Journal of Autoimmune Diseases, 2007; 4: 1-1 (más artículos en esta revista)

Autoanticuerpos contra las proteínas cromosómicas de pasajeros INCENP encontró en un paciente con Graham-Little Piccardi, síndrome de Lassueur -

BioMed Central
Beatriz Rodríguez-Bayona (megatrixrb@yahoo.es) [1], Sandrine Ruchaud (sruchaud@staffmail.ed.ac.uk) [3], Carmen Rodríguez (carmen.rodriguez.sspa @ juntadeandalucia.es) [1], Mario Linares (mlinares@inicia.es) [2], Antonio Astola (antonio.astola @ uca.es) [4], Manuela Ortiz (manuela.ortiz @ uca.es) [4], William C Earnshaw (bill.earnshaw @ ed.ac.uk) [3], M Manuel Valdivia (manuel.valdivia @ uca.es) [4]
[1] Servicio de Inmunología, Hospital Puerta del Mar, 11109 Cádiz, España
[2], Dermatología, Instituto Social de la Marina, Delegación Provincial de Cádiz, Cádiz, España
[3] Wellcome Trust Centro de Biología Celular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Edimburgo, Edimburgo EH9 3JR, Reino Unido
[4] Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, 11510 Puerto Real, Cádiz, España

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Resumen
Fondo

Graham Little - Piccardi - Lassueur (GLPL) síndrome es una rara dermatosis se caracteriza por alopecia cicatrices, pérdida de púbico y axilar pelo, y el desarrollo progresivo de sus diferentes situado folicular pápulas. Se presenta un primer caso de una vez respuesta autoinmune en un paciente con síndrome de GLPL.

Métodos

Inmunofluorescencia y análisis de inmunoblot se haya utilizado en una variedad de cultivos celulares humanos, el mono, hámster, ratón y células de bovino para analizar la presencia de autoanticuerpos en una GLPL paciente.

Resultados

El autoinmune suero mostró un patrón de centromere huso microtúbulos y manchas que se asemejan a las de las proteínas cromosómicas de pasajeros complejo. Mediante la utilización de un complejo de proteínas expresadas en baculovirus, inmunoblot análisis demostró que la proteína INCENP es uno de los principales autoantígenos en este paciente con síndrome de GLPL.

Conclusión

Una respuesta autoinmune en GLPL síndrome se informó contra la proteína INCENP centromere. El ocasional desarrollo de la autoinmunidad en GLPL los pacientes podrían servir como prueba en los esfuerzos para detectar esta enfermedad y más de una terapia dirigida sobre la base de la respuesta autoantígenos.

Fondo

La presencia de alopecia cicatricial en el cuero cabelludo, queratosis pilaris en el tronco y las extremidades, y no cicatricial pérdida de pelo en el pubis y axila fue descrita por primera vez por Piccardi en 1914 y un año después de Graham Little en un paciente enviado por Lassueur. El GLPL síndrome se considera una forma de liquen plano folicular (LP), que se caracteriza por lichenoid dermatosis, queratosis pilaris y progresiva de alopecia cicatricial el cuero cabelludo [1]. Todas las manifestaciones clínicas necesidad de no estar presentes simultáneamente. Asociación con andrógenos, síndrome de insensibilidad es también descrito recientemente para el síndrome de GLPL.

Un familiar caso de que se produzca a una madre y su hija fue descrito recientemente con un HLA-RP1, tanto en los pacientes [2]. Tópicos o sistémicos corticoesteroides, retinoides o PUVA terapia son los tratamientos por lo general estas propuestas y oferta parcial y temporal, las prestaciones [3]. Más recientemente la eficacia de la ciclosporina A fue descrita por primera vez [4].

La inmunofluorescencia (IF) es un análisis clínico común procedimiento utilizado en el estudio de la evolución y el comportamiento de varias enfermedades crónicas. Con base en las características clínicas y los hallazgos histológicos, hemos decidido realizar una primera prueba IF en una paciente sufre el síndrome de GLPL. Autoanticuerpos se encontraron a reconocer una mitótico-antígeno asociado que se comporta como los anteriormente descritos cromosómicas pasajeros complejo de proteínas [5]. Nuestros resultados representan el primer informe hasta la fecha de una respuesta autoinmune en GLPL y el síndrome de este trabajo, también nos permiten describir la primera autoanticuerpos dirigidos a INCENP proteína en los seres humanos. Otros estudios de la importancia de la autoinmunidad en pacientes GLPL seguirá en el futuro.

Materiales y métodos
Humanos autoinmune suero

A 45 años de edad, mujer con alopecia en el área frontal con hiperqueratosis folicular y otras características clínicas se le diagnosticó como síndrome de sufrimiento GLPL. Los primeros ensayos clínicos de SI a nivel humano HEP2-fijo células que indican anticuerpos positivos autoanticuerpos (ANAS) y midbody localización específica (datos no presentados). Anti SM, SSB, SSA, CENP-B, Jo-1, P ribosomal, y las histonas también se determinó inicialmente negativos de immunoblots.

Análisis de inmunofluorescencia

Cultura células de hámster (CHO), mono (CV1), ratón (3T3) y bovina (MDBK) se cultivaron en cubreobjetos a 37 ° C en la Dulbecco modificado a medio Eagle (Gibco, Life Technologies Inc), que contiene el 7% de suero de ternera fetal. Las células fueron fijadas en metanol durante 10 min. a - 20 ° C para la tinción de autoanticuerpos. El GLPL suero humano se utilizó en la dilución 1:400 en PBS durante 45 min a 37 ° C seguido de 4 × 5 min tiempo lavados en PBS. FITC-conjugado de cabra antihuman-Ig (Santa Cruz Lab. CA, EE.UU.) fue utilizado como un segundo anticuerpo en diluciones 1:100 en PBS durante 45 min a 37 ° C. Esto fue seguido por 3 × 10 min lavados en PBS. Las células fueron counterstained para Hoechst y montado en PBS: glicerol 9:1. La tinción se observó en un microscopio Zeiss epifluorescent e inmunofluorescencia imágenes fueron grabados por una cámara CCD Spot (Diagnostic Instruments Inc EE.UU.). Por doble microscopio de inmunofluorescencia indirecta, anticuerpos contra Aurora B (Abcam), INCENP (conejo 1186), alfa-tubulina (Aldrich) y secundaria de anticuerpos, junto a FITC, Texas rojo o Cy5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories) se utilizaron en las células humanas U2OS siguientes métodos anteriormente descritos [6]. ADN se visualiza con 0,5 ug / ml DAPI imagen y pilas fueron capturados utilizando un microscopio Olympus controlada por DeltaVision SoftWorx (Applied Precision). Las imágenes fueron deconvolved imagen y pilas rápido proyectado.

Extracto de células, antígeno recombinante preparación y análisis de inmunoblot

Extractos de células enteras se han preparado a partir de células HeLa cultura bloqueado con colcemid de lisis en tampón Laemmli SDS. Tres muestras de 10/20/40 microgramos de proteína se carga en un gel. El baculovirus cDNAs y construye para Aurora B, Sobrevivir, y INCENP han sido descritas previamente [7]. Insectos Sf-9 celdas estaban infectados con una combinación adecuada de las construcciones y complejos que contienen GST-Aurora B, GST-INCENP, y Su-Survivin fueron purificados en glutatión sepharose bolas (Amersham Biosciences) [8]. Extracto de células y proteínas expresadas fueron cargados en un 10% de acrilamida SDS-gel y transferidos a membranas de nitrocelulosa (Millipore) en presencia de Tris-HCl-glicina-SDS buffer [9]. La membrana se bloqueó en un 5% secado de leche en polvo en PBS-0,1% de Tween por 2 horas a temperatura ambiente, seguido de incubación con los humanos autoinmune GLPL suero a la dilución 1:200 en PBS a temperatura ambiente durante 12 horas. Varios lavados en PBS-Tween fueron seguidos por una reactividad y conjugado con peroxidasa de cabra anti-Ig humana (Sigma Chemical Co, EE.UU.) diluido 1:3000 en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se lavan de nuevo por 3 × 10 min período en PBS-Tween y desarrollado con 4-cloro-1-naftol (Sigma Chemical Co, EE.UU.) en PBS-metanol-H 2 O 2 hasta el color de las bandas aparecieron. Conejo específicos en suero de proteína para INCENP [6] fue ensayada como un control en blots con proteínas recombinantes de pasajeros complejo.

Resultados y Discusión
Celular distribución de la GLPL síndrome de autoantígenos

En un ensayo clínico de rutina por SI en las células HEP2 norma, la Graham-Little Piccardi-Lassueur suero mostró un midbody manchas que recuerdan de las proteínas cromosómicas de pasajeros (datos no presentados). Para caracterizar en detalle la respuesta autoinmune humana, la cultura U2OS células se analizaron mediante una prueba IF GLPL con el suero que muestra un patrón típico de tinción en interfase y mitosis las células. Durante la Profase autoantígenos se encontró en la condensación de los cromosomas, cada vez más concentradas en el centromeres [Figura 1B, GL]. Esto fue evidente en metafase, donde los autoantígenos fue localizado en la centromeres al parecer en todos los cromosomas [Figura 1C, GL]. Durante anafase y telofase la tinción se asoció con paquetes de microtúbulos en el huso central y en la división surco a lo indicado por doble tinción con anticuerpos anti-tubulina de anticuerpos [véanse los detalles en blanco y rojo en la figura 1D, E]. Estos patrones de IF en las células humanas de manera inequívoca que nos sugiere que la GLPL suero presentó reacción en contra de un componente cromosómico de pasajeros y esto representa una respuesta autoinmune en el paciente. Esto fue corroborado por doble SI tinción con anticuerpos específicos anti-INCENP suero (verde en la Figura 1A-E]. Por otra parte, para mostrar claramente que la GLPL autoantígenos localiza como un cromosómicas de pasajeros en las células humanas U2OS, cuatro manchas de color se realizó con anti-suero Aurora B (verde en la figura 1E-F]. Utilizando esta tecnología, de manera inequívoca que podemos mostrar claramente en la figura 1, que la GLPL autoantígenos (rojo), co-localizar con INCENP (blanco) y Aurora B (verde) las proteínas. El patrón observado SI no se limitaba a las células humanas, tal y como se muestra en la Figura 2. Cultura células de diferentes especies mostraron una similar si no idéntica SI patrón de tinción a los de las células humanas durante todas las fases del ciclo celular. Algunos ejemplos de localización SI observado en hámster [Fig. 2a, b], un ratón [Fig. 2c, d], bovina [Fig. 2e, f] y las células mono [Fig. 2g, h] se presentan. Idénticos cuando se encontraron patrones de la asociación GLPL autoantígenos a microtúbulos cromosómicos entre legajos y midbody durante la citocinesis en todas las líneas celulares ensayadas. Esto corrobora nuestra hipótesis inicial de que la respuesta autoinmune en los pacientes GLPL orientados varios componentes de la altamente conservadas por los pasajeros cromosómicas complejas ya descrito de la levadura a los seres humanos [10].

INCENP proteína es uno de los principales autoantígenos en un GLPL síndrome del paciente

El siguiente paso en nuestro estudio fue identificar las GLPL autoantígenos de la realización de análisis de inmunoblot. En primer lugar, hemos utilizado humanos extractos de células enteras para poner a prueba la reactividad del suero GLPL de transferencia Western-Blots. Como se muestra en la Figura 3A, el ser humano reacciona de autoanticuerpos en los extractos de células HeLa con un polipéptido 135 kD en un ensayo de valoración (carriles 1-3, Figura 3A]. Similar resultado se observó en blots con extractos de células CHO (datos no presentados), aunque otros polipéptidos de 91, 38, y 16 kd También se observaron cuando los blots fueron sobreexpuesta. Supuestamente, algunos de estos polipéptidos representan los autoantígenos (s) responsables de la SI patrón observado en las Figuras 1 y 2. Sobre la base de estos resultados SI, hemos decidido poner a prueba de reactividad del suero GLPL de inmunoblot cromosómicas en contra de un pasajero de proteínas complejas. Se utilizó un extracto de proteína (Figura 3B carril 1) que contiene tres de las principales proteínas de pasajeros centromere (INCENP, Aurora y Survivin B), expresada en la cultura Sf9 células de insectos por el sistema de baculovirus [11]. El inmunoblot mostró claramente una fuerte reactividad (asterisco en la Fig. 3B, carril 2) a la espera de peso molecular para el expresado INCENP componente del complejo de pasajeros cromosómicas (flecha hacia arriba en la Fig. 3B, lane1). No se observó reactividad de la misma mancha en contra de los otros dos componentes del complejo presentes en el extracto de proteína (dos flechas inferiores en la Fig. 3B, lane1). Una mancha de control contra la proteína expresada baculovirus con un complejo de anticuerpos específicos anti-suero INCENP muestra la movilidad de los INCENP componente proteínico (asterisco en la Fig. 3B carril 3). Figura 3, muestran claramente que los humanos GL y autoanticuerpos anti-suero INCENP reconoció la misma proteína en Blots. De este resultado se puede concluir que la proteína INCENP representa un importante autoantígeno en GLPL síndrome.

Se sabe que la mayoría de los anti-nucleares sueros autoinmunes (ANAS) en los seres humanos están dirigidos contra complejos macromoleculares de proteínas o proteína-ácidos nucleicos estructuras [12]. El centromere per se es un objetivo para las enfermedades autoinmunes y entre ellas la esclerodermia, síndrome de CREST [13], donde los principales centroméricas autoantigens descritos son CENP-A, CENP-B y CENP-C [14 - 16]. Si el GLPL autoanticuerpos utilizado en este informe reconoce también algunos otros antígenos centromere además de la INCENP proteína, o algún otro componente de la maquinaria mitótico, es una posibilidad que no puede excluirse, y más intensa experimentación será necesario. Estudios de immunoprecipitation y proyecciones de expresión bibliotecas están en marcha y podría servir para la prueba de esa posibilidad.

INCENP es un componente importante de la centromere durante varias fases del ciclo celular mitótico en el que desempeña un papel esencial en la segregación cromosómica y participa en los mecanismos que regulan la mitosis [9, 10]. El agotamiento de INCENP de RNAi resultados anormales en la estructura cromosómica y los defectos en la formación de eje central y la citocinesis [5]. La relación entre la autoinmunidad contra INCENP y GLPL enfermedad puede ser fortuito como para muchas otras respuestas autoinmunes en los seres humanos. Sin embargo los niveles de autoanticuerpos son buenos marcadores para la vigilancia de la conducta humana de muchas enfermedades autoinmunes [12].

El síndrome de GLPL representa una rara enfermedad y la documentación es escasa [2, 3]. Nuestro informe representa la primera evidencia de autoinmunidad en GLPL síndrome. Al seleccionar un número significativo de pacientes GLPL puede ser posible llegar a conclusiones acerca de la prevalencia y significado clínico de la respuesta autoinmune en esta enfermedad.

Agradecimientos

El artículo fue apoyado por el subsidio a MM Valdivia de la Junta de Andalucía (grupo CVI-167). El trabajo en el WC Earnshaw laboratorio está financiado por el Wellcome Trust. Estamos agradecidos a Roy Snart Inglés técnico para la revisión del manuscrito.