Emergente dinámica de desarrollo y Thymocyte linaje determinación

El timo de mamífero recibe células madre de la médula ósea. Estas células-timocitos de pasar por una serie de subcompartments anatómicas en un proceso denominado de células T educación [1, 2]. Cerca del 97% del candidato células T mueren, mientras que el 3% restante son esenciales para el desarrollo continuo del sistema inmune adaptativo [3]. Para una revisión reciente de la arquitectura tímica y el tráfico de células, ver [4]. Para una breve animación esquemática de la maduración tímica, ver vídeo S1.

Una amplia investigación en diferentes disciplinas ha descubierto una masa de datos relativos a thymocyte desarrollo. Subcampos timo de investigación incluyen genes, la expresión génica y la diferenciación; moléculas (integrinas, quimiocinas, citocinas, receptores, antígenos, y otros ligandos); células (células madre, timocitos, células epiteliales, células dendríticas y macrófagos), células comportamiento (adherencia , La migración y localización anatómica); estados de células (la diferenciación de los estados, ciclo celular, proliferación y apoptosis) y la fisiología (la expresión de antígenos, positivos y negativos de selección, elección linaje, y antígeno-receptor de repertorios). Las tecnologías utilizadas para estudiar thymopoeisis incluyen la genética, los transgenes y de genes knockouts, la química de proteínas, inmunohistoquímica y la microscopía, cultivos celulares in vitro e interacciones, en vivo fenotipos de células y las transferencias de órganos, vacunas, y mucho más. Una integración sistemática de estos datos en una precisa y completa la representación es muy necesaria. Nos dirigimos a esta necesidad mediante la animación reactiva (AR) para revelar multiscalar propiedades emergentes y para orientar la experimentación en thymocyte desarrollo.

RA es un método computacional para la simulación de sistemas dinámicos complejos. La tecnología de la AR se ha descrito en otra parte [5 - 7]. En pocas palabras, la RA de simulación se construye en dos niveles. El primer nivel está construida de abajo arriba, desde el celular y molecular de datos, e incorpora el programa, la lógica y la dinámica de la simulación. El segundo nivel es un front-end de la visualización capaz de simulación en tiempo real de la manipulación interactiva de la acción. RA permite al experimentador para extraer estadísticas y la información local de la gestión de simulación. Por otra parte, el experimentador puede intervenir en la simulación y observar in silico los efectos de pensamiento experimentos. Nuestra simulación se construyó utilizando principalmente para el primer nivel el idioma de Statecharts [8], con la ampliación de su legibilidad y la estructura orgánica. Hemos añadido a Statecharts un segundo nivel de animación. Entre las dos listas, hemos construido un conjunto de herramientas para facilitar la minería de datos opciones, como por ejemplo, las células, la manipulación de los receptores de superficie, la inducción de la apoptosis, la célula de seguimiento de ascendencia, muestra los datos, visualización de los gradientes de quimioquinas, el zoom de entrada y salida a través de las escalas , El flujo de informes, datos estadísticos y más (vea la Figura 1 B). Las manifestaciones de estas herramientas se encuentran en Video S2 - S4 y en línea. Las referencias a los documentos que utiliza para la base de datos figuran en el Texto S1.

RA es fundamentalmente diferente del de otros enfoques dirigidos a la red de modelado [9 - 11] o para simular la microarquitectura de la sinapsis inmunológica o membrana [12 - 14]. No hemos simular la membrana de datos en el presente trabajo debido a la falta de datos cuantitativos. Otra base espacial se ha desarrollado el sistema [15], y hasta ahora se ha aplicado a la señalización molecular [16].

Los datos a nivel de células individuales y su microambiente sacados de cientos de documentos fueron codificados para la simulación. Localización anatómica es fundamental para el desarrollo timo; timocitos en diferentes etapas de desarrollo específicas para migrar tímica compartimentos [2]. Validación de un fondo de simulación, como la AR (y de la propia base de datos) requiere que la microescala poner los datos moleculares en el modelo son suficientes para generar realista macroscale thymocyte la migración y la ubicación anatómica. Migración celular depende de thymocyte receptor de los perfiles, los gradientes de quimioquinas, las células epiteliales, la proliferación celular, la supervivencia celular, las células de velocidad y otros factores que entran en la simulación. Por ejemplo, un thymocyte a la doble negativa (DN) 1 etapa expresa un perfil de marcadores de superficie CD4 ^- CD8 ^- CD25 ^- CD44 ⁺ CD69 ^bajo Lselectin ^- [17]. Experimentalmente, sabemos que en los timocitos DN1 etapa migrar hacia el quimiocinas CCL25 [18]. El timo estroma, también influye en las decisiones migratorias, un thymocyte el camino a una de quimioquinas puede ser bloqueada por otra celda. Por otra parte, las quimioquinas se participa en dos procesos dinámicos: en primer lugar, determinadas regiones del timo continuamente segregan las quimioquinas y, en segundo lugar, las quimioquinas se difunde a través del tiempo y el espacio. De este modo, la migración de un thymocyte continuamente los cambios en función de la secreción y la difusión de quimiocinas y la actual ubicación de otros que emigran timocitos y células del estroma estacionario. Esto y mucho más información se incluye en la simulación. Figura 1 demuestra que la simulada tímica lóbulo fielmente produce la multa relaciones anatómicas de la estructura real tímica; miles de timocitos, computados individualmente, localizar, como se ha visto en las secciones histológicas, a determinados sitios anatómicos de acuerdo a doce distintas etapas de desarrollo de un código de color en el cuadro de leyenda.

La Figura 2 muestra la ruta migratoria de una sola thymocyte. Tanto la nueva anatomía y la nueva ruta son fieles a los resultados experimentales [2]. Video S1 y S3 vídeo muestran las versiones dinámicas de la AR cifras. Estos resultados demuestran que los datos moleculares en la mano son suficientes para generar la macroscale timo, y que la AR puede revelar esta cruzada escalar aparición.

Los efectos sobre el timo multa anatomía de los receptores de quimiocinas CXCR4 [19] y CCR9 [20] han sido estudiadas experimentalmente, por lo que podría comparar una simulación de RA llaman a cabo estos receptores a los resultados experimentales. Focalizada gen de supresión de CXCR4 [19] dio lugar a no cortical localización y detención de desarrollo. Figura 3 A (izquierda) muestra el lóbulo tímica, ya que fue capturado bajo el microscopio [19] y como es capturado durante la simulación (derecha). En ambos casos, los timocitos no responden a la estimulación CXCR4, ambos Figura 3 paneles que muestran el desarrollo thymocyte se colgó cerca de la cortico-medulary cruce (CMJ) en la etapa DN1 (con la etiqueta roja). Figura 3 muestra B el mismo tiempo marco y anatómicos en una sección de tipo salvaje timo. Tenga en cuenta que doble positivos (DP) células (células azul en la simulación) se han extendido en la corteza. A diferencia de la estática de la histología modelo experimental, RA ofrece una representación dinámica.

En contraste con el CXCR4 eliminatorias, la supresión de CCR9 no ha tenido grandes efectos intrathymic experimentalmente en el desarrollo de células T [20]. Sin embargo, los experimentos de trasplante de competitividad puesto de manifiesto que células de la médula ósea de CCR9-/ - ratones eran menos eficientes en la repoblación de timo lethally irradiados Rag-1-/ - ratones que fueron células de la médula ósea de littermate CCR9 + / + ratones [18, 20].

La RA resultados de la simulación, se indica en la figura 4 y en Video S1 - S4, muestran la influencia de la falta de respuesta a CCL25, el ligando de quimioquinas CCR9-/ -, y el resultado de la competencia entre CCR9-/ - y silvestres - tipo de células. Figura 4 muestra un timo normal, al mismo tiempo, como punto de la alteración de timo que aparece en la Figura 4 B; las células anormales están codificados gris aquí. Figura 4 es animada en Video S3, donde el panel superior muestra la naturaleza - fenotipo y el panel inferior muestra la CCR9-/ - fenotipo: la CCR9-/ - las células se congregan en torno a la zona subcortical (SCZ). Timocitos en la transición de DN a DP normalmente emigrar hacia el quimiocinas CCL25 y entrar en la corteza, sino la CCR9-/ - las células no pueden responder a este quimioquinas y se bloquean. La bloqueado timocitos, sin embargo, todavía puede pasar al azar, y la presión de la población los empuja fuera de la SCZ, a fin de que algunos de ellos llegan a su próximo puesto de control de desarrollo de las células epiteliales corticales-pasiva. Estas células afortunados pueden madurar en su próxima etapa de desarrollo y migran hacia la médula (a través de diferentes quimioquinas), donde pueden madurar más (en función de los eventos de selección) en todas las funciones completas de un solo positivo (SP) las células. RA revela esta dinámica, estática supone experimental de la histología en solitario.

RA también ha permitido observar la dinámica in silico de un experimento de competencia, en el que un número igual de CCR9-/ - y de tipo salvaje células son sembradas en el timo: S2 vídeo que muestra la naturaleza del tipo de células sobrevivir y madurar en mucho los números más altos. RA permite cuantificar las relaciones entre maduro de tipo salvaje y las células maduras CCR9-/ - las células (Figura 5): podemos ver un primer pico de maduración de tipo salvaje células, seguido de una disminución y una eventual relación asintótica, como la acumulación de presión al azar de CCR9-/ - las células eventualmente genera la homeostasis. Esta competencia aún no se ha realizado experimentalmente, pero RA simulación predice el resultado se muestra en la Figura 5. Figura 5 muestra un valor asíntota de cuatro de tipo salvaje a todos los timocitos CCR9-/ - thymocyte. La dinámica de la asíntota y el valor final son nuestras previsiones en caso de que dicho experimento se realizó. Un punto crítico de manifiesto en la Figura 5 es la inmensa ventaja de que de tipo salvaje células tienen inmediatamente después de la siembra el timo. Ese efecto debe ser fácil de testigo experimentalmente.

Timocitos necesidad de atravesar los nichos de desarrollo, por lo que cuando el número de timocitos supera el espacio disponible para la presentación de antígenos sitios en las células epiteliales, los timocitos se acumulan y los que esperan su turno para la estimulación pueden someterse apoptosis de la falta de interacción [21, 22] . RA permite estudiar la función de la competencia de modificar la interacción constantes de tiempo, como se muestra en el vídeo S3. Los resultados indican que la competencia es esencial para el desarrollo normal tímica. Figura 6 muestra un patrón normal de la apoptosis que se produce en la corteza en el concurso habilitado timo. Figura 6 B, por el contrario, muestra que un patrón anormal de la apoptosis se desarrolla en un timo de células libres de la competencia; aquí, la mayoría de timocitos mueren de selección negativa en la médula, más que en la corteza. La RA simulación sugiere que el tiempo de espera para la interacción con las células epiteliales corticales constituyen un cuello de botella que es un factor en el desarrollo normal de timo.

RA experimentación in silico indica que la competencia también selecciona diferencial de velocidades de tráfico en respuesta a gradientes de quimioquinas. Figura 7 muestra que más rápido timocitos disfrutar de mayores posibilidades de supervivencia, al menos hasta cierto punto. No obstante, algunos timocitos que son relativamente más lento puede evitar las consecuencias negativas sufridas por la selección de algunos de sus hermanos más rápida. Por lo tanto, la competencia para seleccionar una gama de velocidades de células, y no sólo de una manera uniforme de alta velocidad. ¿Cómo de selección para una serie de células T podría aumentar la velocidad de defensa contra los invasores [23], así como para el cuerpo de mantenimiento [24] que hay que investigar.

Otra predicción de células que salen de la competencia se refiere al linaje compromiso. Un desarrollo thymocyte debe elegir si desea convertirse en un SP de células T CD4 (ayuda) o un SP de células T CD8 (citotóxicos). El proceso de toma de decisiones es oscura porque madura SP CD4 y las células T CD8 evolucionar a partir de precursores que son DP para ambos CD4 y CD8, células CD4 aún predominan en una proporción de 2:1. Las actuales teorías de linaje compromiso frente a los detalles moleculares de la elección. Los dos temas más importantes en las teorías distinguir entre una "instrucción" y un "estocástico" [25]. La "instrucción" que propone la interacción productiva de un receptor de células T con un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) molécula, clase I (de CD8) o clase II (CD4) según sea el caso, las recompensas y los induce thymocyte una selección genética para diferenciar a los CD4 o CD8 fenotipo. El más adecuado receptor de células T-MHC instruye a la interacción de células T. El "estocástico" enfoque propone que SP CD4 o CD8 timocitos son "al azar" generados, y posteriormente se seleccionarán en función de su rendimiento funcional con el MHC. Estas teorías intento de fundar el linaje de su elección en componentes moleculares destinadas a mostrar el lugar exacto, durante el desarrollo, la célula elige su linaje [25 - 27].

Sin embargo, la aparición de la competencia entre los timocitos de interacción espacio ofrece una nueva solución para el CD4: CD8 2:1 paradoja. Si la disociación de los tipos de células CD8 de las células epiteliales son más bajos que los de células CD4, las células CD8 la voluntad permanecer más tiempo en sus células epiteliales de las estaciones de interacción (péptido-MHC I sitios). Mientras un CD8 thymocyte persiste en un péptido MHC-1 nicho, este nicho no está disponible para otros, que compiten timocitos CD8. Timocitos CD8, proponemos, no compiten con los timocitos CD4, porque timocitos CD4 competir entre sí para la estimulación de la interacción con péptidos MHC-II en las estaciones de células epiteliales. Hemos probado los resultados en linaje frecuencia de simular diferentes tipos de disociación de las interacciones entre las células epiteliales y CD4 y CD8 timocitos. Los resultados se muestran en la Figura 8. Se puede observar que aproximadamente dos tercios de timocitos se madura en las células T CD4 y un tercio en las células T CD8 (la proporción de facto) cuando la tasa de disociación de CD8 timocitos es de 1,7 a 3,3 veces más lento que la tasa de disociación de CD4 timocitos. Una parte relativamente mayor avidez de las células CD8 para nichos de células epiteliales (de 1,7-3,3), se generará el linaje observó predominio de células T CD4.

RA análisis de thymocyte desarrollo arroja nueva luz sobre la relación dinámica entre las moléculas de las células y en la generación de la estructura y la función del órgano timo. En primer lugar, podemos ver que el actual conjunto de datos, sin embargo discreto y fragmentario, se puede integrar de RA simulación en una representación de la anatomía funcional del timo visto en las secciones histológicas. ¿Qué sabemos acerca de las células y las moléculas pueden, en efecto, cuenta de lo que vemos; macroscale el órgano se desprende de la microescala masa de datos en la mano. En este sentido, la AR puede decirse para validar la base de datos. Nota, sin embargo, que la clásica secciones histológicas son de dos dimensiones rodajas de un período de tres dimensiones órgano congelado en el tiempo; RA simulación añade la dimensión del tiempo-y dinámica-de modo nos muestra el poder formativo de la dinámica de flujo de células, moléculas, y las interacciones que dan lugar a la mayor escala órgano. En otro proyecto en el que participan diferentes órganos, en la actualidad la ampliación de la AR simulaciones para dar cabida a la tercera dimensión en el espacio; de esperar, añade la complejidad de la representación mejorará nuestra comprensión de la biología.

En segundo lugar, RA simulación novela ofrece explicaciones para los resultados observados de intervención experimental. En nuestro caso, por ejemplo, RA simulación sugiere que la falta de fenotipo observado en ratones con CCR9 inutiliza (CCR9-/ -) se podría explicar por la compensación dinámica a través de la presión de la población. RA simulación también explica el crecimiento ventaja competitiva que disfruta de tipo salvaje células más CCR9-/ - las células. De hecho, la sobreexpresión de CCR9 en timocitos conduce a un fenotipo in vivo que puede explicarse por la AR como una inoportuna atracción de los timocitos corticales de las células epiteliales. RA simulación también sugiere que la ausencia de salida tímica como consecuencia de la inhibición de CXCR4 puede atribuirse a la nonmigratory comportamiento de las células entran en el timo.

En tercer lugar, la visualización dinámica de la célula a través de RA proporciona una vista de la fisiología emergentes. A pesar de que el timo está repleto de células, la existencia de competencia entre los timocitos espacio para la estimulación y no ha sido objeto de experimentación o incluso el debate; competencia simplemente no es estática visto en las secciones histológicas. Dado que la competencia no fue registrada en la base de datos, no explícitamente programa de la competencia en nuestro modelo. Sin embargo, las células de competencia surgido ante nuestros propios ojos como hemos sido testigos, a través de RA, la lucha de animación entre los timocitos productivas para la interacción con las células epiteliales tímica. En silico manipulación de diversos parámetros thymocyte sugirió que la competencia podría funcionar como un factor importante en tres propiedades emergentes de la maduración de células T: la anatomía funcional del timo, la selección de timocitos con un rango de velocidades migratorias, y la relativa preponderancia de CD4 SP T cells. Obviamente, estas sugerencias requieren validación experimental. Independientemente de los resultados, sin embargo, la animación del brazo de la AR, al proporcionar una mayor escala, habida cuenta de complejas propiedades emergentes [28], nos puede alertar a las nuevas preguntas para la experimentación. En última instancia, nos gustaría un completo modelo de sistema biológico de toda una célula, órgano, organismo o en una forma que es lo suficientemente realista para poder poner a prueba el papel de cualquier hecho sobre el sistema. Este objetivo se ha formulado como la capacidad de un modelo para pasar una especie de prueba de Turing, y puede considerarse como teniendo al máximo límite la noción de predicción, confirmación y verificación de propiedades emergentes, ver [29].

La RA simulación ha sido escrito en C + + usando la herramienta de Rhapsody, y de manera RA código generado por el código de Rhapsody generación de motores, iniciado por la lengua de Statecharts. Con este código generado automáticamente, codificado manualmente los objetos y las funciones se añadieron. RA es el puente entre el funcionamiento de simulación y la animación. La comunicación se haga más de una conexión TCP / IP entre un servidor de la aplicación de la simulación y Statecharts incorporado en funciones de animación en Flash. Se utilizó Matlab para analizar las poblaciones y la población a nivel de comportamiento. Véase [6] para más detalles.