Journal of Biology, 2006; 5(6): 20-20 (más artículos en esta revista)

De alta resolución de imagen cuantitativa de mamíferos y células bacterianas mediante isótopos estables espectrometría de masas

BioMed Central
Claude Lechene (cpl@harvard.edu) [1], Francois Hillion (hillion@cameca.fr) [2], Greg McMahon (gmcmahon@rics.bwh.harvard.edu) [1], Douglas Benson (dougbenson @ nc. rr.com) [3], Alan M Kleinfeld (akleinfeld@tpims.org) [4], J Patrick Kampf (pKampf@tpims.org) [4], Daniel Distel (distel@oglf.org) [5], Yvette Luyten (luyten@neb.com) [5], Joseph Bonventre (joseph_bonventre@hms.harvard.edu) [6], Dirk Hentschel (dhentschel@partners.org) [6], Moo Kwon Park (Parkkwonmoo@yahoo.com) [6], Susumu Ito (susumu1919@aol.com) [7], Martin Schwartz (maschwartz@virginia.edu) [8], Gilles Benichou (gilles@vision.eri.harvard.edu) [9], Georges Slodzian ( slodzian@csnsm.in2p3.fr) [10]
[1] Nacional de Recursos para la Imagen Espectrometría de Masas, Facultad de Medicina de Harvard y el Departamento de Medicina, Brigham and Women's Hospital, Cambridge, MA 02139, EE.UU.
[2] Cameca, 29 Quai des Gresillons, 92622 Gennevilliers Cedex, Francia
[3] NSee Inc, 106 Greenhaven Lane, Cary, NC 27511, EE.UU.
[4] Torrey Pines Institute for Molecular Studies, San Diego, CA 92121, EE.UU.
[5] Océano Genoma Legacy Foundation, Ipswich, MA 01938, EE.UU.
[6] Facultad de Medicina de Harvard y Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA 02115, EE.UU.
[7] Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA 02115, EE.UU.
[8] Departamento de Microbiología, Universidad de Virginia, Charlottesville, VA 22908, EE.UU.
[9] Facultad de Medicina de Harvard y el Departamento de Cirugía, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA 02114, EE.UU.
[10] Universite Paris-Sud, Centre de Spectrométrie Nucléaire et de Spectrométrie de Masse, 91406 Orsay, Francia

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Resumen
Fondo

Secundaria-espectrometría de masas de iones (SIMS) es una herramienta importante para investigar la composición isotópica en la industria química y las ciencias de los materiales, pero su uso en la biología se ha visto limitada por consideraciones técnicas. Multi-isótopo de imágenes espectrometría de masas (MIMS), que combina una nueva generación de SIMS sofisticado instrumento con óptica de iones, etiquetado con isótopos estables, y cuantitativos de análisis de imagen de software, fue desarrollado para estudiar los materiales biológicos.

Resultados

El nuevo instrumento permite la producción en masa de imágenes de alta resolución lateral (abajo a 33 nm), así como el recuento o la imagen de varios isótopos simultáneamente. Como MIMS puede distinguir entre los iones de masas muy similares, como la 12 C 15 N - y 13 C 14 N -, que permite la precisa y reproducible de medición de relaciones isotópicas, y por lo tanto de los niveles de enriquecimiento isotópico específicas en las etiquetas, dentro de los volúmenes de menos de un micrómetro cúbico. La sensibilidad de MIMS es al menos 1000 veces mayor que la de 14 C autorradiografía. La profundidad de resolución pueda ser inferior a 1 nm debido a que sólo unos pocos capas atómicas son necesarios para crear una imagen de masa atómica. Nos ilustran la utilización de MIMS etiqueta a la imagen de mamíferos cultivadas células y tejidos secciones, para analizar de ácidos grasos en el adipocito transporte gotitas de lípidos utilizando 13 C-ácido oleico; para examinar la fijación de nitrógeno en bacterias utilizando 15 N nitrógeno gaseoso; para medir los niveles de proteína renovación en la cóclea y en post-isquémico utilizando células de riñón 15 N-leucina; estudio de ADN a ARN y co-distribución y la uridina incorporación en el nucleolo utilizando 15 N-uridina y 81 Br bromodeoxyuridine de 14 o C-timidina; a revelar dominios en cultivos de células endoteliales mediante el nativo isótopos 12 C, 16 O, 14 N y 31 de P, y realizar el seguimiento de unos 15 N-etiquetados de donantes de células del bazo en los nódulos linfáticos de la acogida del ratón.

Conclusión

MIMS hace posible por primera vez a ambos la imagen y cuantificar las moléculas marcadas con estables o isótopos radiactivos dentro de los compartimentos subcelulares.

Fondo

El descubrimiento fundamental de que las proteínas en los tejidos biológicos se encuentran en un estado dinámico se hizo a fines del 1930 utilizando una costumbre construido espectrómetro de masa para medir la incorporación de proteínas en el isótopo estable de nitrógeno 15 N [1], que se imparte en la dieta del ratón 15 como N-leucina y utilizarse como un marcador de aminoácidos. Estos estudios seminales no podía aplicarse en el nivel subcelular, ya que no existía metodología, al mismo tiempo, imagen y cuantifican un isótopo estable y porque no hay sentido de isótopos radiactivos de nitrógeno. Imágenes de isótopos estables de distribución ha sido posible, sin embargo, desde el desarrollo de masa filtrada de emisión de iones secundarios usando microscopía de iones de Castaing y Slodzian [2], que forma parte de la técnica más tarde el nombre de iones secundarios-espectrometría de masas (SIMS). Con esta técnica, un haz de iones (el principal del haz de iones de litio) se utiliza como una sonda a la superficie sputter capas atómicas de la muestra en átomos o agrupaciones atómicas, una pequeña fracción de los cuales son ionizado (Figura 1] [3]. Estos iones secundarios, que son característicos de la composición de la región analizados, se puede manipular con la óptica de iones del mismo modo que la luz visible puede ser con lentes de cristal y prismas. En un instrumento SIMS, los iones secundarios están separados de acuerdo a misa y luego se utilizará para medir una secundaria de iones de litio actual o crear una masa atómica cuantitativa imagen de la superficie analizada. SIMS se ha convertido en una herramienta fundamental en la superficie de semiconductores y de la ciencia estudios [4], geoquímica [5, 6], la caracterización de la materia orgánica [7], y Cosmoquímica [8, 9].

Aunque ha habido una labor pionera utilizando SIMS en la biología [10 - 14], SIMS tecnología, hasta ahora, ha presentado irreconciliables intercambios [15] que han limitado severamente su uso como una importante herramienta de descubrimiento en la investigación biomédica. Para realizar secundaria-ion metodología posible para localizar y medir los isótopos en las etiquetas subcelular volúmenes, cuatro grandes cuestiones deben ser abordadas. En primer lugar, para producir imágenes ultraestructurales cuantitativo, la técnica debe tener suficientemente alta resolución espacial, y la cuantificación y la imagen deben estar asociados. En segundo lugar, porque la cuantificación de etiqueta implica medir el exceso de un isótopo etiqueta por encima de su aparición natural, y este exceso se calcula por la proporción de dos isótopos, los datos de los dos isótopos deben registrarse simultáneamente, en paralelo, y de exactamente la misma región de la muestra (es decir, a registrarse). Esto es para asegurar que los cambios en instrumento o muestra las condiciones no dan lugar a errores en el cálculo de relaciones isotópicas. En tercer lugar, porque el nitrógeno tiene un electrón afinidad de cero, N - iones no forman; nitrógeno, por lo tanto, debe ser detectada como iones de cianuro (CN -). En consecuencia, con el fin de utilizar los isótopos estables 15 N como una etiqueta, la masa de resolución del instrumento debe ser lo suficientemente alta para separar los iones 12 C 15 N - y 13 C 14 N -, que tienen el mismo número de masa 27 , Pero no tienen exactamente el mismo peso masa atómica: 0,00632 diferentes de unidad de masa, a menos de 1 parte en 4000. Por último, la masa de alta resolución no debe hacerse a expensas de la secundaria-ion actuales, la transmisión secundaria de iones de muestra para detector debe ser lo suficientemente alto como para permitir la recopilación de datos de sub-micrómetro cúbico de volumen y en una cantidad razonable de tiempo.

Estos cuatro requisitos anteriormente requieren un inalcanzable combinación de capacidades instrumentales, con la capacidad para reunir grandes cantidades de iones secundarios en masa de alta resolución, detección paralelo de varios iones secundarios, de alta resolución lateral y de alta precisión de las mediciones. Una nueva generación de secundaria-espectrómetro de masas de iones ha sido desarrollado que pueden medir varios masas de iones en paralelo, tiene una masa de alta resolución (masa / masa cambio en proporción de aproximadamente 10000) en secundaria alta de iones de litio de transmisión relativa (70-80% ), Y tiene una alta resolución lateral, frente a 33 nm [16, 17]. En este artículo presentamos algunas aplicaciones biológicas de esta nueva tecnología. Estas extraordinarias capacidades nos permiten, por ejemplo, a imagen y medida de forma paralela la distribución intracelular de moléculas marcadas con isótopos estables del N 15 o 13 C porque podemos separar las especies isobárica (es decir, la especie con la misma masa atómica): 12 C 15 N - del 13 C 14 N - o 13 - de 12 C 1 H -. Debido a que las imágenes se producen en paralelo de la misma sputtered volumen que se encuentran en registro exacto entre sí y con estas características son necesarios para la obtención de masa atómica cuantitativa imágenes. Una imagen cuantitativa de masa contiene cada píxel a un número de cuenta, que son una medida de la masa atómica seleccionados y son directamente proporcionales a la masa atómica seleccionado abundancia en la muestra, en un lugar correspondiente a la dirección pixel. Condes de varias masas atómicas, originarios de la misma localidad en la muestra, se pueden grabar de forma paralela a la misma dirección de píxel, lo que nos permite obtener significativas relaciones isotópicas. Relaciones isotópicas son el núcleo fundamental de la metodología. Cuando la muestra ha sido etiquetados con un determinado isótopo, una proporción superior a su abundancia natural, indica la presencia del marcador de isótopos en un lugar determinado, así como medir su relativa exceso. Además, el alto stabilities de la viga principal, la óptica de iones, el espectrómetro de masas y los detectores de contribuir a mediciones muy precisas.

Hemos desarrollado el uso de esta nueva generación de SIMS, junto con los métodos de seguimiento y cuantitativos de análisis de imagen de software, para ubicar y medir las moléculas marcadas con isótopos estables en los compartimentos subcelulares, un desarrollo que nosotros llamamos multi-isótopo de imágenes espectrometría de masas (MIMS) . En este artículo presentamos una serie de ejemplos que muestran cómo MIMS pueden utilizarse para proporcionar imágenes de masa atómica de especímenes biológicos, y la forma en combinación con isótopos estables de etiquetado que proporciona información cualitativa y cuantitativa que no es posible obtener con otros métodos.

Resultados
Imágenes sin etiqueta de células y tejidos secciones

Una aplicación cualitativa de MIMS es de imágenes de alta resolución. Anatómica detallada imágenes pueden obtenerse en unstained, sin etiqueta usando las muestras de 12 C 14 N - de iones secundarios, como lo demuestra el análisis de una sección a través del ratón cóclea (Figura 2a-c]. Un fijo, unstained montado en la sección de silicio se examinó por primera vez utilizando la reflexión contraste diferencial de interferencia (RDIC) microscopía (figura 2a] para seleccionar las regiones de interés que pueden ser recuperados después de la muestra se oculta en el interior del instrumento SIMS. La masa imagen de la 12 C 14 N - sputtered iones de un 80 - μ m sobre el terreno correspondiente a la zona de caja en la Figura 2 se muestra en la Figura 2b, y la masa imagen de la 12 C 14 N - sputtered iones de un 20 - μ m subcampo de la Figura 2b se muestra en la Figura 2c. El contraste de estas imágenes en masa proporciona una muy detallada de la estructuras cocleares. Sólo unas pocas capas atómicas de la superficie de la muestra son sputtered mediante el mismo tipo de análisis condiciones (véase el debate y [archivo de datos adicional 1]). Así, aunque el método es nominalmente destructivas, podemos analizar el mismo campo repetitiva, hasta un total de decenas de horas o cientos de imágenes escaneadas, sin observar las alteraciones morfológicas en cifras brutas (datos no presentados). Una gran área de imagen puede ser relativamente rápido el fin de seleccionar a las regiones de interés para el análisis cuantitativo, como lo demuestra la reconstrucción de un ratón cóclea se muestra en la Figura 2d. La masa de imagen 12 C 14 N - iones se compone de diez piezas, adquiridas a lo largo de un total de 20 minutos, con cada azulejo adquirido a lo largo de una superficie de 100 × 100 μ m en 2 minutos. Todas las estructuras cocleares que cabría esperar para ver [18] son visibles, y son fáciles de identificar por comparación con las secciones histológicas convencionales.

La alta resolución espacial de MIMS se ilustra por su capacidad de imagen individual stereocilia, mechanosensory los orgánulos de las células ciliadas internas de la cóclea (Figura 2e; el campo analizado fue de 6 × 6 μ m). Las diversas estructuras intracelulares son fáciles de identificar mediante la comparación de la imagen con electrones micrográficas de la misma estructura. Estimamos que una resolución lateral mejor que 33 nm se puede lograr utilizando un método derivado de la "cuchilla" la técnica (véase el [archivo de datos adicional 2]). Debido a que la masa atómica imagen se forma utilizando sólo unas pocas capas atómicas de la muestra, la profundidad de resolución (resolución z) puede ser inferior a 1 nm, mucho mejor que la resolución que sería proporcionada por una delgada excepcionalmente-microscopía electrónica de la sección (10 NM). (En este documento, se define a fondo la resolución como la cantidad mínima de material que necesita ser sputtered para obtener una imagen de masa atómica.) Estudios de la misma con las dos secciones MIMS y microscopía electrónica - una técnica desarrollada para el estudio de polvo cósmico [19] -- Puede ayudar a proporcionar observaciones complementarias estructurales.

No sabemos a partir de primeros principios del mecanismo de cambio en la formación de masa atómica unstained imágenes de muestras. Una sorprendente observación de un intenso contraste observado con MIMS en masa 12 C 14 N, se muestra en la Figura 2g-i, puede orientar las investigaciones en este campo. Estábamos analizando un ratón de riñón cuando se observó una estructura contrasta brillantes, una circular «serpiente», a lo largo de la mucosa de la luz de una arteria. Es probable que esta región es la "elastica internacional 'como se describe en los textos de histología, una capa de tejido que normalmente es visible sólo después de que el tejido arterial ha sido especialmente manchada (Figura 2f]. El MIMS imágenes de la arteria en la Figura 2g-i se han obtenido sin que ello tinción especial. Las imágenes indican que esta estructura produce un alto rendimiento de 12 C 14 N - iones en comparación con las otras regiones de la arteria, y sugiere una relación entre la imagen obtenida y la composición molecular y la densidad.

MIMS puede utilizarse para visualizar toda la células, así como las secciones. Estas imágenes tienen un período de tres dimensiones apariencia, lo que demuestra que puede proporcionar MIMS escaneo atómica o molecular de iones en masa de imágenes con muestras de alivio, al igual que la microscopía electrónica de barrido. El lamellipodium de un bien propagación de células endoteliales imágenes de MIMS en masa 12 C 14 N se muestra en la Figura 2j, sino que aparece como una luz, hoja-como la estructura más oscuro con líneas que irradian desde el citoplasma a la frontera exterior de la lamellipodium. Por el contrario, si la polimerización de actina se encuentra bloqueado por el tratamiento citocalasina D, el 12 C 14 N masa imagen de una muestra de células endoteliales, pero no sólo lamellipodia delgada, pico-como las proyecciones en torno a la circunferencia de la célula, que son probablemente la mayoría de las fibras de retracción (Figura 2k] .

En conclusión, MIMS masa atómica imágenes de NC - iones en las muestras biológicas son muy contrastada, a pesar de que se obtienen sin ningún tipo de tinción. Las diversas estructuras son fáciles de identificar a un lateral de resolución de aproximadamente 33 nm, y la profundidad de resolución pueda ser tan pequeñas como unas pocas capas atómicas. El mayor campo que pueden ser imágenes es de aproximadamente 140 × 140 μ m, pero más grandes campos pueden ser documentados con rapidez mediante la adopción de una serie de imágenes por 1-2 minutos cada una. No hay ninguna máquina-requisito específico para la muestra, excepto un vacío que debe ser sostenido. MIMS porque es una superficie de métodos de análisis, se puede utilizar muchos tipos de muestras: por ejemplo, las células o tejidos secciones incrustadas en un medio, como el Epon, o células cultivadas directamente sobre un soporte que puede introducir en la cámara de análisis y preparado con cualquier técnica histológica habitual. El espesor de la muestra no es crítica, siempre que el depositado cargas eléctricas pueden ser disipada. La superficie analizada no tiene que ser plana, y se puede obtener SIMS imágenes tridimensionales muestras.

Etiquetado cuantitativo con isótopos estables

Una vez establecido que MIMS que puedan utilizarse para obtener la masa atómica unstained imágenes de objetos biológicos, esto nos llevó a desarrollar la característica única de MIMS: el análisis cuantitativo de los isótopos dentro de los compartimentos subcelulares. Ahora vamos a discutir la forma en que la técnica puede utilizarse para medir la incorporación de trazadores isotópicos en compartimentos de sub-micrómetro-cúbicos de volumen. Para ello, la muestra se etiqueta con isótopos estables como 15 N o 13 C, que están presentes a niveles muy inferiores, naturalmente, que su homólogo N 14 y 12 C isótopos, y cada isótopo se mide para determinar si está presente en un importe superior a su abundancia natural. Isótopos estables de etiquetado pueden utilizarse, por ejemplo, para llevar adelante los clásicos estudios de Schoenheimer en el nivel subcelular [1].

La abundancia de isótopos se mide mediante el registro de la secundaria-ion corrientes (cuenta / hora) obtenidos a partir de un par de isótopos, por ejemplo, 13 C y 12 C, el cálculo de la ratio y, a continuación, comparándolo con su abundancia natural ratio. En una muestra de control, que no ha recibido un exceso del isótopo trazador, los condes de cada isótopo se relacionan entre sí por su abundancia natural. En otras palabras, habrá una cifra de 13 o C, de 15 de N tal que 13 C / 12 C = 1,12%, o 15 N / 14 N (medido como 12 C 15 N / 12 C 14 N) = 0,367%, calculada a partir de los valores de sus respectivos abundancia natural. Esto significa que si se mide en paralelo, todas las condiciones de análisis es el mismo, el 15 N (12 C 15 N) contar con la tasa será 272 veces menor que el 14 N (12 C 14 N) contar.

Cualitativa de etiquetado con isótopos estables

MIMS metodología nos permite estudiar los aspectos espaciales de las rutas metabólicas y la relación espacial entre la replicación y transcripción. Como ejemplo, vamos a mostrar MIMS masa atómica de imágenes de la co-localización del ARN y ADN. Fibroblastos de embrión de rata fueron pulsados con 15 N-uridina y BrdU, marcadores de nueva síntesis del ARN y ADN, respectivamente. El grabado al mismo tiempo la distribución de 12 C 15 N - y 81 Br - se muestran en la Figura 7 bis, ter. Como era de esperar, la señal de bromo (ADN) está restringido a los núcleos celulares, existe una fuerte 81 Br etiquetado a lo largo de la envoltura nuclear y en todo el nucleolos (Figura 7b]. En contraste, el 12 C 15 N - señal (RNA) es fuerte en el nucleolos ya lo largo de la envoltura nuclear (Figura 7].

Una superposición de los 12 C 15 N - señal de color rojo con las 81 H. - señal de color verde muestra la co-localización de la nueva síntesis del ARN y ADN en amarillo (Figura 7c]. Esta co-localización, visualizar directamente desde el isótopo imágenes, evita las complicaciones potencialmente presentado por inmunoquímicas [33]. Localización de nueva síntesis del RNA requiere distinguir un local de más de 15 N sobre su aparición natural. Hemos llevado a cabo otro MIMS análisis de las mismas células para registrar las distribuciones de 12 C 14 N - y 12 C 15 N - en paralelo (en nuestro prototipo de instrumento, no podemos detectar simultáneamente la isobars 12 C 14 N - y 12 C 15 N -- Junto con 81 Br - debido a las trabas steric de la multiplicadores de electrones). La superposición de los 12 C 14 N - señal de color rojo con el 12 C 15 N - la señal en verde aparece el local excesos de 15 N por encima de su presencia natural en color amarillo (Figura 7d]. El color amarillo identifica la localización de 15 N-uridina-etiquetados nueva síntesis de ARN dentro de los nucleolos, a lo largo de la envoltura nuclear, y en el citoplasma de la célula de arriba.

La importancia de la detección y el paralelo relación isotópica de imágenes se ilustra por el texto siguiente observación fortuita. Se utilizó MIMS para estudiar la distribución de ARN en el nucleolo mediante el estudio de fibroblastos cultivados en presencia de 15 N-uridina. Cuantitativas en masa imágenes de 12 -, 12 C 14 N - y 12 C 15 N - iones secundarios fueron adquiridos en forma paralela. En los fibroblastos se muestra en la Figura 8, la membrana nuclear es claramente visible en masa 12 C 14 N - (Figura 8], y dos nucleolos son considerados altamente contrastadas masas a 12 C 14 N - y 12 C 15 N - (Figura 8 bis, b]. Paralelamente mayor resolución de imágenes en masa el nucleolo visto a la derecha en la figura 8 se muestra en la Figura 8c-e. En estas células embebidas en Epon - un polímero que carecen de nitrógeno - el 12 - la imagen (Figura 8c], muestra poco contraste con excepción de un terreno oscuro (diámetro de alrededor de 122 nm) a la media (Figura 8c, flecha roja, bajo el brillo indica baja cuenta). Este terreno fue causado por la exposición accidental de la muestra a una intensa estacionaria principal del haz de iones de litio. El sitio es también visto en los 12 C 14 N - y los 12 C 15 N - imágenes (Figura 8d, e]. El 12 C 15 N - imagen, sin embargo, contiene otras cuatro regiones oscuro (Figura 8e, flechas blancas), que van desde 200 a 280 nm de diámetro. Sin embargo, la proporción de isótopos y la derivación de HSI 12 C 15 N - y 12 C 14 N - imágenes distinguir claramente el oscuro terreno accidental, que tiene un alto nivel de 15 N incorporación, de los otros cuatro sub-regiones nucleolar, que tiene un nivel bajo de 15 N incorporación, sino que, por consiguiente, pueden ser adoptadas para nucleolar relacionados con la organización (Figura 8f, g]. También MIMS utilizado para evaluar la dosis y la respuesta de uridina incorporación en nucleolos de fibroblastos de embriones de rata cultivadas en presencia de 0.0, 0.01, 0.1, y 1.0 mM 15 N-uridina (Figura 8h], lo que demuestra que MIMS puede utilizarse para establecer un curva dosis-respuesta a nivel de organelos intracelulares.

El uso de MIMS sin etiquetado de isótopos para estudiar las diferencias en cifras brutas subcelular composición

Cuantitativas en masa imágenes de los elementos químicos dentro de una celda puede proporcionar información sobre la existencia y localización subcelular de dominios con graves diferencias en su composición. De este modo, incluso sin exponer a las células o los tejidos a isotópico moléculas marcadas, es posible obtener una medida de la composición celular en cifras brutas a nivel de microdomains que cubren las zonas de sub-micrómetro tamaño. Esto queda ilustrado por la superposición de imágenes de una célula endotelial analizados en paralelo durante 12 C -, 12 C 14 N - y 31 - (Figura 9]. Notables diferencias en los ingresos brutos composición dentro de una celda se revelan. La zona más el núcleo y la parte más gruesa del citoplasma es intensamente rojo, una indicación de comparativamente alto contenido en nitrógeno, la amplia zona en la periferia (el lamellipodium) es relativamente rico en fósforo y pobres en nitrógeno, y en el borde de mano la célula, hay relativamente más carbono que en la gran parte de la lamellipodium. Short, delgada protuberancias con un relativamente alto de nitrógeno señal también se puede ver en el borde mismo de las células, estos son probablemente filopodios. Uno puede asumir las siguientes: alto 12 C 14 N indica la proteína (o glicoproteínas); alto 12 C 14 N relacionados con fósforo indica los nucleótidos, 12 C con menos 12 C 14 N indica los lípidos o los azúcares, y 12 asociados C con 31 P indica fosfolípidos.

Se realizó un análisis más detallado de la región al borde de la lamellipodia de las células endoteliales (ver Figura 9], en la que hemos visto dos dominios píxeles de ancho (el tamaño de pixel en este caso es 234 nm) que contienen cinco veces más nitrógeno y una décima la nivel de oxígeno que los píxeles vecinos. Desde el original MIMS imágenes obtenidas en paralelo a las masas de 12 C 14 N -, 12 - y 16 O - (Figura 10a-c], junto con HSI imágenes de la relación 12 C 14 N - / 12 C - (Figura 10d] y la proporción de 16 O - / 12 C 14 N - (no se muestra), se observa lamellipodial dominios en el borde de la celda que parecen regularmente espaciados «puntos». Estas son ricas en 12 C 14 N y los pobres en 16 O en comparación con su entorno. Los valores de 12 C 14 N - cuenta con 12 de C - y cuenta con una de las 12 C 14 N - / 12 C - proporción se muestran en la Figura 10f para un grupo de píxeles que constituyen el punto central de la inserción en la figura 10e, y la valores de los 16 O - / 12 C 14 N - y del 12 C 14 N - / 12 C - ratios se muestran en la Figura 10g para el mismo píxeles; estos paneles ilustran la forma en que las imágenes y cuantificación están íntimamente asociados a MIMS . El rectángulo blanco en la figura 10f, g rodea dos píxeles vecinos que tienen el más alto contenido en nitrógeno y el más bajo contenido de oxígeno (Figura 10h] en comparación con el entorno lamellipodium (Figura 10 decies]. Por lo tanto, paralelo cuantitativos en masa de imágenes utilizando MIMS sin isotópica de suplementos pueden identificar nanómetro de tamaño estructuras que puedan ser funcionalmente importantes.

Etiquetado con radiactivo 14 C

MIMS abre el mundo de isótopos estables para nanoautography cuantitativos. Es similar, en principio, pero mucho más potente que autorradiografía, ya que es precisamente cuantitativos, necesita mucho más cortos tiempos de exposición, puede usar el gran número de isótopos estables que son naturalmente disponible, puede utilizar fácilmente múltiples etiquetas, da altas resoluciones, ofrece excepcionales profundidad de resolución y sería inocuo para el uso clínico. MIMS también se puede utilizar para la alta resolución de imagen cuantitativa de radioisótopos (por ejemplo, 14 C), y con alta sensibilidad, como se muestra en la labor pionera de Hindie et al. [10]. Un ejemplo de imagen de forma paralela a las masas de 14 C - y 12 C 15 N - de un conjunto de fibroblastos pulsos con suero y, a continuación, con 14 C-timidina después de la privación de suero se muestra en la Figura 11a, b, y la superposición de los 12 C 15 N -- Y 14 - las imágenes en la figura 11c. El 12 C 15 N - y 14 - las imágenes de una muestra de control sin adición de 14 C se muestran en la Figura 11d, e. El 12 C 15 N - mapas de imágenes en masa toda la fibroblastos (figura 11]. El 14 C - masa atómica imagen, indicativo de los 14 C-timidina en el ADN, se limita al núcleo (significa contar con núcleo = 49,0, SD = 38,2, n = 2388 píxeles, la suma de los cargos = 116955). El 14 C señal es variable a través del núcleo y se separa en dominios, que recuerda los resultados de Wei et al. [34]. La media de antecedentes 14 C contar fuera de la fibroblastos es 0,6 (DS = 1,1, n = 31148 píxeles, la suma de los cargos = 19873). La media de 14 C en contar con la región nuclear de la muestra de control es 0,009 (SD = 0,128, n = 2875 píxeles, la suma de los cargos = 25). La media de 14 C contar fuera del núcleo de la muestra de control no es significativamente diferente, con un valor de 0,008 (SD = 0,153, n = 50842 píxeles, la suma de los cargos = 420). Así, después de la exposición a 19 nmol / ml, de 14 C-timidina, cuenta en el núcleo de la etiqueta muestra han aumentado por un factor de 6125 en relación con la muestra de control. Control de contar con antecedentes de 14 C es insignificante. En comparación con la autorradiografía, se puede estimar que, incluso si sólo el 1 ‰ de los 14 átomos de C se sputtered y sólo el 1% de los átomos se sputtered ionizado, la sensibilidad de MIMS es por lo menos 10 de 3 veces mayor (véase el archivo de datos adicionales para 5 cálculos).

El uso de MIMS para realizar un seguimiento de las células individuales en poblaciones de células grandes

Tras el trasplante alogénico de tejidos y órganos, algunos donantes de células derivadas se sabe que salir del injerto y del presente alloantigens a la acogida del sistema inmunológico [35 - 37]. La naturaleza exacta y la frecuencia de los donantes de células infiltrarse en la acogida de los tejidos linfoides siguen sin estar claras, sin embargo. Los patrones de movimiento del destinatario inmuno-competentes las células que reconocen la alloantigens son también desconocidos. Estas preguntas han quedado sin respuesta debido a la falta de técnicas suficientemente sensibles para el seguimiento de precisión y visualización de un pequeño número de linfocitos en los tejidos. Aquí, nosotros usamos MIMS para realizar un seguimiento de los donantes de células después del trasplante.

Spleen de células C57Bl / 6 (B6, MHC haplotipo H-2 b) los ratones alimentados durante 2 semanas con una dieta de 15 N se inyecta por vía subcutánea en la footpad de un plenamente alogénico BALB / c ratón (H-2 d). Dos días más tarde, los ganglios linfáticos poplíteo (situada detrás de la rodilla, donde la fuga de pie de la almohadilla de ratón) se han recogido y examinado por MIMS para detectar la presencia de células de donantes. Misa imágenes de los 12 -, 13 -, 12 C 14 N - y 12 C 15 N - iones fueron adquiridos en forma paralela. Debido a que sólo un número muy reducido de células de donantes se espera que se encuentran entre las células del receptor, un gran número de células es necesario examinar con relativa rapidez con algún medio de poner de relieve las áreas que puedan contener los donantes de células (s). Esto se hizo utilizando MIMS mapa rápidamente a una amplia zona de los ganglios linfáticos, como se muestra en la Figura 12a, b. Es evidente que observar las zonas donde parece que hay un pequeño exceso de 15 N por encima de su abundancia natural (Figura 12b]. Estas áreas fueron reanalyzed con MIMS a una resolución más alta durante un largo tiempo. Un campo que contiene las células de donantes se muestra en la Figura 12c-e. En el 12 C 15 N - / 12 C 14 N - ratio de imagen (Figura 12d], dos células donantes son claramente visibles. El ratio de imagen de 13 C - / 12 C - del mismo campo tomadas simultáneamente (Figura 12e] no muestra ningún cambio y actúa como un control interno. La frecuencia de las células trasplantadas infiltrado en el receptor los ganglios linfáticos se estimó en 690 células por millones.

Llegamos a la conclusión de que la MIMS técnica permite la detección y determinación de frecuencias de infiltrarse en raras células del receptor tejidos linfoides después del trasplante. La metodología se puede ampliar para estudiar los trasplantes de órganos sólidos y el anidamiento de células madre. Es importante señalar que las técnicas actuales de rastreo de células trasplantadas son plagado de dificultades [38]. Etiquetado de ADN con isótopos estables deben proporcionar un método que permita a largo plazo y fisiológicos marcado, la posibilidad de determinar la generación de células individuales de la cantidad de etiqueta dentro de la célula, y la posibilidad de etiquetado donante y el receptor células de otra manera, lo que permite la inequívoca reconocimiento de la fusión celular o fagocitosis de los donantes de células del receptor de la células [38].

Discusión

Hemos demostrado que podemos obtener cuantitativos masa atómica utilizando imágenes MIMS. Debido a que estas imágenes se producen en paralelo de la misma sputtered volumen que se encuentran en registro exacto entre sí, lo cual es necesario para obtener significativas relaciones isotópicas. Una resolución lateral que llega a 33 nm, en teoría, y una masa de alta resolución (una masa / masa cambio en proporción de aproximadamente 10000) en secundaria alta de iones de litio de transmisión (70-80%) nos permite la imagen y cuantifican las moléculas marcadas con estable (o radiactivas) isótopos dentro de los compartimentos subcelulares. La masa de alta resolución nos permite distinguir la distribución de especies atómicas isobárica. Por ejemplo, separando 12 C 15 N - del 13 C 14 N - y 13 - de 12 C 1 H -, podemos imagen de la distribución intracelular de moléculas marcadas con isótopos estables del C 13 y 15 N (como el 15 N - timidina y 13 C-uridina) en paralelo y en la misma preparación. Por último, la alta estabilidad de la viga principal, el espectrómetro de masas y los detectores de contribuir a la cuantificación precisa. Estas singulares características nos han permitido desarrollar MIMS.

Instrumental avances
Resolución espacial

El paralelo de detección de iones diferentes, el pequeño tamaño de la primaria del haz de iones de litio, y la alta eficiencia de secundaria-la recogida de los iones contribuyen a la muy eficaz resolución espacial de MIMS, llegando a 33 nm, 30 veces mejor que en anteriores instrumentos. Vigas de menor tamaño son posibles y puede ser útil para localizar y medir muy concentrada en etiquetas de los volúmenes del orden de (20 nm) 3. Las fuentes primarias de mayor brillo puede dar más pequeñas sondas con la suficiente práctica actual para el análisis: que podría ser proporcionada por un brillante Cs + primaria de la fuente de iones o de otros tipos de fuentes [4].

Tomo sputtered y límite de detectabilidad

La absoluta de sensibilidad SIMS está entre los más altos de los actuales métodos de análisis químico y la cantidad total de material necesario para MIMS análisis es sumamente pequeño. El uso de MIMS, uno puede detectar partes por mil millones de un isótopo en una sub-micrómetro cúbico de volumen de muestra. Vamos a asumir un ámbito analizado, de 6 × 6 μ m, una de las principales Cs + actual intensidad del haz de alrededor de 0,4 pA, un tiempo de por píxel, de 20 msecs, 256 × 256 píxeles, una pulverización catódica eficiencia meta de cinco átomos de C + por iones, un espesor de la capa atómica de 2,55 × 10 -4 μ m, y una densidad atómica, de 6 × 10 10 átomos por μ m 3: el volumen total sputtered es entonces 0,27 μ m 3, y la pulverización catódica tasa es de 0,4 nm / minuto o capas atómicas 1,5 / minuto. Para una probabilidad de detección del 95%, tres iones tienen que ser emitidos; asumiendo un rendimiento útil de ionización de 1 × 10 -2 iones / átomo, entonces la cantidad mínima detectable es 1,85 × 10 -8 o aproximadamente 20 partes por mil millones (véase Datos adicionales fichero 1).

Contraste de formación

No hay teoría mediante primeros principios que nos permite predecir lo que ocurre cuando la superficie de la muestra se ve afectado por uno de los principales iones. Átomos que tienen más probabilidades de escapar?

¿Cuál es la tasa de pulverización catódica (la tasa de eliminación de los átomos objetivo)? Cuando una determinada especie es atómica sputtered, ¿cuál es el rendimiento de ionización (la fracción de átomos que están ionizadas)? ¿Cómo va la composición de la matriz afectar el número de átomos sputtered, la ionización rendimiento, y la formación de agrupaciones poliatómicos como NC o CNH? ¿Qué es romper el patrón de las grandes y pequeñas moléculas y los átomos en las agrupaciones atómicas? ¿Cómo interdependientes son los parámetros mencionados? Todas estas preguntas aún no se han respondido. Además, la elección primaria de iones, tan importante en la práctica, sigue siendo principalmente empírico. De hecho, con el fin de alcanzar el alto rendimiento de iones necesarios para análisis de trazas a la baja partes por mil millones de gama, la muestra tiene que ser bombardeado con o expuestos a especies reactivas químicamente, y O - o C + son los más comúnmente utilizados. Sin embargo, existe una falta de conocimientos detallados sobre la composición instantánea de superficie, y todos los intentos de correlacionar los rendimientos observados de iones con ionización modelos disponibles deben considerarse altamente cuestionable [39].

El contraste de una imagen de masa se debe a las diferencias regionales en secundaria-ion corrientes emitidos durante los analizados sobre el terreno. Los principales factores determinantes de la secundaria la formación de iones de litio son el tipo de pulverización catódica (la tasa de eliminación de la meta átomo de iones de la primaria), el rendimiento de ionización (la fracción de átomos sputtered que son ionizados) y la concentración local de los átomos. Estos parámetros no pueden ser derivados directamente de los primeros principios, pero con seguridad podemos afirmar lo siguiente. La tasa de pulverización catódica en el estado de equilibrio es directamente proporcional a la viga principal de densidad de corriente en la muestra de superficie y depende de la composición atómica local.

El rendimiento de ionización, en el secundario negativo-el modo de emisión de iones, depende en gran medida de la afinidad de electrones de los elementos o grupos objeto de examen y la concentración de los iones Cs + que se implantan por la viga en el atómica capas superficiales de la muestra. Para una primera aproximación, implantado primaria varían las concentraciones de iones como la inversa de las tasas de pulverización catódica, lo que hace que el rendimiento de ionización de algo en función del tipo de pulverización. Sin embargo, no sabemos la forma de la función que vincula implantado Cs + ionización de concentración para el rendimiento.

Teniendo todos estos factores en consideración, podemos predecir el siguiente. Una baja tasa de pulverización catódica se asocia generalmente con una mayor concentración de C + implantados; más bajos índices de pulverización catódica, por lo tanto, debería dar lugar a mayores rendimientos de ionización. Si los rendimientos de ionización dependen en gran medida las concentraciones de Cs +, los bajos tipos de pulverización catódica, paradójicamente, provocar un aumento de secundaria corrientes de iones de litio. En una situación en la que la pulverización de diferentes tipos de zonas en el campo de análisis no son las mismas, una determinada zona puede parecer más brillante debido a que la pulverización catódica tasa es más baja (con una proporción relativamente mayor concentración de Cs implantado +) y la ionización rendimiento es todavía sensibles a la concentración de C + implantados. Por otra parte, el rendimiento de ionización es probable que dependen de los tipos de pulverización catódica local porque, una vez que el estado de equilibrio se ha alcanzado, estas tasas locales de control de las concentraciones locales de los iones implantados primaria. Como consecuencia de ello, el brillo de un área de imagen depende de la concentración local del elemento en estudio, la implantados Cs + concentración y la pulverización catódica.

Sin ningún cambio, las imágenes no existen. Paralelamente masa imágenes de los diferentes elementos de electrones con diferentes afinidades transmitir una gran cantidad de información. Por ejemplo, una sección de celdas incorporados bombardeados con Cs + da 12 C - con imágenes de bajo contraste y, en paralelo, 12 C 14 N - que muestra imágenes de fuertes contrastes en relación con las estructuras celulares conocidas (por ejemplo, la figura 14, 12 C - y 12 C 14 N -). Vamos a considerar en primer lugar 12 C - imágenes. El local 12 C - intensidad depende de la pulverización y la tasa de rendimiento de ionización. Cuando se analiza en paralelo, cabría esperar (pero no ha quedado demostrado) de ionización de los rendimientos de 12 C 14 N - iones, con su alta afinidad electrónica (3,6 eV), para saturar (al llegar a su máxima probabilidad de captura de electrones) más rápidamente durante Cs + Implantación de 12 C - iones, electrones, cuya afinidad es mucho menor (1,2 eV). De ello se deduce que, si la ionización rendimiento depende en gran medida de la concentración de C + implantados, a las bajas concentraciones de Cs implantados los 12 + C - iones de emisión debería ser más sensible a pequeños cambios en los implantados Cs + y puede ser más sensible que 12 C 14 N - iones a las diferencias locales o las fluctuaciones de tipo de pulverización.

El bajo contraste que se observa en 12 C - las imágenes de Epon embebido en las muestras indica que probablemente las tasas de pulverización catódica son distribuidas de manera uniforme en todo el ámbito analizado y que implanta Cs + concentraciones son aproximadamente equivalentes en toda la muestra. El resto de contrastes se deben probablemente a un poco más bajo de concentración de carbono en el tejido biológico que en la incorporación y Epon a la formación de 12 C 14 N agrupaciones atómicas que reducir el número total de 12 átomos de C disponibles para formar 12 C - iones. Si contrastes altos se observaron que nos alerta a las diferencias en las tasas de pulverización o inesperadas diferencias en las concentraciones atómicas de carbono.

Debido a 12 C - imágenes indican una homogeneidad en el tipo de pulverización catódica y un constante estado de los implantados Cs + concentración, el contraste observado en la NC - las imágenes adquiridas en paralelo debe reflejar las diferencias en locales de concentración de nitrógeno en la materia analizada y no puede ser debido a artefactos de emisión. El hecho de que, en muchos casos, la interpretación de 12 C 14 N - las imágenes es sencillo y nos permite reconocer fácilmente los detalles de las características en las células o tejidos secciones es una bendición.

Por último, queremos poner de relieve la fortaleza de la información cuantitativa derivada de la relación de masa imágenes obtenidas en paralelo. Todos los parámetros son los mismos, los átomos o grupos tales como 26 CN y 27 CN se ven afectadas del mismo modo a un nivel de precisión mucho más allá de lo que se necesita para nuestros experimentos, y la proporción cuantitativa imágenes contienen la verdadera relación isotópica valores, anulando pulverización catódica, ionización y otros efectos que afectan a la emisión de un único ión.

La relación entre la formación de contraste, resolución lateral y el recuento de estadísticas

La resolución lateral es esencialmente una función del tamaño de la viga principal de iones. El más pequeño es el diámetro del haz, mayor será la resolución, que se aprecia visualmente, sin embargo, la imagen tiene que tener suficiente contraste, es decir, la imagen tiene que contener suficiente cuenta. Superior contar las tasas se obtendrá con un brillante haz de iones primaria, de todas las demás condiciones del mismo. La tasa de contar no afecta a la resolución intrínseca, pero es uno de los principales determinantes de la contabilización estadística. Por ejemplo, en un conjunto paralelo de 12 C 15 N - y 12 C 14 N - imágenes, aunque un 12 C 15 N - región, en general, contiene un número mucho menor de los cargos que sus 12 C 14 N - homólogo, tiene la misma resolución lateral . La diferencia de los 12 C 15 N - / 12 C 14 N - proporción de isótopos, sin embargo, es esencialmente determinada por el número de cuenta en el 12 C 15 N - región.

Si la muestra está estudiando la superficie es plana pero no muestra la ayuda de emergencia, se observa un período de tres dimensiones en apariencia la imagen de muestra. Aquí, el contraste puede deberse o bien a una diferencia de implantación o de una diferencia de pulverización que se produce debido a que el haz primario ataques muestra la superficie en una variedad de ángulos. Cabe destacar, sin embargo, que estas fenómeno afectará en la misma proporción - al menos en una primera aproximación - isótopos separados por 1 unidad de masa atómica. De este modo, las variaciones en las tasas de contar anular (ten en cuenta que todas las socorro efectos desaparecen en el ratio de imágenes, véase por ejemplo el adipocito en la Figura 4d, f], y el valor de la relación isotópica todavía representa la abundancia local de la persona con isótopos una precisión de unos pocos por ciento, lo cual es totalmente satisfactorio para fines biológicos. SIMS anteriormente habían sido utilizados para la cuantificación en ausencia de imágenes, de imágenes y en la falta de cuantificación. La ventaja de MIMS es combinar la alta resolución espacial (es decir, analizando una proporción mucho menor cantidad de material que antes), con traducción simultánea (paralela) la adquisición de información de varias masas atómicas, y con la isobara de separación en masa 27.

La capacidad de proporcionar información cuantitativa es un atributo exclusivo de MIMS. Imaging es una guía para explotar la enorme cantidad de información cuantitativa única, que se basa en la minería de los condes de iones secundarios por pixel.

Relaciones isotópicas

La relación isotópica valores son los datos esenciales necesarios para interpretar los resultados, y la derivación de relaciones isotópicas es una parte integral de MIMS metodología. El número absoluto de los cargos de una determinada masa atómica no transmitir ninguna información sobre la presencia de un exceso de isótopos. Por ejemplo, los condes de 12 C 15 N por sí mismos no nos permiten concluir nada sobre la presencia de un 15 N etiqueta en la región analizada. Sólo el coeficiente de 15 N / 14 N en comparación con la abundancia natural de 15 N es informativo. La observación visual de contraste y / o el brillo no es más informativo, y puede inducir a error. En un campo determinado, el contraste se debe a las variaciones del número de cuenta por píxel, lo que puede tener múltiples causas indocumentados. Como se señala en el apartado de formación de contraste »con anterioridad, además de la abundancia del isótopo de que se trate, la secundaria-ion intensidad depende de otros parámetros como el número de átomos de Cs implantados y la calidad de la matriz en la que el isótopo es introducido. De este modo, el hecho de que una zona determinada, emite más de un vecino que no quiere decir que contiene más del isótopo etiqueta. Alta cuenta en 12 C 15 N no quiere decir que hay un exceso de 15 N hasta que se normalizaron con el respeto de los condes de 14 N por el cálculo de la relación isotópica 12 C 15 N / 12 C 14 N. Una región de alto secundaria-ion rendimiento en masa 12 C 14 N puede tener poca incorporación de 15 N (véase, por ejemplo, el pilar exterior coclear células (Figura 3a], que tienen un alto secundaria 12 C 14 N rendimiento y muy bajo incorporación de 15 N (Figura 3c adicionales y archivo de datos 3). Por el contrario, una región con un alto 15 N en el 12 C 15 N imagen de masa en comparación con los píxeles vecinos puede simplemente reflejar una región con alto rendimiento global de ambos 12 C 14 N y 12 C 15 N, aunque su proporción es equivalente a la proporción natural. La relación isotópica los valores para las regiones de interés son la única información que pueden utilizarse para evaluar dónde y cuánto una etiqueta como el 15 N se ha incorporado.

El poder de la relación isotópica método es que todos los parámetros analíticos es el mismo (sobre el terreno analizados, las condiciones instrumentales, Cs + implantación, matriz de efecto), uno puede asumir que afectaría a dos isótopos del mismo número atómico - es decir, los isótopos que difieren en general de 2 unidades de masa atómica a la mayoría - de la misma manera fraccionada, de forma que cualquier efecto desconocido, se cancelará a cabo y que proporción de isótopos de valores singularmente representan la abundancia relativa de un isótopo con respecto a la otra.

Garantizar la 'plana' del campo, de tal manera que la proporción de isótopos de valores entre las regiones de interés son equivalentes independientemente de su ubicación en una imagen de control sobre el terreno, es muy importante. Demuestra que no hay diferencia entre el fraccionamiento isobars: es decir, que las diferencias en relación isotópica entre las distintas zonas no son la consecuencia de los cambios en la transmisión entre una serie de isótopos que se relacionan con la ubicación dentro del campo. Esta es la razón por la C 12 y 13 C cuantitativos masa atómica imágenes utilizadas para generar el 13 C / 12 C ratio de imagen (en la figura 3, por ejemplo) son un elemento esencial de control interno. Porque no hay 13 C agregado, para el control de la planitud del campo, lo que significa: en primer lugar, la equivalencia del 13 C / 12 C proporción en cualquier lugar en el ámbito analizado, en segundo lugar, la falta de instrumental deriva en el análisis; tercero , La falta de algunos topográficas efecto, y en cuarto lugar, la falta de una matriz de efecto diferencial. Con todas las condiciones sean las mismas y la secundaria porque los iones se detectan en paralelo de la misma área analizada, esto garantiza que los altos valores medidos de 15 N / 14 N ratios muestran un exceso de 15 N y no puede ser un artefacto.

Hemos desarrollado varios tipos de controles. Dos controles esenciales en nuestra cuantitativo de imágenes nos permiten validar las condiciones de análisis. Esta validación es individual sobre el terreno que se analiza. El primer control es asegurarse de que en caso de ausencia de isótopos se ha añadido, la relación isotópica medidos es equivalente a la abundancia natural en una región del campo en el que el exceso de isótopos no se espera. Cuando la muestra es un Epon embebido en la sección, ésta se medirá en la Epon, en una región de la materia analizada que no contiene células o los tejidos.

El segundo control es esencial para asegurarse de que, para todos los ámbitos analizados en el modo cuantitativo de imágenes, un exceso calculado de un isótopo por encima de su abundancia natural es independiente de su ubicación en el campo analizado. Esto puede ocurrir si existía alguna instrumental de un fraccionamiento isotópico con respecto a otra, lo que significa que dependiendo de la ubicación sobre el terreno, la transmisión de uno de los isótopos es algo diferente de otro. Control de la falta de fraccionamiento es proporcionado por la imagen derivados de relaciones isotópicas de las imágenes cuantitativas en masa de un conjunto de isótopos espera que se presente en su abundancia natural y los valores registrados durante el mismo campo, en la misma condición instrumental y en paralelo, al mismo tiempo , Con el isótopo a partir de la cual se espera un excedente por encima de su abundancia natural en algún lugar dentro del campo. Esta es la mejor grabación realizada de forma paralela junto a la imagen cuantitativa de los datos experimentales y de isótopos de un isótopo que se espera que esté presente en la abundancia natural. La belleza de la 13 C / 12 C ratio (como en el coclear muestra la etiqueta con 15 N, Figura 3] o del 12 C 15 N / 12 C 14 N en comparación con 13 C 14 N / 12 C 14 N (al igual que en un adipocito etiquetados con 13 C, Figura 4] es que el control de la misma materia que está siendo analizado, y en las mismas condiciones. «Normalmente, 'no es una suerte de desarrollar y utilizar los controles internos de tan alto poder. Estos controles son ideales los controles internos y son inmensamente más importante que encontrar abundancia natural coeficientes de valor en distintas muestras de control cuando todas las condiciones son diferentes de las medidas experimentales.

Conclusión

Hemos desarrollado MIMS, combinando el uso de un nuevo instrumento SIMS al mismo tiempo que detecta múltiples isótopos con isótopos estables y etiquetado cuantitativo de análisis de imagen. El uso de MIMS, es posible localizar y medir con precisión estables o radiactivos isotópica etiquetas en los compartimentos subcelulares en el sub-micrómetro cúbico de volumen. Isótopos estables pueden localizarse simultáneamente en alta resolución y mide con alta precisión, una combinación única. Estudios con MIMS pueden utilizar tejidos convencionales - y células, métodos de preparación. Las etiquetas moleculares puede ser cualquier isótopos estables o radiactivos. Uno puede tomar ventaja de cualquier molécula que se ha marcado para la espectrometría de masa o de resonancia magnetica nuclear, estudios (2 H, 13 C, 15 N, 17 O, 18 O, 33 S) o radiactivos para estudios (3 H y 14 C). Estas características hacen de MIMS metodología de una nueva y poderosa forma de visualización y de medición, en todos los campos de la investigación biomédica, parámetros importantes que son imposibles o difíciles de ver o medir con otros métodos.

Materiales y métodos

El análisis de los datos se realizó con una estación de trabajo SGI O2, ISEE Software de Análisis de Imágenes (Inovision Corporation, Raleigh, NC), software de análisis dentro de ISEE Imaging Software, Profeta y software estadístico (Centro Nacional de Recursos para investigación, NIH).

Cuantitativas de extracción de datos de imágenes

En el modo de escaneo, el número de cuenta para cada una de iones secundarios emitidos por cada pixel se almacena en un archivo informático. Escala de grises secundaria-ion imágenes para cada uno de los seleccionados iones secundarios se obtienen tras el análisis de la reconstrucción de los datos en un array con un número de píxeles igual a la de la adquisición de datos serie, con la intensidad de pixel en la imagen en escala de acuerdo con el número detectados por los cargos de que para la posición de iones. Hemos desarrollado un software para extraer de 24 bits cuantitativos archivos de imágenes de cientos de imágenes en bruto MIMS, mantenimiento de la cuenta registrada en cada píxel.

Una característica esencial de MIMS es la capacidad de localizar y cuantifican las regiones de la muestra que se han acumulado un isótopo, por ejemplo, 15 N, después de que el isótopo se ha proporcionado el exterior. Esto se hace por coeficiente de imágenes derivadas. Por ejemplo, la proporción de imagen 12 C 15 N - / 12 C 14 N - y la ratio de imagen de 13 C - / 12 C - se derivan de los píxel por píxel división de las respectivas imágenes paralelas. Cuantitativas imágenes obtenidas con MIMS generar mucho más información que se puede mostrar en escala de grises utilizando métodos. Para mostrar de alto rango dinámico-ratio de imágenes y de restar importancia a los valores resultantes de datos que cuenta con pocos, hemos desarrollado un método basado en un tono saturación transformación intensidad (HSI) [40, 41] de la relación entre imagen; HSI se deriva de un calcio ratio de imágenes de procedimiento [42]. Piense de los píxeles en una imagen de MIMS, como equivalentes a los tubos de ensayo. A 256 × 256 píxeles MIMS imagen sería un conjunto de 65536 tubos de ensayo de que al mismo tiempo contar con varios isótopos (por ejemplo, la abundancia de 12 C, 13 C, 14 N y 15 N). El HSI método nos permite identificar entre los 65536 píxel tubos de ensayo (que corresponden a las zonas de sub-micrómetros de tamaño) los que contienen significativamente mayor etiqueta que cuenta. La principal ventaja de HSI es código de color para el valor de los coeficientes a raíz de una escala que puede ser ampliado o comprimido, así como aprovechar al máximo el hecho de que los seres humanos perciben muchas más diferencias de color que las diferencias en tonos de gris. Por ejemplo, HSI nos permite identificar regiones de interés con un peso significativo en exceso del 15 N etiqueta de un medio independiente de reconocimiento visual de las estructuras histológicas espera. El uso de HSI nos permite simplificar en gran medida el primer paso de análisis de datos.

Otra poderosa pieza de software automatiza el análisis de datos de secuencias de imágenes en bruto. Después de crear un montón de imágenes de los campos analizados y aprovechando las regiones de interés, estadísticas de cada una de las regiones en cada una de las imágenes automáticamente se tabulan y se exportan al Profeta software para análisis estadístico.

Relaciones isotópicas

Regiones de interés fueron seleccionados mediante HSI ratio imágenes; secundaria-ion cuenta de las mismas regiones de interés fueron extraídos de los correspondientes unsmoothed imágenes de 12 -, 13 -, 12 C 15 N - y 12 C 14 N - y el isótopo proporción de los valores derivados imágenes 13 C - / 12 C - y 12 C 15 N - / 12 C 14 N -. El 15 N / 14 N ratio (o 13 C - / 12 C -) para cada región de interés también se determinará dividiendo el total de cargos de 12 C 15 N - (13 o C -) a lo largo de todos los píxeles en la región de la total correspondiente cuenta de 12 C 14 N - (12 o C -). Es importante destacar que ninguna de las manipulaciones de imagen que realizamos altera la cuenta que figura en los pixel o grupos de píxeles.

Renovación de nitrógeno

La renovación por ciento de nitrógeno se calculó para cada una de las regiones de interés, como: 100 × (tejido 15 N / 14 N - dieta control ratio) / (dieta experimental ratio - dieta control ratio), lo que da el porcentaje de la dieta etiqueta que ha de nitrógeno han incorporado en la muestra. Cero por ciento representa una proporción equivalente a la proporción terrestres; 100% representa una proporción idéntica a la de la dieta experimental.

Etiquetado y preparación de tejidos

Todos los protocolos experimentales usados en este estudio fueron aprobadas por el Área de Medicina de Harvard Comité Permanente de Animales, Protocolo 02751. ACB / CAJ ratones, 8 semanas de edad al comienzo de los experimentos, se obtuvieron a partir de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE.UU.).

Las dietas enriquecidas en 15 N-leucina

Norma L-leucina comercial sin proteínas aminoácidos dieta (TD 86529, Harlan Teklad, Madison, WI, EE.UU.) se utilizó como control de dieta. La dieta experimental fue preparado por el fabricante de acuerdo con la misma fórmula, pero con 15 NL-leucina sustituyendo el 23% del nivel L-leucina (9 g 15 NL-leucina en el total de 38,8 g leucina, por un lote de 3,5 kg de dieta). Para garantizar una dieta constante estado de síntesis sobre estas dietas, los ratones fueron colocados en el control de amino-ácidos dieta durante 5 días antes de que fueron alimentados con la dieta experimental. Los ratones fueron sacrificados después de 9 días o 22 días en los 15 NL-leucina dieta. 15 NL-leucina (> 98% isotópico puro) ha sido obtenido de Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, EE.UU..

El 15 N / 14 N relaciones isotópicas de nitrógeno en las dietas se mide por la combustión análisis de espectrometría de masas (metabólicas Solutions, Nashua, NH, EE.UU.). Los valores fueron 3,657 ‰ (0,001 SE, n = 12) en la dieta control (equivalente a la terrestre valor) y 13,972 ‰ (0,573 SE, n = 12) en la dieta experimental.

Mouse coclear tejido

Después de 9 o 22 días en la dieta, profundamente anestesiados intracardiaco ratones sometidos a perfusión con solución salina seguida de fijador (2,5% glutaraldehído y el 1,5% de paraformaldehído en 0,065 M en tampón fosfato). El temporal huesos fueron retirados, fijador mantenerse en la noche a 4 ° C, descalcificadas (0,1 M EDTA con glutaraldehído 0,4%) durante 3 días, enjuagar en agua desionizada, deshidratados en etanol y óxido de propileno, infundido con óxido de propileno / Epon, y embebidos en EPON. Otros tejidos fueron tratados de forma similar, pero no descalcificadas [43].

Secciones de la Epon embebido en el tejido, de 0,5 mm de espesor, se cortaron con cuchillos de vidrio sobre una Sorvall ultramicrotome. Las secciones fueron depositados en (5 mm) 2 obleas de silicio de los chips, que proporcionan una mecánica robusta y adecuada conductora de apoyo [44]. Los chips de silicio fueron montadas en una costumbre-hecho muestra titular para su inserción en el MIMS instrumento. El titular de las secciones ha sido colocado en una estufa de vacío durante 3 días a 50 ° C antes de su análisis y, a continuación, introdujo en la cámara de preanalysis del instrumento en un 10 -9 torr vacío.

Shipworms

Shipworms, Lyrodus pedicellatus, fueron incubadas en agua de mar en un 15 N atmósfera, fijados en formaldehído, embebido en Epon, y seccionó para MIMS análisis.

Adipocitos

Adipocitos se prepararon y analizaron en MIMS utilizando los mismos métodos que Kleinfeld et al. [28].

Fibroblastos de embrión de rata

Fibroblastos de embrión de rata (REF52) se cultivaron en DME/F12 medio con un 10% de FCS. Se les priva de suero durante 26 h después de haber llegado a 70-80% de confluencia; pulsado durante 17 h con un 10% de FCS y 1 mM BrdU (1 / 10 de la concentración generalmente utilizados en los estudios microfluorescence) y 1 mM 15 N-uridina; fija en su plato la cultura (el uso de formaldehído, glutaraldehído, y Acido picrico); separarse de plástico con óxido de propileno; incrustado en Epon-Araldite; seccionó a 0,5 μ m de espesor, y montado en Inox pulido vara para MIMS análisis.

Para el análisis de 14 C, REF52 células fueron cultivadas en DME/F12 los medios de comunicación con un 10% de FCS. Se les priva de suero durante 24 h después de que alcanzó el 40% confluencia; pulsado durante 24 h con un 10% de FCS y 1 mCi 14 C-timidina en una concentración de 19,2 nanomol / ml; fijo en su cultura plato utilizando formaldehído y glutaraldehído; separado de plástico con óxido de propileno; incrustado en Epon-Araldite; seccionó a 0,5 μ m de espesor y montado sobre chips de silicio para su análisis.

Tuning cuantitativos para adquisición de imágenes en masa

Antes de que un experimento MIMS, la muestra es la primera vistos y fotografiados en virtud de una reflexión contraste diferencial de interferencia (RDIC) con un microscopio automatizado etapa, y las coordenadas de múltiples regiones de interés se observó y se usa para encontrar las mismas regiones en el tratamiento automatizado de la etapa SIMS instrumento. RDIC nos permite prescindir de la preparación y tinción de secciones suplente microscopía. La muestra se coloca en la cámara de análisis en virtud de un vacío de aproximadamente 3 × 10 -10 torr. Una de las principales de haz de iones de Cs +, después de haber sido en forma primaria por la columna de iones de litio, se centra con el lente de inmersión y huelgas de la muestra con una energía de 16 keV (ver figura 13]. El principal haz de iones de litio explora la región de interés en la estacionario muestra paso a paso en un patrón de trama, por lo general de 256 × 256 píxeles, pero el número de píxeles puede variar en la práctica de 32 × 32 × 1024 a 1024. Los iones de secundaria emitido por la muestra se centran con el lente de inmersión, en forma de la óptica de la secundaria-ion columna, y enviada a través de un hexapole en el doble sector espectrómetro de masas formado por un prisma electrostática seguido de un prisma magnético. Esto permite de primer orden la concentración de iones secundarios como estrecho a lo largo de las líneas de plano focal del imán. Cuatro unidades del detector están situados en el plano focal y puede moverse independientemente a lo largo de ella a fin de seleccionar específicas masas atómicas. Cuatro multiplicadores de electrones en el detector de unidades de detectar las señales de los iones secundarios seleccionados simultáneamente. El actual y el diámetro de la primaria del haz de iones de litio, el momento en que el haz se dirige a cada pixel (el tiempo), y el tamaño de los píxeles se puede ajustar en función del tamaño de la zona que se analiza.

Para cada análisis, tenemos que garantizar en primer lugar, que hemos implantado Cs suficientes átomos en la muestra para aprovechar al máximo la secundaria-ion contar las estadísticas, en segundo lugar, hemos de maximizar la secundaria-ion transmisión; en tercer lugar, hemos perfecto en masa a todos los espectros de masas, y en cuarto lugar, en campos de control obtengamos valores equivalentes de la relación isotópica durante toda la imagen sobre el terreno. Tuning es la primera realizada en ion-el modo de contar, en la que la secundaria-ion contar tasa registrada por cada detector se visualiza numéricamente. Ninguna de las imágenes se adquieren. Nos aseguramos de que las respuestas de los detectores multiplicadores de electrones (EM; véase figura 13] son equivalentes. El principal Cs + haz desenfocado y se mantiene estacionario sobre una muestra de silicio estándar. La secundaria-ion actuales a 28 en masa Si se mide sucesivamente con cada uno de los cuatro detectores de EM; el radio de la secundaria del haz de iones de litio está configurado para entrar en la adecuada evolución de EM por el campo magnético del prisma magnético. Estamos ajustar dos parámetros para cada EM: la EM de alta tensión se ajusta de manera que el pulso de altura distribución (PHD, la representación gráfica de la distribución de la amplitud de los pulsos generados por un EM en un determinado voltaje) de salida de la EM es similar para cada uno de los cuatro detectores, y la EM de tensión umbral se fija de forma que, a falta de secundaria de iones de litio actual, el ruido del sistema de conteo es más pequeño que contar por 1 minuto. Cuando se reúnen estas condiciones, la tasa de contar con la misma muestra es la misma entre los cuatro detectores, con una tolerancia de ± 2,5%.

Para empezar la afinación, implante Cs átomos en la muestra biológica en un ámbito relativamente grande (100-150 μ m) a su alto primaria de iones de litio actual (obtenida mediante la eliminación de la membrana (D1, figura 13] utiliza para definir el primer rayo de apertura en el objetivo de la columna (OC). Después de un período de varios minutos, Cs átomos implantados en la muestra mejorar la secundaria-ion rendimiento a fin de que los 12 C 14 N - secundario-ion contar tasa alcanza un estado de equilibrio. A continuación, nos aseguramos de que la EM detectores están situados en la posición correcta a lo largo del plano focal del imán (FP, Figura 13] para cada masa. Maximizar la tasa de contar cada EM moviendo el detector a lo largo del plano focal a fin de maximizar la secundaria-ion contar tasa seleccionada para la masa atómica.

Seguimos con la alineación de la secundaria del haz de iones de litio para que la isobars 12 C 15 N y 13 C 14 N, C y 13 y 12 C 1 H, están bien discriminados, lo que indica la masa de alta resolución, manteniendo al mismo tiempo un alto secundaria-ion transmisión (aproximadamente 70-80%). Una entrada de hendidura (ES, figura 13], cuya anchura es uno de los principales determinantes de la masa poder de resolución (MRP), se coloca en el camino de la secundaria del haz de iones de litio. Hemos de maximizar la tasa de contar con una determinada masa de iterativamente centrar la secundaria-ion lente situada en la columna objetivo (E0S) y de ajustar los voltajes de la deformación placas P2, P3, CY y secundaria dentro de la columna. A continuación, establecemos una abertura de hendidura (AS) y una ranura de energía (WAS) para reducir angular y la energía aberraciones y, por tanto, a maximizar el MRP. Para evaluar el MRP, escaneamos la secundaria-haz de iones a través de los detectores de selección de hendidura (SS) a través de un conjunto de placas de deflexión (DP) y registramos una pequeña parte del espectro de masa trazando la secundaria-ion actuales frente a la deformación de tensión (Figura 15]. El cuadrupolo y hendidura lente (LF4) se usan para maximizar el MRP. Luego, para cada detector, utilizando los espectros de masa parcelas, nos fijamos el voltaje de las placas de deflexión (DP, Figura 13] para que la masa línea de interés está centrado en la selección de hendidura (SS) de la EM (véase figura 13] . Esto prácticamente elimina cualquier desbordamiento de vecinos isobars.

A continuación, cambiar a modo de imagen, que muestra 'en vivo' escaneo de iones a partir de dos imágenes seleccionadas masas. Después de ajustar el tamaño del campo analizado, los últimos pasos objetivo de equilibrar la afinación y el principal foco de haz de iones. Nos aseguramos de que el ámbito analizado es equilibrado, es decir, que la secundaria-ion intensidad emitida por una pequeña fracción del campo es equivalente en todo el campo, con iterativo pequeños ajustes de voltaje de la secundaria-ion lente objetivo (EOS), y de una serie de placas de deflexión (P2, P3 y CY) dentro de la columna secundaria. Estamos optimizar la atención de ajustar el voltaje de la primaria-ion lente objetivo (EOP, figura 13]. Para analizar al más alto posible resolución espacial (aproximadamente 35 nm), aumentar la demagnification de la primaria fuente de iones por el aumento de la tensión de la lente L1 (ver figura 13] en la columna principal. Es posible que luego tienen que reajustar ligeramente la afinación de la secundaria del haz de iones de litio. Por último, antes de comenzar el análisis, que se ajusta el número de píxeles de la imagen (256 x 256 hasta 2048 × 2048) de tal manera que el diámetro del haz es aproximadamente dos veces el tamaño de pixel, y nos aseguramos de que la adquisición es tiempo lo suficientemente largo como para obtener suficiente contar las estadísticas de las masas de contar con bajos tipos (por ejemplo, 13 C y 12 C 15 N).

Después de una muestra se introduce en la cámara de MIMS análisis, podemos configurar el instrumento para adquirir cualitativo MIMS imágenes - en general en masa 12 C 14 N, lo que da una buena vista anatómico - dentro de los 30 minutos. Es significativo que se necesita más tiempo, sin embargo, para la optimización de los muchos parámetros instrumentales (sintonización) que se necesita para grabar imágenes en masa cuantitativos adecuados para la extracción de datos cuantitativos significativos. Para los nuevos tipos de muestras que puede tomar horas a un día. Sin embargo, la física es robusto, y más en sintonía mismo tipo de muestra no tiene más de 1 a 2 horas.

Datos adicionales archivos

Los siguientes ficheros: fichero de datos adicionales 1, que contiene una explicación de cómo el volumen sputtered, el rendimiento útil, y el límite de detectabilidad se calculan; adicional archivo de datos 2, que contiene una explicación de cómo el lateral se calcula resolución; archivo adicional 3 , Que describe los datos de reducción de la etiqueta y el control del ratón coclear secciones; archivo de datos adicional 4, que describe la relación entre el brillo de una imagen y el número de cuenta; archivo de datos adicional 5, comparando con MIMS autorradiografía; archivo de datos adicional 6, que contiene una explicación por la forma del pico de masa en línea MIMS, y archivo de datos adicionales 7, que contiene más detalles sobre la Figura 2e.

Material complementario
Adicional 1 archivo de datos
Una explicación de cómo el volumen sputtered, el rendimiento útil, y el límite de detectabilidad se calculan
Datos adicionales de archivo 2
Una explicación del modo en que la resolución lateral se calcula
Datos adicionales archivo 3
Los datos de reducción de la etiqueta y el control del ratón coclear secciones
Datos adicionales de archivo 4
La relación entre el brillo de una imagen y el número de cuenta
Datos adicionales de archivo 5
Una comparación de MIMS con autorradiografía
Archivo de datos adicional 6
Una explicación de la forma de masa picos en línea MIMS
Datos adicionales archivo 7
Más detalles en la Figura 2e
Agradecimientos

Desarrollo de nuevos SIMS instrumento fue apoyado por el ONERA, CNRS, Université Paris Sud y Cameca (Francia). Damos las gracias a Jean-Daniel Sraer por su ayuda para obtener el prototipo de la nueva máquina de SIMS y Karnovsky MJ por su largo tiempo de apoyo. Damos las gracias a Hjalmar Brismar y Anne Mudge para comentarios generales, Edmund Mroz y Jung Tae Gee ratón para proporcionar muestras coclear, Louise Trakimas para la mayoría de su ayuda de expertos histológico. Molly Palmer por su paciencia, dedicación y eficiencia en el trabajo en el manuscrito, Sharman y Anna por su completa atención editorial. Esta obra fue financiada en parte por subvenciones P41RR14579 NIH, P41EB001974, DC00033, DC03463, RO1DC04179, P41RR14579, P41EB001974, R37DK39773, RO1EY12963, RO1GM47214, y RO1DK58762 y por NSF / IBN subvención IBN-998298.