento y la reducción de la célula-célula en contacto con la inhibición. Para determinar el papel de ERK1 y ERK2 en el crecimiento celular y mediada por Ras transformación, hicimos knockdowns de ambas isoformas ERK en células 3T3 NIH, ya sea en una de tipo salvaje o en oncogénico H-Ras Q61L fondo, y se lleva a cabo una colonia de formación ensayo, una prueba común para la transformación de células. En este ensayo, las células transformadas con oncogenes como Ras producir colonias de mayor tamaño que las células transfectadas con el vector por sí sola [44]. Es importante destacar que esta prueba no se basa en transfectants estable, como la selección y el puntaje se realizan dentro de los 10 días de transfección.

Representante de placas de cada transfección se muestran en la Figura 4 bis. El resumen de los datos se muestra en la Figura 4b indican claramente que ERK2 desmontables afecta negativamente tanto a Ras normal y mediada por el crecimiento celular. Aunque la pérdida de ERK1 ha causado un aumento significativo en el crecimiento de tipo silvestre células, sin embargo, el efecto de la ablación de este MAP quinasa en H-Ras Q61L que dependen de proliferación fue sorprendente marginales, e inesperadamente en la dirección de una pequeña disminución en vez que un aumento. Estos datos confirman que ERK1 puede modular negativamente el crecimiento de células normales en células 3T3 NIH. No obstante, parece que la pérdida de ERK1 KD ERK1 en las células no pueden seguir aumentando Ras-transformación mediada por células, sino más bien provoca un pequeño pero consistente reducción en las colonias producidas por este potente oncogen. A pesar de este hecho sugiere que la sobreexpresión de Ras oncogénico puede determinar un límite máximo efecto en la tasa de crecimiento celular, sino que también deja abierta la posibilidad de que en esas condiciones anormalmente altos de activación de señalización, ERK1 puede todavía tienen un papel cualitativamente similar al de ERK2 y podría ser positiva participan en la generación de células de proliferación respuestas.

Ectópico expresión de ERK1, pero no de resultados ERK2 en la inhibición de Ras-depende el crecimiento celular

Para proporcionar más independiente e invertir el proceso de confirmación de que la bioquímica y la proliferación de los efectos observados en la ERK1 mutante MEFs y ERK1 desmontables NIH 3T3 células están directamente relacionadas con el nivel de expresión de esta proteína, establecimos NIH 3T3 clones que expresan individualmente ERK1, ERK2, ERK1 K72R ( una kinasa-forma defectuosa), p38 SAPK1 (estrés activa la proteína quinasa, un control negativo) y H-Ras Q61L, todos etiquetados epítopo (Figura 5a]. Todas las construcciones se expresaron en niveles comparables. La proliferación perfil independiente de tres clones por genotipo se muestra en la Figura 5b. Ras Q61L proporcionó una importante ventaja para el crecimiento NIH 3T3 clones, pero ninguna de las otras construcciones afectadas por sí solas los niveles basales de la proliferación celular. Estos datos sugieren que ni ERK1 ni ERK2 sobreexpresión de por sí puede alterar la proliferación de células untransformed. Esto está en marcado contraste con el RNAi datos (ver Figura 4] y con el efecto de la MEK UO126 inhibidor sobre el crecimiento de tipo silvestre células (Figura 5b]. Posiblemente, los niveles de proteína logrados en relación con un leve nivel de expresión ectópica ERK1 no son suficientes para alterar el MEK-ERK2 en la relación estado basal. También es posible, sin embargo, que el efecto de ERK1 podría ser desenmascarada en condiciones de crecimiento desregulado, como en la presencia de Ras oncogénico.

Por lo tanto, la próxima pregunta si la expresión ectópica de estas quinasas podría interferir con el crecimiento de las células transformadas, mediante el examen de la doble de crecimiento que contengan transfectants Ras oncogénico y uno de los de tipo salvaje o mutante cinasas descrita anteriormente. La idea, tomada de anteriores estudios genéticos en Drosophila y en el ratón, es posible que el efecto de una «modulador» del crecimiento celular podría ser manifiesta en un fondo sensibilizados, aquí proporcionada por Ras Q61L. Sorprendentemente, la expresión de ERK1 quinasa se tradujo en una importante reversión de la proliferación de células efecto causado por Ras oncogénico, mientras que ERK2 ni tampoco p38 parece afectar a la tasa general de crecimiento (Figura 5c, d].

Estos datos indican que la expresión de proteínas ERK1 contrarresta Ras dependientes de la transformación celular. Es importante destacar que, este efecto parece ser en gran medida independiente de la kinasa ERK1 actividad sino más bien se debe a la proteína-proteína interacción, como el ERK1 K72R mutante era casi tan eficaz como de tipo salvaje ERK1. Sorprendentemente, la sobreexpresión de ERK2 tiene poco efecto sobre la proliferación de las células, lo que sugiere que los niveles de esta proteína no son tipo de limitación, al menos en este tipo de células.

Ectópico expresión de ERK1 atenúa Ras-dependiente del crecimiento en los ensayos de transformación

Para confirmar aún más el papel de ERK1 y ERK2 en Ras-dependiente de células de transformación, tanto transfectadas transitoriamente ERK isoformas en células 3T3 NIH y se lleva a cabo ensayos de formación de colonias. Ras oncogénico (Ras Q61L) fue co-transfectadas en células 3T3 NIH con un control de vectores (pMEX) solo o con un vector que contengan cualquiera de ERK1, ERK2, o p38. Resumen de resultados después de 10 días se muestran y su cuantificación en la figura 6a. Ras Q61L solo inducido un mayor número de grandes colonias que el control de vectores, mientras que ERK1, ERK2 y p38 por sí solo no difieren de las de control, indicando que la simple expresión ectópica de estas quinasas no es suficiente para cambiar la tasa de proliferación de células 3T3 NIH. Cuando se co-transfectadas con Ras Q61L, sin embargo, ERK1 inducido una reducción significativa del número de grandes colonias en comparación con Q61L Ras, mientras que los de tipo salvaje ERK2 y p38 co-transfectadas con Ras Q61L tuvo poco efecto. Representante placas se muestran en la Figura 6c.

Como se observa en la Figura 5, expresión de una quinasa defectuosa-mutante de ERK1 resultó ser muy eficaz para inhibir la proliferación celular en NIH 3T3. Esta observación es consistente con los MEK-ERK modelo de competencia, como una de las predicciones de este modelo es que una quinasa de forma defectuosa de ERK1 debe desplazar eficientemente la proteína endógena ERK2 de MEK y, por tanto, reducir de forma significativa la producción global de señalización. También se especuló, no obstante, que una kinasa-defectuoso mutante de ERK2 debe actuar como un inhibidor endógeno de ERK2 y que su efecto podría ser aún más pronunciada que la causada por ERK1. Para probar esta hipótesis que generó un muerto-kinasa ERK2 mutante, ERK2 K52R, y se comparó su efecto en la formación de colonias de ensayo con la de la ERK1 K72R mutante [45]. Como se muestra en la Figura 6b, tanto ERK-quinasa defectuosa mutantes eran muy eficaces en la reducción de Ras oncogénico mediado por la formación de colonias, pero ERK2 K52R provocado una casi total inhibición de ERK1 K72R que redujo el crecimiento a sólo el 40% del total.

Estos datos más apoyo la idea de que ERK1 y ERK2 competir por la unión a MEK y por lo tanto, que su nivel de expresión es fundamental para el ajuste de la producción de señalización. Es importante destacar que resultados similares se obtuvieron con una proliferación in vitro de ensayo, el ensayo de agar blando (datos no presentados).

ERK1 atenúa Ras dependientes de la formación de tumores en ratones desnudos

NIH 3T3 células normalmente muestran una baja tumorigenicity, pero cuando transfectadas con un oncogén Ras como Q61L, adquieren la capacidad de inducir la formación de tumores en inmunodeficientes, athymic mice (ratones desnudos) [46]. Por lo tanto, decidió realizar una tumorigenicity ensayo para poner a prueba la capacidad de ERK1 para reducir la transformación celular y la formación de tumores in vivo. NIH 3T3 clones transfectadas establemente con Ras Q61L o ERK1, ERK1 K72R, ERK2 o p38 se realizarán las pruebas de transgénicos y, posteriormente, expresión utilizada en el ensayo (Figura 7].

Para estudiar el crecimiento del tumor hemos utilizado masculino, 4 - a 6 semanas de edad athymic nude mice. Las células de cada clon se inyecta por vía subcutánea en cada flanco de los ratones desnudos, usando cinco animales por cada clon. Desnudo ratones fueron examinados todos los días y el tamaño del tumor se registró desde el día 4 a 9, como se indica en la Figura 7b. Aunque ambos Ras-Q61L transformado células y células doble-ERK2 transfectadas con p38 o producido grandes tumores, las células doble-transfectadas con cualquiera de ERK1 o ERK1 K72R producido significativamente más pequeños.

El experimento se dio por terminada 10 días después de la inyección y los tumores fueron retirados y pesado. Representante explante tamaños se muestran en la Figura 7c y el peso medio de datos de dos experimentos se muestran en la Figura 7d. Aunque los ratones inyectados con células de control de vectores no desarrollaron tumores, todos los otros animales lo hizo. Los tumores de los ratones inyectados con células 3T3 NIH cotransfected con Ras Q61L y ERK1 o ERK1 K72R, sin embargo, fueron significativamente más pequeños (los medios de 0,32 g y 0,29 g, respectivamente) que los obtenidos a partir de ratones inyectados con Ras Q61L (1,2 g, p < 0,001 para ambas comparaciones). No se observaron diferencias significativas cuando se comparan los tumores en vez de ratones inyectados con Ras Q61L solo y doble transfectants con ERK2 o p38 (1,04 g y 0,98 g en promedio, respectivamente).

Estos datos en tumorigenicity in vivo confirman plenamente los resultados de la in vitro funcionales de ensayo, lo que indica un potencial de lucha contra el papel oncogénico de ERK1 en su habilidad para reducir el Ras-transformación mediada por células tumorales y formación, al menos en este sistema experimental.

Como prueba final, se analizaron las biopsias de los ratones desnudos de Western Blot para confirmar que una clara correlación podría ser demostrada entre el crecimiento anormal y ERK2 en la activación de los tumores (Figura 8a, b]. Como era de esperar, endógeno ERK2 fosforilación fue muy upregulated en Ras Q61L muestras y doble transfectants con ERK2 y p38. Doble transfectants con cualquiera de ERK1 o ERK1 K72R mostraron significativamente menos pronunciada activación de ERK2, sin embargo, lo que sugiere un vínculo directo a su potencial carcinogénico.

Conclusión

La reciente generación de ratones con mutaciones específicas de la ERK1 y ERK2 genes ha proporcionado una excelente oportunidad para determinar el nivel de redundancia y superposición de funciones entre estos dos grandes MAP quinasa isoformas. ERK1 ratones mutantes tienen un fenotipo sorprendentemente suave que ERK2 mutantes, que mueren a principios de desarrollo [28, 30 - 32]. A nivel molecular, una de las más intrigantes características de ERK1 deficiencia de células es el mayor estímulo que dependen de la activación de ERK2 en ausencia de cualquier aumento compensatorio en los niveles de proteína ERK2. Creemos que este efecto se debe en gran parte a una competencia entre ERK1 y ERK2 en vinculante para los ascendentes quinasa MEK. En un informe anterior [33] que apoya esta afirmación al mostrar que la quinasa defectuosa-ERK1 K72R mutante es tan eficaz como de tipo salvaje ERK1 en rescatar el fenotipo en ERK1 déficit de MEFs [33]. El objetivo del presente trabajo fue ampliar los resultados preliminares y explorar la posibilidad de que ERK1 actos, por lo menos en ciertos entornos móviles, como un modulador negativo de la proliferación celular, interfiriendo con Ras-ERK2 dependientes de señalización. En primer lugar se analizaron las tasas de crecimiento de MEFs obtenidos a partir de ERK1-animales con deficiencia. En ausencia de ERK1, MEFs proliferan más rápidamente que las células control. En consecuencia, mientras que ERK1 desmontables de RNAi en ambos MEFs y NIH 3T3 células facilita el crecimiento celular, ERK2 silenciar las causas graves de proliferación de células déficit. Por el contrario, una leve sobre-expresión de ERK1 es suficiente para ralentizar el crecimiento celular mediada por Ras oncogénico, y esto perjudica ERK2 concomitantemente la activación. Este efecto inhibidor de ERK1, que no pueden ser alcanzados por ectópica expresar ERK2, también afecta a la capacidad de Ras oncogénico para transformar las células NIH 3T3 en los ensayos funcionales, tales como la formación de colonias y han causado tumores en ratones desnudos. ERK1 parece actuar por el desplazamiento de ERK2 aguas arriba de la quinasa MEK en lugar de mediante la regulación de efectores corriente abajo, como una kinasa-forma inactiva de ERK1 es igualmente eficaz en el origen de los fenotipos observados. Esta hipótesis está también directamente apoyado por la observación de que en ERK1 déficit de fibroblastos, la cantidad de MEK-ERK2 complejos ha aumentado significativamente.

La hipótesis de que las moléculas de señalización pueden actuar como agentes titrating, secuestrar los componentes centrales de la maquinaria de señalización, ya ha adquirido cierta experimental de apoyo. Por ejemplo, Rap1, una relacionada con el Ras GTPase pequeño, fue originalmente identificado como un supresor del K-Ras-transformación mediada porque cuando overexpressed NIH 3T3 en células que se une con gran afinidad por Raf-1 y, por tanto, las trampas de este río abajo Ras en un efector complejos inactivos ([47] y revisado en [48, 49]]. Por otra parte, un papel de provocación sugirió en 2001 [46] que de tipo salvaje K-ras proteína podría actuar como un supresor de tumor oncogénico K-Ras. Además, algunos B-Raf-quinasa defectuosa mutantes pueden ser altamente cancerígenos, ya que interactúan con la naturaleza de tipo c-Raf-1 y, por tanto, activar MEKs con mayor actividad [25].

Nuestra observación de que ERK1 puede interferir con ERK2 señalización dependiente de la continuación de estas piezas de evidencia, pero algunas características específicas de nuestros resultados debería ser destacado. En primer lugar, ninguna mutación en la proteína ERK1 parece ser necesario para ejercer el efecto en la fosforilación ERK2, como puede verse simplemente overexpressing de tipo salvaje ERK1. En segundo lugar, la actividad enzimática no es estrictamente necesario, según lo indicado por el efecto de ERK1 K72R. Es importante destacar que la homóloga-quinasa muertos mutante de ERK2, ERK2 K52R, es aún más eficaz en interferir con endógeno ERK señalización, porque fomentan la competencia modelo. En tercer lugar, completar la ablación de ERK1 de células es suficiente para proporcionar una ventaja importante crecimiento, tanto en primaria y fibroblastos cultivados células 3T3 NIH, a pesar de esta manipulación es ineficaz en la promoción de Ras oncogénico mediado por la transformación. En cuarto lugar, la sobreexpresión de ERK1 no afecta el crecimiento normal, pero que sólo depende de Ras oncogénico. Todas estas observaciones tienen que ser explicado por un detallado celulares y bioquímicos modelo de regulación ERK, que va más allá del presente trabajo.

Por cierto, otros mecanismos de regulación es probable que sean en su lugar y para contribuir de forma significativa a las diferencias funcionales entre ERK1 y ERK2. Por ejemplo, la tasa de translocación, dephosphorylation y el secuestro en el núcleo de las dos proteínas ERK podría ser diferente. A pesar de nuestros experimentos con los dos-quinasa defectuosa mutantes sugieren que la proteína-proteína interacciones en la ausencia de actividad quinasa son dominantes en el proceso, es formalmente posible que las pequeñas diferencias en la especificidad por el sustrato también podría contribuir en parte a aspectos específicos de la fisiología celular controlada por las dos isoformas. Otro aspecto importante que debe tomarse en consideración en el futuro es la posible función de los complejos andamios en la regulación diferencial de ERK1, ERK2 y MEK interacciones (revisado en [50, 51]]. Esta posibilidad fue sugerida previamente por computacional estudios que revelen que una concentración óptima de proteínas de andamiaje en relación con sus socios quinasa es siempre necesaria para maximizar la producción de señalización. Las alteraciones de la relación de ERK1/ERK2 a MEK y para cualquier andamiaje de proteínas en la célula, por lo tanto, podría afectar el umbral de propiedades del sistema y contribuir a algunos de los no-lineal respuestas celulares [52, 53].

A pesar de estas cuestiones pendientes y las limitaciones de nuestro enfoque experimental, creemos que hemos identificado al menos una nueva, posiblemente aspecto importante de ERK reglamento. Estamos empezando a descubrir un sistema de complejidad poco apreciado anteriormente, con la participación de interacciones dinámicas de MEK1 / 2, ERK1 y ERK2. La labor futura en la biofísicos y computacionales nivel será, sin duda, necesaria para aclarar estos mecanismos importantes.

Materiales y métodos
Plásmido construcción

Para generar los plásmidos estable para RNAi, oligonucleótidos codificación shRNAs contra ERK1, ERK2 y las formas conexas de secuencias de control codificado se compraron de VBC Genómica (Viena, Austria), annealed y clonado en BGL II y Xho I sitios bajo el control de una constituyente humanos H1 promotor ( pSUPER_Puro) [37]. Un conjunto de seis 19-mer shRNAs para cada gen MAP kinasa fue diseñado como se describe [54] y probado, y los más eficientes fueron elegidos. Los siguientes se utilizaron oligonucleótidos (texto en negritas indica la secuencia dirigida a la región de codificación que crea el tallo de cada shRNA; texto subrayado indica las mutaciones puntuales): en lugar de ratón ERK1, 5'-GATCCCC GACCGGATGTTAACCTTCA TTCAAGAGA TGAAGGTTAACACCGGTC TTTTTGGAAA-3 'y 5' - AGCTTTTCCAAAAA GACCGGATGTTAACCTTCA TCTCTTGAA TGAAGGTTAACATCCGGTC GGG-3 ', dirigido a exón 7; para ratón ERK2, 5'-GATCCCC GTACAGAGCTCCAGAAATT TTCAAGAGA AATTTCTGGAGCTCTGTAC TTTTTGGAAA-3' y 5'-AGCTTTTCCAAAAA GTACAGAGCTCCAGAAATT TCTCTTGAA AATTTCTGGAGCTCTGTAC GGG-3 ', dirigido a exón 4; para el control de ERK1 , 5'-GATCCCC GACCGGAT AG TAACCTTCA TTCAAGAGA TGAAGGTTA CT ATCCGGTC TTTTTGGAAC-3 'y 5'-TCGAGTTCCAAAAA GACCGGAT AG TAACCTTCA TCTCTTGAA TGAAGGTTA CT ATCCGGTC GGG-3'; para el control de ERK2, 5'-GATCCCC GTACAGAGC GT CAGAAATT TTCAAGAGA AATTTCTG AC GCTCTGTACT TTTTGGAAC -3 'Y 5'-TCGAGTTCCAAAAA GTACAGAGC GT CAGAAATT TCTCTTGAA AATTTCTG AC GCTCTGTAC GGG-3'.

Todos los lentiviral construcciones se construyeron a partir de plásmido pCCLsin.cPPT.PGK.eGFP.WPRE, tal y como se describe en otro lugar [55]. Para la clonación en VL, cada shRNA-H1/mPGK-Puro casete fue cortado a partir de vectores y pSUPER_Puro clonado en el Bam HI / I Cla sitio del vector. Aumento de proteína verde fluorescente (eGFP) fue removido de Bam HI / Sal I digestión, entonces el vector fue mitigado y la libre ligated.

Por ectópico expresión en la formación de colonias de ensayo, un ratón ERK1, ERK1 K72R, ERK2 y ERK2 K52R se epítopo de etiquetado en el amino terminal con la hemaglutinina y clonado en el pMex Neo-R expresión vector. Un oncogénico forma de H-Ras (H-Ras Q61L) fue Myc en lugar de etiquetado y también clonado en el pMex Neo-R expresión vector.

Vector viral producción y titulación

VSV-pseudotyped de tercera generación VL fueron producidos por transitorios de cuatro cotransfection plásmido en las células 293T usando el método de fosfato de calcio y purificada por ultracentrifugación, con la modificación que 1 mM butirato sódico se añadió a las culturas para la recogida de vectores. Sobrenadantes se recogieron 48 h después de transfección, filtrada a través de una membrana de 0,22 mm y se concentró por ultracentrifugación, tal como se describe [56].

El número medio de partículas vector viral se mide por el VIH-1 gag antígeno p24 inmunocaptura ensayo (NEN Life Science Products, Boston, EE.UU.) y el título viral fue determinada por PCR en tiempo real [57].

Cultivo celular y bioquímica

MEF se prepararon las culturas de tipo silvestre y knockout de embriones embriones a 13,5 días. Las células en las primeras pasajes fueron suero de hambre durante 24 horas y luego estimulados con un 20% de suero para distintos momentos; proteínas se extrajeron y analizaron por SDS-PAGE y Western Blot [33]. Para la protección de la RNasa ensayo, la extracción de RNA y análisis de monocapa celular estimulada se realizó tal como está descrita anteriormente [58]. Por la proliferación de células de estudios en MEFs o células 3T3 NIH, 1,25 × 10 5 células fueron sembradas en cada una de seis y placa en el día 1 y mantenerse en Dulbecco modificado Eagle's Medium (DMEM) a diferentes concentraciones séricas, con 2 μ g / ml si puromycin requerido. Medio se cambió todos los días. Duplicados de las muestras de suero para cada concentración y para cada genotipo se contabilizan cada día durante 5 días usando una cámara de Burker contar. Para la bioquímica, NIH 3T3 células fueron transfectadas con pSUPER_Puro-shRNAs o con la hemaglutinina epítopo de etiquetado ERK1, ERK1 K72R, ERK2, p38 y epítopo-Myc etiquetados H-Ras Q61L clonado en el pMex Neo-R vector de la precipitación de fosfato de calcio [59] . Estable transfectants se obtuvieron tras una selección realizada en G418 (Geneticin, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) o puromycin (Clontech, Mountain View, EE.UU.).

Immunoprecipitation ensayo

NIH 3T3 células fueron transfectadas establemente con ERK1 y ERK2 desmontables o de control de plásmidos. Las células fueron lavadas con helado de buffer fosfato salino antes de la extracción en 1 ml de amortiguador de lisis (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, el 10% de glicerol, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Tritón X-100, 2 mM MgCl 2, 50 mM NaF, 10 μ M Na 3 VO 4) que contiene 0,2 mm fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) y 1 × COMPLETO cóctel de inhibidores de la proteína (Roche, Basilea, Suiza). Los extractos fueron a 14000 g durante 5 min a 4 ° C. Igual cantidad de cada proteína lisado (5 mg) se pre-limpiado con ExtraCruz-F immunoprecipitation (IP) matriz (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) durante 30 min a 4 ° C y se incubaron por un período adicional de 1 h con policlonal anti - MEK-1 / 2 anticuerpos (sc-436, Santa Cruz) complejos con la matriz de propiedad intelectual. Inmune complejos se han recogido y lavar tres veces con tampón de lisis, y el Western Blot se realizó con policlonal anti-ERK1 (SC-94) y anti-ERK2 (sc-153) anticuerpos (Santa Cruz), que preferentemente reconocer ERK1 y ERK2, respectivamente .

Formación de colonias de ensayo en células NIH 3T3

Colonia formación ensayos se realizaron tal como está descrita anteriormente [44]. En el día 0, NIH 3T3 células fueron sembradas en 100 mm de placas, 1,5 × 10 5 células por placa, y fueron transfectadas al día siguiente. Dos días después de transfección, las células fueron trypsinized y chapada a 100 mm placas, 10 3 células por placa en DMEM que contenga 10% de bovinos de suero de ternera y 500 mg / ml G418 para la selección de neomicina células resistentes. Cada muestra fue transfección chapada en cuatro platos. Medio se cambió cada 3 días y después de 10 días clones fueron lavadas con agua y fijadas en formol al 10% (Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.) durante 10 min. Las placas fueron entonces una vez lavadas con agua y manchado durante 5 min en el 0,5% de cristal violeta (Fluka, Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.) en el 20% de metanol y, por último, se lavan con agua para eliminar la coloración de fondo. Las imágenes fueron adquiridas con un escáner y todas las colonias más grandes entonces en 1,5 mm de diámetro fueron contados.

Tumorigenicity ensayo en ratones desnudos

G418-positivas clones seleccionados como se ha descrito anteriormente se utilizaban para la tumorigenicity ensayo [46]. 1 × 10 6 células de cada clon en el diario de la fase de crecimiento se inyecta por vía subcutánea en cada uno de los dos flancos de los hombres 4 - a 6 semanas de edad athymic nude mice. Para cada clon cinco animales fueron utilizados. El desnudo ratones fueron examinados todos los días y tamaños de tumor se registraron. El experimento se dio por terminada 10 días después de la inyección, los animales fueron sacrificados y los tumores fueron retirados y pesado.

Agradecimientos

Damos las gracias a Rony Seger, Gimmi Ratto, Jacques Pouysségur, Gilles Pagès y Paul Orban de crítica y útil la lectura del manuscrito y Mario Amendola y Monica Martignoni por su excelente apoyo técnico. Esta labor fue apoyada por la Federación Italiana de Investigaciones sobre el Cáncer (FIRC) y por el Ministerio italiano de la Universidad y la Investigación (MIUR), al presupuesto ordinario.