BMC Cancer, 2007; 7: 7-7 (más artículos en esta revista)

Los vasos linfáticos en la evaluación de felinos tumores mamarios

BioMed Central
Giuseppe Sarli (giuseppe.sarli @ unibo.it) [1], Francisco Sassi (fsassi@vet.unibo.it) [1], Bárbara Brunetti (bbrunetti@vet.unibo.it) [1], Antonio Rizzo (ac. antoniorizzo@libero.it) [1], Laura Diracca (giuseppe.sarli @ unibo.it) [1], Cinzia Benazzi (cinzia.benazzi @ unibo.it) [1]
[1] Departamento de Salud Pública Veterinaria y Patología Animal, Tolara Via di Sopra, 50 - 40064 Ozzano Emilia - Bolonia - Italia

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Resumen
Fondo

Los vasos linfáticos juegan un papel crucial en una variedad de cánceres humanos ya que las células tumorales invasión linfática influye significativamente el pronóstico. No se sabe si preexistentes linfáticos son suficientes para la difusión de tumores de novo o el desarrollo es necesario. VEGFR-3 es un mediador angiogenetic para ambos linfáticos y los vasos sanguíneos durante el desarrollo embrionario, y solamente para linfáticos después de su nacimiento. El VEGF es un mediador de la angiogénesis y vasculogénesis, regula el crecimiento de linfáticos en diversos modelos experimentales, y se produce en muchos tumores sólidos. CD44 media de ácido hialurónico (AH) que dependen de la adhesión celular: además de promover la invasión, esta interacción también apoya neoangiogenesis que indirectamente estimula la proliferación de las células tumorales. La expresión de VEGF-C (factor de crecimiento endotelial vascular - C), su receptor VEGFR-3 y CD44, se estudiaron en las muestras de felinos mamaria para evaluar la importancia de la LI y en lymphangiotrophism neoplasia.

Métodos

Se tomaron muestras de seis glándulas mamarias normales (NMG), diez benigna (BT) y 32 malignos (MT) tumores. Inmunohistoquímica laminin/VEGFR-3 doble mancha, VEGF-C CD44 y las manchas se aplicaron a 4 μ m de espesor secciones, y su expresión evaluada en intratumoral / extratumoral intramamarios y / extramamaria campos.

Resultados

Todos los grupos reveló un mayor número de linfáticos en la extratumoral / extramamaria. VEGF-C expresión en el epitelio paralelo el número de positivos en los buques de NMG, BT y MT, mientras que el VEGF-C de la expresión se observó en los campos intratumoral sólo en infiltrarse en MT. CD44 puntuación fue menor que en extratumoral intratumoral en los campos y los tumores mostraron un incremento significativo en extramamaria / extratumoral campos de NMG a MT. Pearson ensayo mostró una significativa y correlación inversamente proporcional entre la expresión CD44 y el número de los vasos linfáticos con el VEGFR-3 en infiltrarse en los tumores malignos.

Conclusión

El número de VEGFR-3 positivos y negativos de linfáticos en la extratumoral y extramamaria estroma fue significativamente superior a intratumoral y intramamaria campos, respectivamente, en los NMG, BT y MT. Esto sugiere una escasa importancia biológica de la presencia de linfáticos intratumorales mientras que su número es mayor debido a la concentración de los buques existentes tras la compresión del estroma extratumoral a pesar de un aumento no demostrable de NMG a MT. El tumor modelo empleado no presentó pruebas de LI, y la metástasis en los ganglios linfáticos regionales se desarrolla a raíz de la propagación a través de la preexistente red linfática.

Fondo

Los vasos linfáticos juegan un papel crucial en una variedad de cánceres humanos ya que las células tumorales invasión linfática y posterior desarrollo de metástasis ganglionares influye significativamente el pronóstico. Por lo tanto, la vía linfática es una parte integral de estadiaje del tumor [1].

Es bien sabido que para muchos carcinomas de transporte de las células tumorales a través de los linfáticos es el patrón más común de difusión inicial. Sin embargo, no se sabe si preexistentes linfáticos son suficientes para la difusión de tumores de novo o el desarrollo es necesario [2].

Hasta los últimos años, la falta de marcadores específicos ha planteado problemas para documentar con exactitud la forma en que el sistema linfático se desarrolla. Los marcadores recientemente identificados son los genes homeobox Prox-1, participan en las primeras fases de los vasos linfáticos desarrollo [3]; Podoplanin, un 43 kDa mucoprotein encuentran en la membrana glomerular podocytes de [4]; LYVE-1 (endotelial linfática buque hyaluronan receptor-1), un receptor endotelial linfático para hyaluronan, la matriz extracelular y el líquido linfático glucosaminoglucanos [5].

Estos marcadores parecía haber resuelto el problema de la detección de los vasos linfáticos y, sobre todo, su diferenciación histológica de los vasos sanguíneos. Sin embargo, estas moléculas no siempre son detectables en los tejidos animales, y deben utilizarse con determinados marcadores de los vasos sanguíneos para discriminar entre los dos tipos de buques. Muchos estudios de relieve los límites de estos marcadores, es decir, LYVE-1 está presente no sólo en los vasos linfáticos, sino también en los sinusoides hepáticos sangre [6], con un comportamiento variable en función de los tipo de tumor [5]. Podoplanin no es muy específica, ya que también es expresada por glomerular podocytes. Prox-1 tiene un papel importante en el desarrollo embrionario de los vasos linfáticos [3], pero no está claramente expresada en linfáticos después de su nacimiento o en los adultos [7].

El papel de VEGFR-3 (factor de crecimiento endotelial vascular Receptor-3) como un mediador angiogenetic se demostró en ambos linfáticos y vasos sanguíneos durante el desarrollo embrionario, y solamente para linfáticos (LI) después del nacimiento [8]. VEGFR-3 es el receptor de VEGF-C, y pertenece al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteína de la familia. VEGF, descubierto en 1989, es un importante mediador de la angiogénesis y vasculogénesis. VEGF-C regula el crecimiento de linfáticos en diversos modelos experimentales [9], y se produce en muchos tumores sólidos [10]. Su nivel de expresión ha sugerido que son equivalentes a la angiogénesis y la metástasis a través del sistema linfático [11].

CD44 es una ampliamente distribuida glicoproteína transmembrana desempeñando un papel fundamental en una variedad de comportamientos celulares, incluyendo la adhesión, migración, invasión, y la supervivencia [12]. CD44 media de ácido hialurónico (AH) que dependen de la adhesión celular [13]: además de promover la invasión, esta interacción también apoya neoangiogenesis que indirectamente estimula la proliferación celular tumoral [14].

Nuestra investigación empleó un modelo animal para conocer el uso vía linfática a metástasis, es decir, el felino carcinoma mamario, a fin de evaluar la importancia de la LI como un paso en este tumor modelo para la propagación de células neoplásicas a través de los linfáticos en lugar de los vasos sanguíneos.

Métodos
Casos

Las muestras utilizadas en su origen en 48 casos: seis normal de glándulas mamarias, diez tumores benignos (túbulo-papilar, adenoma) y 32 malignos (seis carcinomas in situ, 12 túbulo-carcinomas papilares y 14 carcinomas sólidos) de la glándula mamaria de gatas. La aprobación ética para el estudio no fue necesario porque los casos fueron seleccionados entre los recogidos de manera sistemática en el laboratorio de histopatología con fines de diagnóstico después de una mastectomía.

Cada espécimen se había fijado en formol e-parafina y cera incrustados y los diagnósticos histológicos se realizaron en hematoxilina-eosina tiñen las secciones de acuerdo con los criterios de la OMS por Misdorp et al. [15]. Neoplasias malignas fueron clasificados de acuerdo con el estudio histológico en escena método desarrollado por Gilbertson et al. [16] en el perro y adaptarse a el gato de Mandelli et al. [17] como sigue: 0 (St0) o malignos no infiltrante del tumor, cuando la proliferación neoplásica se ve limitado por la membrana basal (todos estos casos pertenecen a los carcinomas in situ de la OMS [15] clasificación); fase I ( ITS) o la infiltración tumor maligno con invasión del estroma (es decir, el tumor proliferado más allá de la membrana basal y el invadido estroma circundante); fase II (StII) o la infiltración tumor maligno con linfático o embolia arterial y / o regionales de metástasis ganglionares. Sobre la base de este sistema de gradación, el 6 de tumores malignos como resultado 0 (in situ), 14 fase Iy fase II 12.

Inmunohistoquímica

Cuatro μ m de espesor secciones de todas las muestras fueron immunohistochemically coloreen con un doble laminin/VEGFR-3 mancha, VEGF-C CD44 y manchas.

Laminin/VEGFR-3 doble mancha de reacción

Secciones de formol-fijos y embebidos en parafina las muestras fueron dewaxed y rehidratada. Antígeno fue desenmascarada con el 0,05% Pronase E (1,07433, Merck, Darmstadt, Alemania) en Tris buffer de pH 7,4 durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de citrato de amortiguación (2,1 g de ácido cítrico monohidrato / litro de agua destilada) pH 6,0 en un horno a microondas 750 W (dos ciclos de 5 minutos cada uno); a continuación, las secciones se permitió enfriar a temperatura ambiente durante 20 min. El primer paso fue inmunohistoquímica el bloque de peroxidasa reactivo con Dako Envision ™ Doublestain System (Dako, Amsterdam, Los Países Bajos) durante 5 min seguido de primaria policlonal de conejo anti-ratón laminina de anticuerpos (Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.), diluido 1:200 en PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina aplicada la noche a 4 ° C. Después de un lavado con buffer TRIS la peroxidasa etiquetados componentes (como cromógeno Diaminobencidina) de la Dako Envision ™ Doublestain del sistema se utilizan para revelar esta parte de la doble tinción inmunohistoquímica. Después de un paso doble con tinción de bloquear la solución Dako Envision ™ Doublestain Sistema, que es el principal policlonal de conejo anti-ratón FLT-4/VEGFR-3 de anticuerpos (Alpha Internacional de diagnóstico, San Antonio, Texas, EE.UU.) diluido 1:350 en PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina, se aplicó durante 60 min a temperatura ambiente. Después de un lavado con buffer TRIS la fosfatasa alcalina etiquetados componentes (rojo rápido como cromógeno) de la Dako Envision ™ Doublestain del sistema se utilizan para revelar esta segunda parte de la doble tinción inmunohistoquímica. Aparte de anticuerpos primarios, todas las demás medidas se llevaron a cabo tras el kit las instrucciones del fabricante. Las secciones se counterstained con hematoxilina de Mayer y montadas con Dako Glycergel Montaje Mediano (Dako, Amsterdam, Los Países Bajos). Controles negativos fueron alcanzados por incubando las diapositivas con un no de anticuerpos específicos del mismo isotipo. Como controles positivos para evaluar la reactividad cruzada con tejidos felino y la especificidad de la tinción inmunohistoquímica de la lucha contra el VEGFR-3 de anticuerpos un tramo de intestino felino fue utilizado con el mismo protocolo, que emplean a uno de los dos inmunohistoquímicos Dako Envision ™ Sistema Doublestain pasos. La especificidad y reactividad cruzada de la lucha contra la laminina mancha fueron evaluados como se esperaba en el sótano membranas que rodean las estructuras glandulares de NMG, BT y MT, y en torno a los buques que contengan sangre.

VEGF-C CD44 y manchas

Cuatro μ m de espesor secciones se dewaxed en tolueno y rehidratada. Peroxidasa endógena fue bloqueada por inmersión en el 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 20 min. Las secciones fueron entonces enjuagarse en Tris Buffer y la recuperación de antígeno fue obtenido únicamente para anti-CD44 mancha con solución tampón de citrato (2,1 g de ácido cítrico monohidrato / litro de agua destilada), pH 6,0, y calefacción por dos de 5 min períodos en un horno microondas a 750 W, seguida de refrigeración a temperatura ambiente durante 20 min. Las secciones fueron preincubated con suero de proteína libre de bloque (Dako, Amsterdam, Los Países Bajos) durante 10 minutos a temperatura ambiente. El principal anticuerpos anti-VEGF-C, clon Z-CVC7, diluido 1:12.5 (Zymed laboratorios inc., San Francisco, California, EE.UU.) y anti-CD44var (v5), clon VFF-8, diluido 1:12.5 (Bender MedSystems, Vienna, Austria) se aplicaron durante la noche a 4 ° C y fueron seguidos por un comercial streptoavidin-biotina-peroxidasa técnica (LSAB Kit, Dako, Amsterdam, Los Países Bajos). Diaminobencidina (0,05% durante 10 min a temperatura ambiente) se utilizó como cromógeno. Las diapositivas se counterstained Papanicolaou con la hematoxilina. Controles negativos se obtuvieron sustituyendo el anticuerpo primario no guardan relación con un anticuerpo monoclonal del mismo isotipo. Como controles positivos para evaluar la reactividad cruzada con tejidos felino y la especificidad de la tinción inmunohistoquímica de los anti-VEGF-C y anti-anticuerpos CD44, una sección de tejido de granulación de un felino de curación piel y una lesión de un felino anaplásico mamaria carcinoma, respectivamente, fueron utilizados siguiendo el mismo protocolo.

Métodos de calificación

Expresión inmunohistoquímica se evaluó en intratumoral (los campos elegidos al azar entre los lóbulos en el interior del tumor) y extratumoral zonas (entre la frontera exterior de la neoplasia y la hipodermis o el músculo / estroma plan del abdomen o tórax). Intramamarios y extramamaria campos fueron seleccionados en la glándula mamaria normal de examinar cualquier zona en que lobuli normal y / o del tejido conectivo interlobular en el primer caso, y la hipodermis o el músculo / estroma plan del abdomen o tórax en el segundo.

Los vasos linfáticos y no expresar expresar VEGFR-3 fueron contados en diez intratumoral / intramamaria campos y 20 extratumoral / extramamaria campos. Cada campo tiene una superficie de 0,789 mm cuadrados y el microscopio utilizado fue el objetivo 20x. Condes se expresan como el número de los vasos linfáticos en diez cuadrados millimitres.

VEGF-C CD44 inmunohistoquímica y expresiones fueron analizados con un objetivo de 40x (correspondiente a 0,196 mm 2) en cinco intratumoral (intramamarios) y diez extratumoral (extramamaria) los campos, seleccionar las zonas con mayor expresión (Hot Spots) en el bajo aumento. En cada zona immunostained, VEGF-C y CD44 se expresaron como índice de puntuación de los epiteliales, adenomatosa y carcinomatosas componentes de la siguiente manera: ausente = 0, es decir, sin células positivas por campo; bajo = 10, hasta diez células positivas por campo; intermedios = 100, menos del 50% de células positivas por campo; alto = 1000, más del 50% células positivas por campo. Sólo para VEGF-C fueron el número de positivos los buques en el mismo campo también cuenta.

El análisis estadístico

Las variables (número de expresar linfáticos y no expresar VEGFR-3, C-VEGF y CD44, los marcadores y el número de VEGF-C expresando los buques) se realizarán las pruebas de normalidad con Shapiro Wilk's W ensayos y los datos no muestran una distribución normal. Comparación entre los casos agrupados como para el diagnóstico (glándula mamaria normal, benignos y los tumores malignos), sitio de evaluación (intratumoral / intramamaria, extratumoral / extramamaria) y el nivel de invasión (no infiltrante, localmente invasivos (ITS) y con embolia intravascular (StII) ) Fueron evaluados con el test de Spearman rango. De correlación de Pearson se empleó la prueba para examinar la relación de variables. Los análisis se realizaron de software CSS (Statsoft, Tulsa, OK, EE.UU.) las estadísticas, y un 5% convencionales nivel se utilizó para definir la significación estadística.

Resultados
Inmunohistoquímica anti-laminin/anti-VEGFR3 doble mancha

La laminina en la membrana basal manchado marrón (según el cromógeno utilizado), y VEGFR-3 rojo intenso (figura 1]. La laminina mancha también fue visible en el sub-espacio del endotelio de vasos sanguíneos que contiene alrededor de los alvéolos y conductos a NMG y alrededor de los túbulos y papilas en la mayoría de BT y MT. VEGFR-3 en los controles se reveló como una mancha de citoplasma granular en algunas células endoteliales de los lacteals y en algunos sangre que contiene y no contiene vasos sanguíneos de la pared intestinal. Los vasos linfáticos se reconocen cuando la mancha se laminina unappreciable (ausencia de la membrana basal), asociadas o no con VEGFR-3 en el citoplasma de la mucosa endotelio. Sangre capilares se reconocen cuando positiva continua laminina mancha estaba presente, asociadas o no con positivo VEGFR-3 manchas rojas en el citoplasma de la mucosa endotelio. El estudio muestra sólo los resultados de la cuantificación de linfáticos. VEGFR-3 manchadas expresión positiva tanto en la sangre y el endotelio linfático, en el epitelio de la glándula mamaria normal y en benignos y los tumores malignos.

Descriptivo de los datos estadísticos del número de linfáticos con o sin VEGFR-3 en los grupos de comparación se presentan en el cuadro 1. El número total de los vasos linfáticos (es decir, aquellas que expresan y no expresar VEGFR-3) fue significativamente mayor en los extratumoral / extramamaria que intratumoral / intramamaria zonas (test de Spearman: P <0,01 para NMG y MT; P <0,05 para BT) . Ambos números de linfáticos con o sin VEGFR-3 en los carcinomas y NMG había importantes valores más altos en extramamaria / extratumoral campos en comparación con intramamarios / intratumoral estroma (test de Spearman; NMG: P <0,05 para los vasos linfáticos y sin P <0,01 para aquellos con VEGFR-3 de expresión; MT: P <0,05 para los vasos linfáticos sin, y P <0,01 para las personas con VEGFR-3 de expresión), mientras que en el adenoma mismo resultado se obtuvo de los vasos linfáticos con el VEGFR-3 (test de Spearman : P <0,01). No se encontraron diferencias significativas fue divulgada en el número de linfáticos sin VEGFR-3 de expresión (figura 2]. Un número significativamente mayor de linfáticos sin VEGFR-3 de expresión NMGs a mts (test de Spearman: P <0,05) en el extratumoral (extramamaria) campos, pero no hubo diferencia significativa en la intratumoral (intramamarios) los campos se encuentran en los tres grupos de diagnóstico (glándula mamaria normal, benignos y los tumores malignos). La agrupación de los tumores malignos de acuerdo a la etapa, no se encontraron diferencias significativas en el estroma extratumoral, y un aumento significativo del número de expresar linfáticos VEGFR-3 intratumoral en el estroma de la fase 0 y fase I vs II (mediana de valores: fase 0 = 0,7 ; Etapa I = 0,8; etapa II = 3,3; Spearman prueba: P <0,05) (figura 3].

Inmunohistoquímica anti-VEGF-C mancha

Endotelio vascular y los fibroblastos del estroma en los controles positivos y también el epitelio de ambas NMG, BT y MT, en muestras mamaria mostró una mancha marrón, fuerte en el citoplasma y la luz en el núcleo (figura 4]. Células teñidas se encontraban en "puntos calientes" en tanto benignos y los tumores malignos.

Datos estadísticos descriptivos de la VEGF-C puntuación en el índice de comparación entre grupos se presentan en el cuadro 2. Existe una asociación significativa entre el VEGF-C expresión en el epitelio y el número de buques positiva (coeficiente de correlación de Pearson, R = 0,67, P <0,01) tanto en la glándula mamaria normal, y benignos y los tumores malignos. En los tumores malignos (Spearman: P = 0.024), pero no en las lesiones benignas (Spearman: P = 0,46) o en la glándula mamaria normal (Spearman: P = 0,62), el VEGF-C Resultado índice más alto y valores significativos en la intratumoral (intramamarios) que en extratumoral (extramamaria) campos (figura 5]. Al comparar la expresión de VEGF-C de la componente epitelial maligno entre la infiltración (St I + II) y no infiltrante tumores (St0), una mayor diferencia significativa se observó en la intratumoral que extratumoral campos infiltrarse en los tumores (Spearman: P = 0,036 ), Pero no en no infiltrante tumores (Spearman: P = 0,31) (figura 5].

No se encontró relación entre el VEGF-C puntuación en las células epiteliales y el grupo de diagnóstico (glándula mamaria normal, benignos y los tumores malignos) o histológico etapa (0, I, II).

Inmunohistoquímica anti-CD44 mancha

CD44 se immunohistochemically divulgado a citoplásmica mancha marrón en el control positivo (felino anaplásico de células de carcinoma mamario) y en el epitelio de NMG, así como BT y MT (figura 6]. El inmunoticción se concentró en "puntos calientes" donde el análisis cuantitativo se centró tanto en la glándula mamaria normal y benignos y los tumores malignos.

Datos estadísticos descriptivos de la puntuación de CD44 en los grupos de comparación se presentan en el cuadro 3.

Resultado CD44 fue significativamente menor que en extratumoral intratumoral en los campos benignas y tumores malignos (Spearman: P <0,01). La glándula mamaria normal mostró valores cercanos a la significación (Spearman: P = 0,056). La comparación de intramamarios / intratumoral y extramamaria / extratumoral campos mostró un aumento significativo de la puntuación de CD44 en extramamaria / extratumoral campos de NMG a MT (Spearman: P <0,05) (tabla 7], pero no en intramamaria / intratumoral estroma. El índice de CD44 no se correlaciona con la progresión en fase MT.

Correlaciones de evaluación linfático con VEGF-C y los índices de CD44

La expresión de VEGF-C y CD44 en las células epiteliales neoplásicas se comparó con el número de los vasos linfáticos con o sin VEGFR-3 de expresión. Pearson ensayo mostró una significativa y correlación inversamente proporcional entre la expresión CD44 y el número de los vasos linfáticos con el receptor en infiltrarse en los tumores malignos (ITS + II) (R = -0,36, p = 0.18), pero no en no infiltrante tumores malignos, benignos tumores y la glándula mamaria normal.

Discusión

Sobre la base de los resultados obtenidos, la distribución de los vasos linfáticos datos cuantitativos producidos en la intratumoral y estroma de extratumoral benignos y malignos tumores similares a los de la intra-extramamaria y zonas de la glándula mamaria normal. En todos los grupos (normal de la glándula mamaria, tumores benignos y los tumores malignos) el número de VEGFR-3 positivos y negativos de linfáticos en la extratumoral (extramamaria) estroma fue significativamente más elevada que en la intratumoral (intramamarios) estroma.

Estos datos hacen hincapié en que el gato, al igual que en los humanos, sólo hay unos pocos de los vasos linfáticos en el estroma intratumoral. Esto sugiere una escasa importancia biológica de la presencia de linfáticos intratumorales que no parecen ser invadido por células neoplásicas, debido a la alta presión intersticial en el interior del tumor. El lugar linfáticos son mejor representadas en el tejido extratumoral cuando, como en la mujer, el estrés mecánico es menos intensa, y presumiblemente debido a la compresión del estroma en estas zonas de concentración de la pre-los buques existentes.

Al igual que el extratumoral intratumoral y de medio ambiente benigno y los tumores malignos, los linfáticos expresar VEGFR-3 extramamaria en el tejido normal de la glándula mamaria son acerca de tres los que están en el estroma intramamario. Los resultados de la glándula mamaria normal y intra / extratumoral tejidos obtenidos en este estudio sugieren que una nueva producción de los vasos linfáticos o linfangiogénesis es extremadamente limitado. No significativo aumento del número de los vasos linfáticos expresar VEGFR-3 se detectó en extratumoral tejido. La falta de un aumento en los vasos linfáticos demostrado en la periferia del tumor no explica la razón por la metástasis temprana, especialmente en el caso de las neoplasias mamarias, están localizados en los planos regional o coleccionista de ganglios linfáticos, lo que prueba que las células neoplásicas de abandonar el tumor primario a través de la difusión vía linfática. En este sentido, algunos mediadores químicos o ligando-receptor interacciones (es decir, VEGF ligandos y receptores VEGF) podría dirigir las células neoplásicas a los vasos linfáticos.

En relación con la etapa del tumor, VEGFR-3 en linfáticos se correlacionó con la etapa histológica de los carcinomas, con un aumento de VEGFR-3 en el estroma de intratumoral St0 a las ITS y StII. VEGFR-3 de expresión se piensa que es estrictamente relacionados con la formación de metástasis de tumores y, por consiguiente, para el pronóstico del paciente. Humanos pacientes con el más alto número relativo de VEGFR-3 linfáticos positivos y el menor número relativo de los vasos sanguíneos positivos para el mismo receptor tiene la mayor probabilidad de metástasis ganglionares y, por tanto, un pronóstico negativo [1]. La presencia de VEGFR-3 linfáticos negativos es probable que indican una mayor dificultad de entrar neoplásicas embolia negativo más que positivo para los buques de este receptor. Incluso si los resultados hemático en los buques no son denunciados en el presente documento, muchos vasos sanguíneos se VEGFR-3 positiva intratumoral en los campos, lo que demuestra su reciente formación. De hecho, la expresión de este receptor por el endotelio de los vasos sanguíneos tumorales es bien conocida, lo que sugiere que VEGFR-3 está implicado en la angiogénesis de tumores y en la tumorigénesis [18, 19, 11]. La escasa linfagiogénesis dentro de los tumores puede indicar que el desarrollo de células neoplásicas en un espacio confinado crear una tensión mecánica comprimir el linfáticos o inhibición de su nueva formación en el interior del tumor [20]. Por el contrario, los vasos sanguíneos angiogénesis no sería inhibido por los principales muro de resistencia, pero más probablemente por una diferencia local en el equilibrio de citoquinas y la inhibición de estimular LI.

Inmunohistoquímica VEGF-C positividad se observó tanto en el citoplasma y núcleo por primera vez el clon Z-CVC7 en el gato. Además de tener una influencia positiva tróficos en los vasos endotelio al igual que otros componentes de la misma familia [21], anti-VEGF-C inmunohistoquímica también manchadas las células epiteliales. Los datos obtenidos se comparan la expresión de la componente epitelial con el número de buques mostró positivo que los dos se asociaron significativamente. Los factores que induce la expresión génica de VEGF-C en la pared endotelial, como pro-inflamatorias citocinas (IL-1 β y factor de necrosis tumoral) [22, 23], también son susceptibles de influir en las células epiteliales. Aparte de la relación proporcional entre el aumento de VEGF-C positividad del epitelio y el número de positivos los buques, no se encontró relación entre el número de positivos los buques y el grupo de diagnóstico (comparación entre la glándula mamaria normal, benignos y los tumores malignos), evaluación sobre el terreno (intratumoral / o intramamaria extratumoral / extramamaria) e histológicos.

Sobre la base de la expresión de VEGF-C del componente epitelial, tanto la glándula normal y tumores benignos produjo resultados similares, por ejemplo en cuanto a la comparación entre intratumoral (intramamarios) y extratumoral (extramamaria) campos. La expresión fue significativamente mayor en intratumoral que extratumoral regiones sólo en los tumores malignos. Las condiciones estimular la angiogénesis es probable que en el acto intratumoral zonas debido a la tensión mecánica [20] más que en la periferia de la neoplasia donde la vasculatura se acentúa. El mismo comportamiento se observó en los tumores malignos agrupados de acuerdo a la etapa, por la infiltración (ITS y StII), pero no por falta de infiltrarse en los carcinomas. La mayor expresión intratumoral en infiltrarse en las lesiones refleja sus más pronunciada angiogenetic necesidad.

VEGF-C expresión no se limita al endotelio vascular, sino también respecto a la del epitelio normal de la glándula y neoplásicas. El inductivo estímulos en el endotelio también puede inducir la expresión ligando en el epitelio. Esta expresión es evidente sobre todo en infiltrarse en tumores malignos, y especialmente en las zonas intratumoral hipóxica.

Los resultados de VEGF-C fueron reproducidas con CD44, con la mejora de diferencias estadísticamente significativas, especialmente en benignos y los tumores malignos. Sólo la fase I y II infiltrante tumores malignos muestran una expresión diferente en la intratumoral y extratumoral zonas, siendo significativamente más pronunciado en la intratumoral que extratumoral estroma. Diferentes funciones se han atribuido a CD44, tales como la adhesión celular, linfocítica vivienda, el crecimiento de transmisión de señales y la adquisición de un fenotipo maligno invasivo [24]. Es bien sabido que la degradación de ácido hialurónico (una proteína estructural de la matriz extracelular) desempeña un papel importante en la invasión tumoral. CD44 mediado por la degradación de ácido hialurónico en torno a los buques que permite a las células tumorales que expresan la molécula de adhesión para entrar en la corriente rápidamente y desarrollar metástasis [25]. Los valores más elevados de expresión de CD44 en la intratumoral hipóxico zonas, especialmente en infiltrarse en los tumores malignos, también es probable que reflejar estas funciones biológicas en el modelo neoplásico.

El CD44-dependiente del endotelio linfocitos interacción se lleva a cabo sólo si se activan los linfocitos y el endotelio estimulado por la IL-2 [26]. Esto señala que la activación endotelial puede ser fundamental para entrar en los buques. A raíz de una señal de activación, VEGFR-3 se expresa por el buque endotelio (VEGFR-3 no siempre se expresa en todos los buques). Esto puede indicar neoplásicas las células que expresan CD44 son los medios para entrar en los buques gracias a una activa interacción con el endotelio. La proporción inversa entre la expresión CD44 en las células tumorales y el número de expresar linfáticos VEGFR-3 puede ser debido al papel de CD44 en las células homophilic agregación. CD44 dependiente de la agregación de células ha sido ampliamente descrito [24]. Homophilic agregación espontánea de muchas líneas de células CD44 presentar depende de la presencia de este ligando que probablemente promueva la adhesión de estas células [24]. En la patogenia de la progresión tumoral, las células de agregación puede proteger las células metastásicas de los mecanismos immunosurveillance facilitar su compresión a órganos diana [24]. La relación inversa se derivan de los resultados de la investigación actual está presente en dos sitios diferentes: intratumoral con alta expresión CD44 en las células tumorales, junto con un bajo número de VEGFR-3 expresar linfáticos, y extratumoral mostrando lo contrario. Extratumoral zonas con escasa CD44 (baja adherencia eficiente homotipica), y el mayor número de VEGRF-3 expresar linfáticos (máximo preferencial interacción de las células neoplásicas y el endotelio) permitiría a las células neoplásicas a entrar en la vía linfática.

Conclusión

El tumor modelo empleado en el presente estudio no aportó pruebas de LI, es decir, un aumento en el número de recién formado los vasos linfáticos que podrían haber sido constatada por el incremento en la expresión de VEGFR-3. En cualquier caso, es probable que las células neoplásicas alcanzar los ganglios linfáticos regionales después de propagación a través de la preexistente red linfática.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

CB y SG concibió el estudio, participaron en su diseño y la coordinación y redactó el manuscrito. BB supervisó la inmunohistoquímica manchas y ayudó a co-autores en la realización de análisis de imagen: AR (anti-VEGFR-3 y anti-laminina doble mancha), LD (anti-VEGF-C mancha) y FS (anti-CD44 mancha). GS realizó el análisis estadístico. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Pre-publicación de la historia

La pre-publicación de la historia de este documento puede accederse en:

Agradecimientos

Los autores se agradecen a Anne Collins Inglés para la revisión del manuscrito. La investigación fue apoyada por MURST (Ministerio de la Universidad y de la Ciencia y la Investigación Tecnológica) - COFIN subvenciones de 2002.