Kinetoplastid Biology and Disease, 2007; 6: 1-1 (más artículos en esta revista)

Un método para la identificación de conejillo de la harina de sangre en el vector de la enfermedad de Chagas, Triatoma infestans

BioMed Central
Juan Carlos Pizarro (jpizzaro@uvm.edu) [1], David Lucero (David.Lucero @ uvm.edu) [1], Lori Stevens (lori.stevens @ uvm.edu) [1]
[1] Departamento de Biología, Universidad de Vermont, 109 Carrigan Drive, Burlington, VT 04505, EE.UU.
[2] Facultad de Bioquímica, Universidad de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Sucre, Bolivia

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Resumen
Fondo

En un requisito basado en el ensayo de PCR, un conjunto de cebadores específicos para conejillo de corto genoma intercalados elementos de ADN fue usado para probar la utilidad de marcadores genómicos para identificar la fuente de vertebrados de sangre comidas de Triatoma infestans.

Métodos

La investigación consistió en dos ensayos. En el ensayo 1, treinta y seis insectos, recogidos en la provincia de Zudáñez en Chuquisaca, Bolivia se congelaron 1-40 horas después de la alimentación, bajo condiciones controladas, en conejillos de indias. Las especies de vertebrados de la acogida ha sido confirmado de disección de la parte posterior del abdomen de cada insecto seguida por extracción de ADN y amplificación por PCR. 2 ensayo investigó si la técnica trabajaban bajo condiciones de campo. Se analizó la harina de sangre de 34 insectos recogidos de los hogares y peri-estructuras internas de las comunidades donde salvajes en cautividad y conejillos de ocurrir. Después de recogida, los insectos se mantienen a temperatura ambiente durante 2 meses sin alimentación y, a continuación, analizó.

Resultados

En el ensayo 1, cada uno de los 36 permitió a los insectos se alimentan de conejillo de sangre positivo en las pruebas de conejillo de ADN. El conejillo de ADN fue identificado fiable en tan solo 1 hora y hasta 40 horas después de comer. Por ensayo 2, 8 de las 34 muestras (23%) mostraron resultados positivos con el conejillo de primers específicos.

Conclusión

Los resultados en 1 ensayo demostró que el ADN de vertebrados de acogida puede ser amplificado 1-40 horas después de la alimentación del abdomen se alimentan de sangre la enfermedad de Chagas vector Triatoma infestans. Los resultados del ensayo en 2 confirmó que el procedimiento funciona en los insectos recogidos de los hogares y periurbanas estructuras internas y que la fuente de la harina de sangre se puede determinar por lo menos 2 meses después de alimentación.

Fondo

La enfermedad de Chagas es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, y es transmitida por insectos bloodsucking de la subfamilia Triatominae (Hemiptera, Reduviidae). En la actualidad, las estimaciones indican que 13 millones de personas están infectadas con el agente causal, con 3.0-3.3 millones de casos sintomáticos y una incidencia anual de 200000 casos en 15 países [1]. Post-infección, de diez a 20 años asintomáticos condiciones de llevar a la posibilidad de condiciones cardíacas (27%) y probable muerte súbita, problemas del tubo digestivo (6%) y disfunción del sistema nervioso (3%) [2]. No hay vacuna contra el T. cruzi. El tratamiento con medicación no siempre es exitosa. Los medicamentos funcionan mejor en las primeras fases agudas, con una reducción de éxito de hasta 10 años después de la infección, especialmente en los niños menores de 14 años [3]. Los métodos recomendados de control de la enfermedad de cribado incluyen las donaciones de sangre, la eliminación de poblaciones de vectores domésticos enyesado de paredes de adobe y techos de azulejos y baldosas utilizando para reducir el hábitat del vector en los hogares, y la pulverización casas infestadas con insecticidas residuales [4]. Estos métodos, aunque eficaz a través de gran parte de América Central y del Sur, no han tenido éxito en Bolivia, donde la prevalencia de infección humana por casa y la infestación por el vector principal en este ámbito, Triatoma infestans, sigue siendo elevado. La interrupción de la transmisión también es complicada debido a que el parásito causante, T. cruzi, tiene múltiples hosts de mamíferos. Aunque los vectores se alimentan de una gran variedad de huéspedes vertebrados, incluidos mamíferos y aves, mamíferos sólo mantener una infección. Además, la persistencia de T. cruzi entre los ejércitos, varía entre regiones geográficas, siendo influenciada por el local de las poblaciones de vertebrados domésticos, peri-domésticos, así como las posibles zoonosis o "silvestres" vertebrados anfitriones. En muchas regiones geográficas perros y gatos son importantes fuentes de acogida de sangre a domicilio para T. infestans [5, 6], sin embargo, en las regiones andinas de Bolivia y Perú, el cuy doméstico (Cavia porcellus) es también un importante reservorio de T. cruzi [7, 8]. Selvático de las poblaciones de T. infestans sólo se sabe que se producen en el altiplano andino y, probablemente, son un factor importante en triatominos locales de la dinámica de la población y los patrones de reinfestación. Por lo tanto, los estudios sobre la capacidad de vectores para moverse entre los hábitats y colonizar las viviendas humanas son componentes importantes de control de la enfermedad, ya que ayudará a evaluar la dinámica que rige los contactos entre los seres humanos y los vectores [9] y determinar la estrategia más apropiada para la aplicación de insecticidas. La identificación de la fuente de la harina de sangre en el tracto digestivo de los triatominos hematófagos que transmiten la enfermedad de Chagas proporciona datos sobre la acogida de los patrones de alimentación y las preferencias en la naturaleza. Estos datos proporcionan información sobre las enfermedades epidemiológicamente importantes reservorios de la más grave enfermedad parasitaria humanos de las Américas en términos de impacto social y económico [10].

Históricamente, la harina de sangre de identificación de insectos hematófagos se han basado en antígeno-anticuerpo reacciones [11, 12] la búsqueda de antígenos presentes en la sangre comidas utilizando anticuerpos específicos desarrollados por la estimulación con el mismo tipo de molécula. Estos métodos han demostrado ser útil para la identificación de diferentes especies animales, pero estos enfoques son mano de obra intensiva y los límites de detección son restrictivas [9].

Reacción en cadena de polimerasa (PCR), análisis de cada especie, las secuencias de ADN mitocondrial es actualmente el más utilizado método para la identificación de las especies. Varios genes del ADN mitocondrial, como se conserva secuencia de bloques (operadores privados), 16S ribosomal RNA genes y citocromo b (cytb) de genes, usados para el estudio de la evolución animal [13] se puede utilizar para identificar las fuentes de harina de sangre. La ventaja de mitocondrial basado en análisis de ADN se deriva del hecho de que hay muchas mitocondrias por célula, por lo que es más fácil de extraer cantidades suficientes de ADN confiables para amplificación por PCR [14]. Sin embargo, cada especie primers mitocondrial no son viables para los niveles más bajos de la clasificación taxonómica necesaria cuando se alimentan de los vectores de múltiples hosts. Identificación de especies de ADN mitocondrial requiere la clonación y secuenciación de múltiples clones de cada vector para determinar la identidad de especies huésped alimentados al respecto. Recientemente, el desarrollo de ensayos de PCR basado en secuencias cortas de elementos intercalados (Sines) ha informado de la detección de especies de origen ADN. Una serie de clases específicas (Aves), el orden específico (Rodentia), y cada especie (equinos, caninos, felinos, ratas, hámster, cuy, conejo y [14], humanos [15], las especies bovina, porcina, pollo, y rumiantes [16]] los ensayos de PCR han sido diseñadas para la identificación de ADN de fuentes complejas.

Elementos repetitivos pueden subdividirse en aquellos que están dispuestos tandemly o intercalados (por ejemplo, elementos móviles y procesados pseudogenes). Intercalan elementos repetitivos pueden subdividirse sobre la base de su tamaño, intercalados con elementos corto (Sines) está secuencias repetitivas con una longitud de 70-500 pb que se han generalizado entre los genomas eucariotas [17]. Todos los genomas eucariotas contienen elementos móviles, aunque la proporción y la actividad de las clases de elementos varía ampliamente entre los genomas. La mayoría de mamíferos Sines han aparecido en los últimos 65 millones de años y se cree que se han extendido por todo el territorio de cada a través de un genoma de RNA mediada por la duplicación proceso denominado retroposition [18]. Su retrotransposition depende de la transcriptasa inversa y las actividades de endonucleasa codificada por los líneas (larga elementos intercalados). Más de 30 familias de Sines se han caracterizado en los genomas de mamíferos, que comprende 4600 especies existentes. Todos los mamíferos fin tiene un número considerable (> 100000) característica de elementos móviles proporcionando etiquetas específicas que pueden utilizarse en una PCR para amplificar secuencias específicas de ADN mixto fuentes [14]. El conejillo de ID3-SINE/ID (AF312680, [14]] utilizado en este ensayo tiene un estimado 200-3000 copias en el conejillo de genoma [19]. Especies primers específicos se han desarrollado y utilizado para la identificación de los biomateriales a partir de fuentes complejas, así que hemos probado su viabilidad para el contenido abdominal de triatominos.

Fiable y eficiente determinación de las pautas de conducta de alimentación de la enfermedad de Chagas vectores es importante para la epidemiología de evaluación de la enfermedad. El uso de especies de primers específicos en la PCR tiene el potencial para descifrar cada uno de los componentes de una multiplicidad de especies mezcla de ADN. Porque la comprensión del vector movimiento y preferencias alimentarias son importantes para el éxito de los programas de fumigación de vectores que experimentalmente a prueba la capacidad de PCR para la detección de vertebrados de sangre en el abdomen de T. infestans de 1-40 horas después de la alimentación (1 ensayo) y en triatominos recoger de las comunidades en el departamento de Chuquisaca, Bolivia, donde salvajes y domésticos se producen cuyes (ensayo 2).

Resultados

Los resultados de 1 ensayo verificó que los primers con éxito amplificación de ADN extraído del abdomen de un adulto y dos ninfas de T. infestans incluidos en la muestra 1, 3, 5, 9, 11,13, 15, 18, 24, 30, 35, 40 horas después de comer. No se observó amplificación en los controles negativos. El tamaño del fragmento de la experimentación y control positivo reacciones fueron como se esperaba para el cuy (Figura 1]. La comparación de la secuencia de los productos de PCR para los que están en GenBank confirmó que el producto amplificado fue conejillo de ADN. Los resultados del ensayo indican que en la mayoría de 1 hora que se necesita para la acogida de ADN para llegar al abdomen, donde se sigue presente después de 40 horas.

Los resultados del ensayo revelaron 2 conejillo de ADN en el 23% (8 de los 34 bugs) de los vectores de recogida doméstica y peri-estructuras internas. No hubo diferencia en la probabilidad de amplificación para los insectos de diferentes hábitats o las fases de la vida. Estas extracciones de ADN han sido utilizados para el análisis de microsatélites de insectos (datos no publicados), lo que indica que las muestras negativas no son simplemente los resultados de la inhibición de la PCR. Además, algunas de las muestras negativas fueron inoculadas con 0,3 ng conejillo de ADN y PCR con posterior conejillo de primers específicos mostró una amplificación en todos los casos.

Discusión

La sensible y fiable de identificación de la sangre desde el complejo de fuentes ha sido un objetivo importante en estudios que involucran la ecología de las enfermedades infecciosas. Con respecto a T. infestans, estudios previos de identificación de las especies utilizadas anti-sueros específicos de reacciones cuya especificidad es limitada a nivel de género [5, 20]. Existen varias ventajas a lo largo de PCR métodos serológicos. En primer lugar, la PCR es muy sensible que requiere sólo una pequeña cantidad de material biológico que no necesita ser mantenido frescos o congelados. Además, cuando amplicones son relativamente pequeñas, incluso de ADN altamente degradado plantillas pueden ser amplificados [14]. Cuando cartillas están dirigidas a multi-copia de ADN nuclear, ADN o de orgánulos como las mitocondrias que son abundantes en muchos tipos de tejidos, tales ensayos puede ser muy delicada. Otra ventaja es que los métodos basados en PCR puede utilizar gel de agarosa simple análisis. Hemos desarrollado un ensayo basado en la PCR en basada en una secuencia de ADN nuclear con un alto número de copias. Los reactivos disponibles comercialmente, el ensayo tiene un costo relativamente bajo para el análisis a gran escala y un mínimo de necesidades de equipo, por lo que los laboratorios con recursos modestos son capaces de realizar estos ensayos.

En este estudio se evaluó una especie (cuy) el ensayo de PCR para la identificación de ADN extraído de la harina de sangre de la heamatophagous la enfermedad de Chagas vector T. infestans sobre la base de intercambios intracomunitarios de SINE amplificación de PCR específica del genoma intercalados elementos repetitivos. Para el ensayo 1, 34 segundo, tercero, cuarto y quinto estadio ninfas y dos hombres adultos recolectados de una cabra corral en Jackota se analizaron los de ensayo 2 fueron de 31 insectos domésticos y peri-domésticos en los hábitat Zurima y tres especímenes de la misma cabra corral en Jackota examinados en el ensayo 1. Es probable que la mayoría de los insectos en el ensayo 1 ya había alimentado a los animales que no sean conejillo de, por lo tanto, la extracción de muestras de ADN obtenidas después de la alimentación con cobayos, además de cuy y T. infestans de ADN, puede haber tenido el ADN de vertebrados adicionales, así como el ADN del parásito, T. cruzi. Ensayo se demostró la especificidad de conejillo de amplificación de ADN de esta sociedad mixta de especies plantilla seguido de la confirmación a través de secuenciación del ADN.

Porque fuimos capaces de detectar una fuente de sangre con una mezcla de ADN, la técnica debe ser capaz de clasificar los mestizos comidas utilizando un protocolo múltiplex con diferentes especies de primers específicos. Un estudio utilizando un ensayo de heterodúplex para identificar bloodmeals en el vector de la enfermedad de Chagas Triatoma longipennis en comparación citocromo b conformaciones de ADN con las pautas de las normas de control [9]. Los autores declararon que las comidas mestizos probablemente en por lo menos el 6% de los insectos que examinó, sin embargo, el ensayo de heterodúplex no está en condiciones de hacer la identificación en estos casos. Especies-PCR primers específicos tienen la ventaja de que puede ser usado para amplificar específicamente un ADN de una persona física mixta de la harina de sangre. Habiendo fiable y de bajo costo ya los primers desarrollados para las aves y los mamíferos que constituyen la principal fuente de alimento para los vectores de la enfermedad de Chagas, debería ser posible llevar a cabo una evaluación completa del perfil de alimentación de los triatominos. En la práctica, la capacidad de detectar y caracterizar una mezcla de la harina de sangre dependerá de la concentración relativa del ADN de cada una de acogida presentes en la harina de sangre, así como "procesos estocásticos, como la selección de PCR y PCR deriva, que pueden afectar la relativa eficiencia de la amplificación por PCR de dos o más objetivos en una plantilla mixta "[11].

La amplificación del genoma específicas de SINE-conejillo de ensayo se basa en un marcador con sólo 71 pares de bases aumentar la capacidad de identificar el ADN de muestras muy degradadas. Esto es una ventaja frente a otras técnicas, especialmente para muestras antiguas o las muestras de insectos muertos. Estudios previos usando PCR para detectar T. cruzi en vectores de Triatominos encontró que el estómago es más negativa que a menudo intestino y el recto muestras mostraron mucho menos la inhibición de la PCR, lo que refleja bien las diferencias en la distribución de T. cruzi o inhibición de la PCR [21]. El método que aquí se presenta, de extraer las muestras de recto y parte posterior del abdomen utilizando el kit DNeasy (Qiagen, Valencia CA) no mostrar PCR. inhibición de problemas. Los resultados mostraron que las muestras anotadas como negativas para conejillo de sangre en el ensayo 2 podría amplificar el ADN de "adición" y, posteriormente, ampliar conejillo de ADN; este procedimiento de amplificación de ADN en todas las muestras analizadas.

En este estudio, el conejillo de ensayo específicos constantemente amplificado el ADN diana de ninfa y adulto T. infestans de uno a 40 horas después de comer. Debido a la enfermedad de Chagas son los vectores de larga vida, es probable que se alimentan de varios equipos. La detección de alimentación durante semanas o meses puede proporcionar importante información sobre las preferencias de alimentación y movimiento de acogida. Nuestros resultados de ensayo 2 demuestran que el ADN permanece en el sistema digestivo de los insectos, por lo menos dos meses. Heterodúplex análisis en T. longipennis encontrado rastros de ADN de la sangre en las comidas vectores hasta 30 días después de alimentación [9]. Ensayo 2 se extiende el límite superior de detección de sangre comidas a dos meses. Aunque un resultado positivo indica pasado de alimentación en una cobaya, para un resultado negativo un estudio más a fondo es necesaria para determinar si conejillo de ADN está ausente o es debido a la pérdida de señal en el tiempo y la velocidad a la que, una harina de sangre o se elimina degradado hasta el punto que ya no pueden ser detectados.

Los ensayos 1 y 2 comidas incluidas sangre de cerdos de guinea nacional a partir del 2 de diferentes regiones y diferentes etapas de desarrollo en la zona de Chuquisaca. En todos los casos el 2% electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio tinción no detectó diferencias en los tamaños de los fragmentos de ADN de todas las muestras positivas. GenBank las secuencias de ADN de ambos estudios publicados y no publicados y secuencias de PCR nuestros productos son idénticos y se confirmó la identidad de nuestro producto de PCR como C. porcellus. Doméstica cobayas, una comida regional, se mantienen en las casas. Wild cobayas son nativos de esta zona y, a menudo, madriguera en los montículos de roca dentro de corrales de cabras. Hemos sido capaces de detectar conejillo de ADN recogidos en los insectos, tanto dentro como fuera de las casas. Porque salvajes y domésticos son conejillos de la misma especie, con idénticas secuencias de la región de ADN examinados, no hemos podido diferenciar si hay intercambio activo de triatominos entre estos dos hábitats o las que se alimentan de su propio hábitat anfitriones.

El potencial de ADN basados en marcadores moleculares para detectar la fuente de alimentación de artrópodos de sangre ha sido reconocido recientemente [22]. Estas técnicas pueden contribuir a grandes avances en nuestro estudio de la dinámica de transmisión de enfermedades transmitidas por vectores. El desarrollo de las especies marcadores específicos que pueden detectar la alimentación a un mínimo de dos meses después de alimentación presenta un valioso instrumento para la lucha contra la enfermedad de Chagas, una social y económicamente devastadores de enfermedades infecciosas en América del Sur [10].

Conclusión

En este estudio hemos evaluado una especie-específicos (cuy) basados en PCR ensayo para determinar el souce de los vertebrados de sangre en el abdomen de la enfermedad de Chagas heamatophagous vector Triatoma infestans.

Hemos demostrado que el ADN de vertebrados de acogida puede ser amplificado 1-40 horas después de la alimentación desde el abdomen de triatominos. Este estudio también confirmó que el procedimiento funciona en los insectos recogidos de los hogares y periurbanas estructuras internas y que la fuente de la harina de sangre se puede determinar por lo menos 2 meses después de alimentación.

Este ensayo posee una capacidad única para analizar los componentes de una multi-muestra de ADN. Proporciona un interfaz simple, confiable basada en el ADN de prueba para la detección de conejillo de sangre presentes en las heces y el contenido recto de la reduviid vector de la enfermedad de Chagas.

Métodos
La recogida de muestras

El estudio constó de dos partes. 1 ensayo controlado en un experimento de laboratorio para evaluar la utilidad de la PCR para identificar conejillo de sangre hasta 40 horas después de insectos engorgement. Treinta y cuatro segundo, tercero, cuarto y quinto etapa ninfas y dos machos adultos se obtuvieron de una cabra corral en Zudañez, departamento de Chuquisaca, Bolivia. Ellos se mantuvieron, unfed, en recipientes de plástico con papel de filtro plegado a temperatura ambiente (~ 17 ° C).

Después de tres meses los insectos se permitió que se alimentan de sangre de cerdo guinea colocando cinco insectos en cada uno de los siete cajas que contienen una cobaya. Guinea cerdos (Clase: Mammalia; Orden: Rodentia; Familia: Caviidae, género y especie: Cavia porcellus) pesaba unos 400 gramos. Las jaulas estaban cubiertas con un paño oscuro y mantenerse en un entorno tranquilo, mientras que el experimento se llevó a cabo. Después de una hora, todos los insectos fueron capturados vivos. Tres insectos fueron asesinados en este momento, y los restantes se llevaron a cabo en grupos de tres por cada contenedor de plástico hasta que el tiempo de muestreo designados (1, 3, 5, 9, 11,13, 15, 18, 24, 30, 35, 40 horas después de la alimentación), momento en el que los insectos fueron muertos por inmersión en etanol al 96%. Cada grupo de tres insectos estuvo de 2-3 diferentes etapas nymphal o dos ninfas y un adulto. Los insectos fueron enviados a Burlington, Vermont, EE.UU. a través de mensajería urgente, donde fueron almacenados a -20 ° C hasta su análisis. Este protocolo fue aprobado por la Universidad de San Francisco Xavier de Chuquisaca Comité de Investigación Animal y sigue directrices reconocidas internacionalmente.

Para el ensayo 2 se examinaron 20 tercera, cuarta y quinta etapa de ninfas y 14 adultos T. infestans recolectados en 2004 a partir de nacionales y periurbanas en las estructuras nacionales Zurima y un corral en la comunidad de Jackota, Departamento de Chuquisaca, Bolivia. Los insectos fueron mantenidos como se ha descrito anteriormente durante dos meses luego asesinados en el 96% de etanol y enviada a Burlington, Vermont, EE.UU. se fueron almacenados a -20 ° C hasta su análisis.

Extracción de ADN

Una nueva hoja de afeitar se utilizó para recoger 25 mg de tejido de la parte posterior de cada abdomen del insecto. El corte se hizo tan cerca de la parte posterior como sea posible para evitar el estómago. Tras la extracción de ADN utilizado el kit DNeasy (Qiagen, Valencia CA), tras el protocolo de tejidos animales con 24 horas de lisis. Concentración de ADN se midió utilizando un Espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Nanodrop, Bethesda, MD).

Amplificación por PCR

La amplificación por PCR produjo un fragmento de 71 pb utilizando primers específicos para conejillo de multi-copia de ADN nuclear a corto elementos intercalados (Sines): 5'-GGG ATT TAG CTC AGT GGC ATA AG-3 ', 5'-ATT GGT GGG GAT CAC TGA ACT-3 ', (Repetir elemento SINE ID3 / ID; adhesión no. AF312680 [14]].

Reacciones de 10 μ M de cada cebador, un Ready-To-Go PCR bolas (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) y la biología molecular grado agua a 25 μ l. Hemos añadido 50-100 ng de ADN para cada reacción, sin embargo, porque el ADN extraído de los vectores que figuran por lo general, al menos, dos tipos de ADN (por ejemplo, los insectos + cuy) que no hemos podido cuantificar el importe de conejillo de ADN en cada reacción. Cada muestra fue sometida a una desnaturalización inicial de 1 min. a 95 ° C seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, 60 ° C a Anneal durante 30 s y 30 s de extensión a 72 ° C. Amplicones se cromatografía en un 2% en gel de agarosa con un tamaño de 100 bp estándar, teñido con bromuro de etidio y visualizado mediante fluorescencia ultravioleta. Controles positivos utilizando el ADN extraído del hígado de cobayos de laboratorio confirmaron la capacidad de los cebadores para amplificar el ADN buscado, controles negativos no tenía ADN.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

JCP: participó en la concepción y el diseño del estudio, llevado a cabo la recogida de muestras, extracción de ADN y análisis de PCR redactado el manuscrito. LS: participó en la concepción y diseño, ayudó a optimizar la extracción y análisis de PCR y ayudó a redactar el manuscrito. DL: llevó a cabo la PCR basada en la detección de ensayo. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero de Becas Fulbright (JCP), NSF DUE-0436330 (LS), y UVM Honor del Colegio (DL). También damos las gracias a Lila Specker, Erin Michaud, Bior K. Bior y James Wood para la asistencia técnica.