Immunity & Ageing, 2006; 3: 11-11 (más artículos en esta revista)

Análisis a gran escala de antivirales pediátricos CD8 + T cell poblaciones revela sostenido, funcional y maduro respuestas

BioMed Central
Haruki Komatsu (haruki-komatsu@chive.ocn.ne.jp) [1], Ayano Inui (inui19@yacht.ocn.ne.jp) [3], Tsuyoshi Sogo (so5244ibukick@kdp.biglobe.ne.jp) [ 3], Tomoo Fujisawa (t-fuji@iuhw.ac.jp) [3], Hironori Nagasaka (nagasa-hirono@k2.dion.ne.jp) [4], Shigeaki Nonoyama (nonoyama@me.ndmc.ac. jp) [1], Sophie Sierro (sophie.sierro @ ndm.ox.ac.uk) [5], John Northfield (john.northfield @ clínico-medicine.oxford.ac.uk) [5], Michaela Lucas (Michaela . lucas@clinical-medicine.oxford.ac.uk) [5], Anita Vargas (ana_l_vargas@yahoo.co.uk) [5], Paul Klenerman (paul.klenerman @ medawar.oxford.ac.uk) [5]
[1] Departamento de Pediatría, Nacional de Defensa Medical College, Saitama, Japón
[2] Departamento de Pediatría, Toho University Hospital Sakura, Chiba, Japón
[3] Departamento de Pediatría, Hospital Atami, la Universidad Internacional de Salud y Bienestar Social, Shizuoka, Japón
[4] Departamento de Pediatría, Hokkaido University Graduate School of Medicine, Hokkaido, Japón
[5] Nuffield Departamento de Medicina, Peter Medawar Building for Pathogen de Investigación, Universidad de Oxford, Oxford, UK

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Resumen
Fondo

Inmunidad celular desempeña un papel crucial en el citomegalovirus (CMV), infección y poblaciones importantes de CMV-células T específicas se acumulan durante toda la vida. Sin embargo, aunque la infección por CMV se produce durante la infancia, relativamente poco se sabe acerca de la típica cantidad y la calidad de las respuestas de células T en la población pediátrica.

Métodos

Mil treinta y seis personas (Hombre / Mujer = 594/442, Edad: 0-19 años.; 959 temas, 20-29 años., 77 sujetos) se examinaron para HLA a escribir. Todos los temas de 1036 se realizarán las pruebas de HLA-A2 antígeno. De 1036 sujetos, 887 fueron también la prueba de HLA-A23, 24 antígenos. Además, 50 personas mayores (Hombre / Mujer = 11/39, Edad: 60-92 años.) También fueron probados para HLA-A2 antígeno. Se analizaron los CD8 + T cell respuestas a CMV, comparando a estas respuestas en los niños y jóvenes. Las frecuencias, fenotipo y función de linfocitos T CD8 + durante dos imunodominant epítopos de pp65 se midieron.

Resultados

Hemos observado consistentemente alta frecuencia y fenotípicamente "madura" (bajo CD27, CD28 baja, CD45RA +) CMV-CD8 + específicas de células T respuestas en los niños, incluidos los que estudiaron en el primer año de vida. Estos linfocitos T CD8 + conservado a través de la funcionalidad de todos los grupos de edad, y mostró pruebas de memoria "inflación" sólo más tarde en la vida adulta.

Conclusión

CMV constantemente provoque una muy fuerte CD8 + T cell respuesta a los lactantes y los grandes charcos de CMV específica linfocitos T CD8 + se mantuvo durante toda la niñez. La presencia de CMV Mayo considerablemente el molde CD8 + T cell compartimiento con el tiempo, pero las frecuencias relativas de CMV específicos de las células no muestran la evidencia de una población a nivel de aumento durante la infancia y la edad adulta. Esto contrasta con la marcada expansión ( "inflación"), de tal linfocitos T CD8 + en los adultos mayores. Este estudio indica que el análisis a gran escala de péptido específico de células T respuestas en los niños pequeños es fácilmente posible. La robusta naturaleza de la respuesta observada sugiere la vacuna contra las estrategias destinadas a impulsar el cebado y linfocitos T CD8 + contra los principales agentes patógenos (incluido el VIH, la malaria y la propia CMV) puede tener éxito en este grupo de edad.

Fondo

Citomegalovirus humano (HCMV) es una generalización β-herpesvirus que infecta a un 40% a 100% de los adultos en todo el mundo [1]. El modo común de transmisión de HCMV es vertical: en casi todos los casos, HCMV la infección ocurre durante el período prenatal (adquisición transplacentaria), en el momento del nacimiento (a través de la exposición a HCMV en el canal de nacimiento), o período postnatal (incluida la transmisión por la leche materna) [2 , 3]. En los países desarrollados, para HCMV seroconversión ocurre durante toda la vida. Primaria es en gran medida la infección asintomática y HCMV infección persiste durante toda la vida por lo general sin secuelas clínicas en individuos sanos. Sin embargo, el recrudecimiento de infecciones latentes pueden causar enfermedades que amenazan la vida de acogida en inmunodeprimidos, como los receptores de trasplante, los pacientes que recibieron terapia de tumores, y los pacientes con avanzada virus de la inmunodeficiencia humana infección [1, 4]. Por otra parte, estudios recientes han demostrado que la infección primaria HCMV puede producir enfermedad severa en los recién nacidos prematuros [3, 5]. Por lo tanto, los estudios de la respuesta inmune humana a HCMV son necesarios para comprender los mecanismos implicados en el control de la infección y desarrollar mejores estrategias para prevenir el CMV inducida por la enfermedad.

Infección viral suele ser controlada por una serie de innata y adaptativa mecanismos inmunes efectoras. En particular, virus específicos de las células CD8 + juegan un papel crucial en el control de la replicación HCMV durante tanto aguda como crónica, las etapas [6 - 8]. Fuerte específica para el virus CD8 + T cell respuestas se desarrollan durante la infección primaria y funcional HCMV-CD8 + específicas de las células T están presentes después de la resolución de la infección primaria. Posteriormente, estos HCMV específicos de linfocitos T CD8 + se mantienen en altas frecuencias. La proporción de la HCMV específicos de linfocitos T CD8 + en el total de linfocitos piscina podrá llegar a niveles muy altos en las personas de edad avanzada [9]. En modelos murinos, la acumulación de citomegalovirus murino (MCMV) específicos de linfocitos T CD8 + se observó en todos los órganos, comenzando algún tiempo después de la resolución de la infección primaria [8]. Este fenómeno, denominado "inflación de memoria", también se observó en adultos humanos [9]. Estas observaciones son consistentes con la idea de que continua o repetitiva la exposición a antígenos lentamente moldes de memoria las poblaciones de células T en el tiempo.

El "fenotipo" de virus específicos de linfocitos T CD8 + se puede describir en pocas distintos subgrupos basados en marcadores celulares de superficie (CD28, CD27, CD45RA, y CD45RO). CD27 y CD28 de células T son moléculas estimuladoras, que son expresadas diferencialmente en linfocitos T CD8 + en diferentes condiciones de estimulación a través del tiempo [10 - 13]. Naïve y los llamados "early-diferenciado" células se caracterizan por una elevada expresión de las moléculas estimuladoras CD28 y CD27, que puede progresar a través de CD28-CD27 + y CD28 a CD27 de las células, típico de ambos HCMV y MCMV, considera que a ser una "tarde" etapa de diferenciación [14]. Del mismo modo, isoformas de CD45, antígeno leucocitario común, puede ser utilizado como un marcador de superficie celular para examinar la condición de diferenciación. En humanos la sangre del cordón umbilical, casi todas las células CD8 + mostrar alta expresión de CD45RA, mientras que la proporción de células que expresan CD45RO aumenta con la edad [15]. HCMV específicos de las células CD8 + mostrar alta expresión de CD45RO durante la infección primaria HCMV, pero son relativamente enriquecido CD45RA + en las células durante la fase crónica de la infección por HCMV [14, 16, 17]. Este es el pensamiento que son equivalentes, ya sea con un "terminal diferenciada", o su entrada en un programa de un compromiso a largo plazo la tranquilidad y la supervivencia.

Pequeño detalle se encuentra disponible en las frecuencias, fenotipo y la función de antivirales linfocitos T CD8 + en la población pediátrica. Se que antes se consideraban que los lactantes corren el peligro de dejar de montar las respuestas tipo Th1 de una calidad similar a las observadas en adultos, aunque los nuevos datos de estudios más pequeños ha dado lugar a una revisión de estas ideas. Un estudio reciente mostró que una madura y funcional CD8 + T cell respuesta a HCMV se observó en casos específicos de infección de los fetos y los recién nacidos [18]. Sin embargo, no está claro cuál es la respuesta normal es en las grandes, asymptomatically pediátricos infectados por la población, y cómo evolucionan estas poblaciones a través de la infancia. Inmadurez de CD4 + T cell ayuda, regulación, las células dendríticas o inmunidad innata podría potencialmente tener un impacto importante en el mantenimiento a largo plazo de antivirales CD8 + T poblaciones celulares. Por otra parte, varias características de la ampliación de las poblaciones de linfocitos T CD8 + asociados con la persistencia de la infección por el virus han sido asimilarse a "envejecimiento", y, por tanto, el estudio de esos linfocitos T CD8 + en una población infantil podría proporcionar algunas ideas sobre la inducción y el mantenimiento de " normal "de memoria en adultos [19]. Análisis de la población pediátrica se ha visto obstaculizada hasta la fecha por gran parte por las limitaciones en la toma de muestras de sangre disponibles, pero los recientes avances en el análisis de los linfocitos T CD8 + ha significado datos de alta calidad puede obtenerse a partir de tan poco como 100 μ l de sangre [9].

En este estudio, un gran análisis transversal se realizó para aclarar la situación de HCMV específicas linfocitos T CD8 + en los lactantes y los niños. Con el fin de cuantificar HLA-Restringido HCMV específicos de linfocitos T CD8 +, hemos utilizado leukocytic antígeno humano (HLA)-A2 y HLA-A24 tetrameric complejos (tetramers) cargado con el immunodominant péptido derivado de HCMV proteína estructural pp65. Además, las funciones efectoras de HCMV específicos de linfocitos T CD8 + en los niños se evaluaron utilizando el IFN-γ-enzima vinculada immunospot (ELISPOT) de ensayo y tinción intracelular de citoquinas (ICS) para IFN-γ-células productoras. Por otra parte, evaluó el estado de diferenciación utilizando marcadores celulares de superficie (CD28, CD27, CD45RA, y CD45RO) para aclarar el fenotipo de la HCMV específicos de linfocitos T CD8 + y cualquier cambio lo largo del tiempo. Se demuestra que las funciones efectoras de HCMV específicos de las células CD8 + en lactantes son tan fuertes como los de los adultos jóvenes. Por otra parte, el fenotipo de HCMV-positivas linfocitos T CD8 + está bien diferenciada en los lactantes y niños de corta edad.

Materiales y métodos
Estudio de población

Entre marzo y septiembre de 2003, muestras de sangre fueron tomadas de pacientes que asistieron a las clínicas pediátricas Defensa Nacional Colegio Médico (Tokorozawa, Japón), la Universidad Internacional de Salud y Bienestar (Atami, Japón), y la Universidad de Hokkaido (Sapporo, Japón) debido a diversas enfermedades . El consentimiento informado se tomó de ellos o sus padres. Mil treinta y seis personas (Hombre / Mujer = 594/442, Edad: <1yr.; 132, 1-5yr,; 305, 6-10yr.; 216, 11-15yr.; 218,; 16-19 año., 88, 20-29 años., 77) se inscribieron en este estudio. Todos los temas de 1036 se realizarán las pruebas de HLA-A2 antígeno. De 1036 sujetos, 887 (Hombre / Mujer = 519/368, Edad: <1yr.; 115, 1-5yr,; 279, 6-10yr.; 190, 11-15yr.; 172,; 16-19 años. , 68, 20-29 años. 63) también fueron probados para HLA-A23, 24 antígenos. Además, 50 voluntarios ancianos (Hombre / Mujer = 11/39, 60-69yr., 6, 70-79yr.; 8, 80-89yr., 22, 90-92 años. 14) también fueron inscritos en este estudio . Ninguno de ellos fue examinado por HCMV estado serológico.

Abs monoclonales y péptidos

Anti-HLA-A2-isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD8 peridinina clorofila-proteína (PerCP), anti-CD27-FITC, anti-CD28-: allophycocyanin (APC), anti-CD45RA-FITC, anti-CD45RO-APC , Anti-IFN-γ-FITC mAbs, isotipo y control Abs fueron adquiridos de PharMingen Becton Dickinson (San Diego, CA, EE.UU.). Anti-HLA-A23, 24 mAbs se compraron de One Lambda (Canogo Park, CA, EE.UU.). Cabra anti-ratón IgG-FITC Abs fueron adquiridos de Immunotech (Marseille, Francia). El HLA-A * 0201-Restringido HCMV-CTL específicos epítopo pp65 495-503 (NLVPMVATV) y HLA-A * 2402 Restringido HCMV-CTL específicos epítopo pp65 328-336 (QYDPVAALF), ambos identificados anteriormente [20, 21], se compraron de MBL (Nagoya, Japón).

HLA-péptido tetrametric complejos

HLA clase I-péptido tetramers fueron sintetizados como hemos descrito anteriormente [22]. En pocas palabras, recombinante HLA clase I proteínas (HLA-A * 0201 y HLA-A * 2402) se expresaron y producida en Escherichia coli. La A24-expresando plásmido fue proporcionada por el Dr Kuzushima (Aichi Cancer Center Research Institute, Japón) refolded con β2-microglobulina y péptidos. Después de refolding de la HLA de clase I molecle, β2-microglobulina y péptido, el complejo fue purificado por FPLC y biotina de Bir una enzima (Avidez, Denver, CO, EE.UU.). HLA clase I-péptido complejos se mezclaban con ficoeritrina (PE) marcado con streptavidina en una proporción molar de 4: 1 para formar HLA-péptido tetrametric complejos. Tetramers se titula contra las células mononucleares periféricas (PBMCs) de HCMV-seropositivos y coincidentes los donantes para determinar la concentración máxima que indujo la tinción con un mínimo de antecedentes.

La superficie celular y tinción intracelular
ELISPOT ensayos

PBMCs se aislaron de sangre venosa heparinized de densidad gradiente de Ficoll utilizando sedimentación-Hypaque (Lymphoprep; Eje Escudo, Oslo, Noruega). Fresh PBMCs se chapada en 96 pozos de placas de polivinilideno (Milipore, Bedford, MA, EE.UU.) que han sido precubiertos con 0,5 μ g / ml anti-IFN-γ-MAB (Mabtech, Estocolmo, Suecia). Los péptidos se han añadido a un volumen de 10 μ l PBMCs y luego se añadieron a las células 50000-100000 / así en un volumen de 190 μ l. La concentración final de HLA-A2 péptido (NLVPMVATV) fue de 5 μ M. Las placas se incubaron durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2 y lavado PBS antes de la adición de la segunda, con biotina anti-IFN-γ MAB (Mabtech) a 0,5 μ g / ml y se incubaron a temperatura ambiente durante 100 min. Después del lavado, streptavidina-conjugado con fosfatasa alcalina (Mabtech) se añadió a temperatura ambiente durante 40 minutos. Individual de citoquinas que producen las células se han detectado como puntos oscuros después de 20 minutos de reacción con 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolyl y nitro azul tetrazolio utilizando una fosfatasa alcalina conjugada con sustrato (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU. ). El número de células T específicas se calcula restando el control negativo y los valores expresados, ya sea el número de espacios de formación de unidades por 10 6 PBMC.

El análisis estadístico

Distribuciones de frecuencias se compararon mediante la Yates corregida prueba de ji al cuadrado o la prueba exacta de Fisher. Un valor de p de 0,05 o menos, se consideraba que indican significación estadística. Para el análisis estadístico no paramétrico, rango de correlación de Spearman se utilizó la prueba. Todos los valores p fueron de 2 de cola y consideró significativa si <0,05. No paramétrico de Mann-Whitney U pruebas se utilizaron los datos de pares y de Kruskal-Wallis pruebas se utilizaron los datos para el grupo. Los resultados se presentaron utilizando Prisma (GraphPad, San Diego, CA, EE.UU.).

Resultados
La frecuencia de HLA-A2 y A24

De 1036 sujetos, 448 (43%) fueron positivos para HLA-A2. De 887 sujetos, 519 (58%) personas fueron positivos para HLA-A23, 24, de los cuales 76 (15%) también fueron positivos para HLA-A2. Porque es bien sabido que HLA-A23 antígeno es muy rara vez se detecta en la población japonesa [23, 24], el HLA-A23, 24 sujetos fueron positivos que se consideran positivos para HLA-A24. Para comparar con los niños y los adultos jóvenes, ancianos, además, 50 personas se inscribieron en este estudio. Todos ellos se encontraban en buen estado de salud. De estas personas de edad avanzada, 21 (42%) fueron positivos para HLA-A2.

Frecuencia de HCMV tetramer de respuestas positivas a diferentes edades

Inicialmente, un análisis transversal de HCMV-CD8 + específicas de células T se realizó frecuencia. Análisis de HLA-A2 negativas y HLA-A23, 24 muestras negativas siempre una línea de corte para la detección de 0,05% y 0,04% de CD8, respectivamente, obtenidos con anterioridad [9] (datos no presentados). Fig 1 muestra un ejemplo de tinción positiva tetramer a HLA-A2 + y HLA-A24 + lactantes. 448 de HLA-A2-positivas, HCMV-A2 tetramer tinción reveló respuestas positivas en 190 (42%). 519 de HLA-A23, 24 positivas, HCMV-A24 tetramer tinción reveló respuestas positivas en 133 (26%).

El cuadro 1 muestra los resultados de la HCMV-A2 tetramer ensayo en los distintos grupos de edad. El porcentaje de HLA-A2 temas, que fueron positivos para HCMV-A2 tetramer, fue del 31% en 0-4 años. grupo, y aumentó gradualmente con la edad, de tal forma que aproximadamente la mitad de los adultos y personas mayores poblaciones fueron positivos. Sin embargo, la media del porcentaje de linfocitos T CD8 + manchadas de HCMV-A2 tetramer no muestran un continuo aumento con la edad. De hecho, la media del porcentaje de linfocitos T CD8 + manchadas de HCMV-A2 tetramer de los 0-4 años. grupo fue ligeramente más alto que el de los 5-9 años. grupo y el 10-14yr. grupo. Con el fin de confirmar que las personas de edad avanzada podrían mostrar una alta frecuencia de HCMV específicas linfocitos T CD8 + en Japón, 50 ancianos fueron examinados. La frecuencia media de HCMV específicos de linfocitos T CD8 + en el grupo de edad fue más alta que en el anterior estudio [9], y significativamente más elevado que el de cualquier otro grupo.

Los resultados de HCMV-A24 tetramer tinción se muestran en la Tabla 2. Aunque el porcentaje de HCMV-A24 tetramer positivas aumentó gradualmente con la edad, el porcentaje de la HLA-A24 tetramer positivas fue del 19% en los 0-4 años. grupo, que fue inferior a la de comparables HLA-A2 tetramer positivas (31%), y este sigue siendo similar en todos los grupos de edad. A diferencia de la HLA-A2-respuestas concretas, el aumento no se observó en la media de porcentaje de HLA-A24-tetramer células positivas en los adultos jóvenes, aunque en este caso una población de ancianos no fue probada. Curiosamente, al igual que para el HLA-A2 + personas, el promedio de porcentaje de linfocitos T CD8 + manchadas de HCMV-A24 tetramer en el grupo más joven (0-4 años.) Fue superior a la que a edades más avanzadas. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que los niños pequeños tienen la respuesta inmune celular a CMV comparables a las de los adultos jóvenes.

Setenta y seis personas fueron positivos para ambos HLA-A2 y HLA-A24. De 76 sujetos, 17 fueron positivos para ambos HCMV-A2 y A24-tetramer tinción. La frecuencia media de HCMV específicos de linfocitos T CD8 + en HLA-A2 y HLA-A24 personas fue 1,09 y 0,09, respectivamente. De 76 temas, 12 y 8 fueron positivos para HCMV-A2 y A24-tetramer tinción, respectivamente. Los restos fueron negativos para la tinción trtramer. No hubo diferencias significativas en la tasa positiva de HCMV tetramer entre dos alelos y un alelo (HLA-A2, A24 vs HLA-A2, p = 0,79, HLA-A2, A24 vs HLA-24, p = 0.15). Estos hallazgos sugieren que el tipo de HLA no haya influido en el immunodominance utilizando tetramer ensayo.

Análisis de CD8 + T cell respuestas a los lactantes y niños pequeños

Para evaluar en detalle los resultados de HCMV tetramer manchas en la clave de la población de lactantes y niños de corta edad, el joven grupo se divide por edad y analizados (Cuadro 3, 4]. En este caso, el porcentaje de HCMV tetramer positivas aumentó ligeramente con la edad. Menores de 1 año de edad, el 23% y el 17% fueron positivos para la tinción HCMV tetramer a HLA-A2 temas y HLA-A24 temas, respectivamente. El joven sujeto que fue positiva para HCMV tetramer manchas en el HLA-A2 y HLA-A24-positivo población, fueron 2 - y 1 meses de edad, respectivamente (Figura 1]. Aunque los 2 meses de edad fue remitido a nuestro hospital a causa de la ictericia, de 1 mes de edad el bebé no tenía síntomas. Por otra parte, el promedio de porcentaje de HCMV tetramer-positivas entre las células o linfocitos totales entre los linfocitos T CD8 + tienen una ligera disminución con la edad, los porcentajes más bajos en alrededor de 3-4 años. Estos resultados son consistentes con prevalente infección primaria HCMV en primeras etapas de la vida y se confirma que el fuerte HCMV específicos CD8 + T cell respuestas pueden ser reproducible generado en el primer año de vida.

Correlación entre tetramer y ensayos funcionales

Para evaluar la función efectoras de la HCMV de células específicas, hemos realizado IFN-γ ELISPOT ensayos y en comparación con tetramer estas manchas. Cincuenta y seis HLA-A2 + sujetos (edad: de 3 meses a 29 años de edad, con una media de 10,5 años) y 17 de HLA-A24 + sujetos (edad: a partir del 1 mes a 23 años de edad, con una media de 8,9 años) fueron seleccionados para ELISPOT ensayos. Una comparación de la ELISPOT tetramer ensayo y ensayo se muestra en la Figura 2. Aunque el número de HLA-A24 + sujetos fue pequeña, la comparación de ELISPOT tetramer ensayo y ensayo demuestra una fuerte asociación (HLA-A2: p <0.0001, γ = 0,69; HLA-A24: p = 0.0011, γ = 0,72). También se realizó ICS para IFN-γ para HLA-A2 + sujetos (n = 33, edad: de 2 meses a 29 años, con una media de 10,1 años). Una comparación de la ICS y tetramer ensayos se muestra en la Figura 3. Aunque la asociación no era tan fuerte como la correlación entre ELISPOT tetramer ensayo y ensayo, una asociación significativa (γ = 0. 55, p = 0,001). Los resultados de ensayos en ELISPOT HLA-A2 sujetos fueron estratificados por edad y se muestra en la Figura 4. La media de terreno número de los 0-4 años. grupo se 79.7/10 6 células, y aunque esto varió ligeramente con la edad no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Estos datos indican que una funcional CD8 + T cell respuesta a HCMV constantemente se desarrolla en edades tempranas de la vida y se mantiene durante toda la niñez.

Expresión fenotípica de marcadores (CD28/27 y CD45RA/RO) en HCMV específicos de las células CD8 +

Para determinar el estado de diferenciación HCMV específicos de linfocitos T CD8 + en los distintos grupos, se estudió la expresión de CD28, CD27, CD45RA, CD45RO y en sangre periférica tetramer + CD8 + células por medio de cuatro colores citometría de flujo. Ambos HLA-A2 + y HLA-A24 + temas se incluyeron en este análisis, cuyos resultados se muestran en la Tabla 5. Estos indican que CD28/CD27 expresión en HCMV específicos de las células CD8 + se dividió entre los 4 subgrupos. En los tres grupos más jóvenes (0-4 años., 5-9 años., 10-14 años.), El fenotipo predominante de HCMV específicos de linfocitos T CD8 + fue el CD28-CD27 + células T subconjunto. A pesar de que el CD28 + CD27 + subconjunto, ( "early" diferenciado), es predominante entre HCMV específicas linfocitos T CD8 + en niños menores de 12 meses (n = 13, los datos no se muestra), más allá de este tiempo, el CD28-CD27 + subconjunto predominan, y estos fenotipos se mantuvo relativamente estable durante toda la niñez y la adultez temprana. Sin embargo, en el grupo de edad, la proporción de CD28, CD27-células (tardías "diferenciado") mostraron un incremento significativo. Curiosamente, un raro subconjunto de antes sin clasificar CD28 + CD27-células T población aumentó con la edad y continuamente representado 22,0% de tetramer + linfocitos T CD8 + en las personas mayores.

Cuadro 6 muestra los resultados de expresión de CD45RA y CD45RO en tetramer + CD8 + T cells. CD45RA + CD45RO células-T fueron predominantes en todos los grupos. La proporción de cada fenotipo en los distintos grupos no ha cambiado. Por lo tanto, no patrones específicos fenotípica de CD45RA y CD45RO relacionadas con la edad de los sujetos fueron observados en tetramer-positivas linfocitos T CD8 +.

Discusión

En este estudio, hemos adaptado las técnicas inmunológicas que han sido ampliamente aplicado al estudio de los adultos a una gran población pediátrica de más de 1000 niños. El objetivo del estudio era definir la cantidad y calidad de las respuestas antivirales en la infección temprana y relacionar los cambios en estos años de edad. A largo plazo la realización de estudios longitudinales de poblaciones específicas CMV son difíciles de realizar en la población pediátrica sana, sin embargo, utilizando similares a gran escala de la sección transversal enfoques anteriormente hemos observado una clara dinámica de acogida-virus relación a los adultos la infección [9, 25].

El patrón de edad relacionados con la acumulación observada en este análisis transversal puesto de manifiesto el decidido respuestas en el primer año de vida, en consonancia con la adquisición de la infección durante este período. La adquisición de la inmunidad celular puede considerarse como un buen marcador de infección viral, en un momento en que las respuestas serológicas podría ser confundida por la presencia de la madre de transmisión de anticuerpos.

En particular, se evaluaron en detalle las frecuencias específicas de linfocitos T CD8 + durante los cuatro primeros años de vida (Cuadro 3, 4]. Los resultados mostraron que la expansión inicial se produjo muy temprano en ambos HLA-A2 y A24 personas. Estos resultados apoyan la idea de que la infección primaria con HCMV comúnmente ocurre durante el primer o segundo año de vida, como se sugiere en estudios previos [2, 26 - 28]. A largo plazo repetitivos antígeno a través de la estimulación continua de bajo nivel reactivación del virus que se considera responsable del mantenimiento de niveles muy altos de CMV específica "efector de memoria" linfocitos T CD8 + de entonces [6 - 8]. ¿Por qué estas células se acumulan a lo largo del tiempo y sobre todo en las personas de edad no se conoce, ni tampoco es su eficacia en la contención de reactivación viral o reinfección. En la pediátrica y de adultos jóvenes poblaciones estudiadas aquí no aparente "inflación" se ha visto en nuestro análisis, aunque típico ampliado poblaciones se observaron en personas mayores controles. Es posible que la "inflación" de las respuestas sólo se produce después de un cierto período de acogida-virus interacción, como es el caso de MCMV [8]. Alternativamente se puede perder debido a la sección transversal de diseño del estudio, En general sin embargo, parece que por lo menos el primer par de décadas, el virus de la balanza de acogida sigue siendo más o menos en statu quo.

En este estudio, la capacidad de respuesta en ambos ICS y ELISPOT ensayos fue significativamente correlacionado con tetramer tinción. Altas frecuencias específicas de HCMV células CD8 + se observaron en incluso en 0-2 años de edad, los lactantes y, aunque el número de niños examinados era relativamente pequeño, estos hallazgos sugieren que los bebés infectados con el HCMV tener un sistema funcional CD8 + T cell respuesta a HCMV similares para que en los adultos. Por otra parte, todos estos recién nacidos, pero uno, que fueron positivos para HCMV tetramer menores de 1 años de edad, fueron asintomáticos, en este estudio. Estas observaciones son consistentes con un estudio reciente más pequeño que mostró que los recién nacidos con infección congénita HCMV estaban asintomáticos y ha funcional y maduro HCMV específicos de linfocitos T CD8 + [18, 29]. Un estudio reciente informó de que el IFN-γ producido por la secreción de HCMV-tetramer las células T positivo en las personas de edad fue menor que en individuos jóvenes [30]. Sin embargo, la secreción de IFN-γ producido por las células tetramer reactiva en personas de edad avanzada no se compara con que en individuos jóvenes en este estudio.

Sobre la base de un análisis de CD28/CD27 expresión, la etapa de "maduración" o "diferenciación" de HCMV específicos de linfocitos T CD8 + puede ser definido. CD28 + CD27 + células T se consideran ingenuo o principios de células diferenciadas de las células T, que progresa hacia CD28-CD27 de los linfocitos T, cree que ser plenamente diferenciadas las células T [10 - 14]. Habíamos esperado que el fenotipo predominante de HCMV específicos de linfocitos T CD8 + en el grupo más joven podría ser CD28 + CD27 +. Sin embargo, el CD28-CD27 +, intermedio diferenciado fenotipo, fue predominante (43,2% de CD8 + tetramer las células T positivo). Subconjuntos de CD28 + CD27 + (ingenuo o principios de fenotipo diferenciado)-CD28 y CD27-(tarde-fenotipo diferenciado) representaron 34,9% y 20,8% de CD8 + tetramer las células T positivos, respectivamente. La misma proporción de HCMV específicos de las células T se observó en los 5-9 años. y 10-14 años. grupos, y también en los lactantes menores de un año de edad (datos no presentados). Estos hallazgos sugieren que "madura" linfocitos T CD8 + desarrollado constantemente en los niños pequeños. En el grupo de edad, la proporción de CD28-CD27 + (intermedio-fenotipo diferenciado) las células T se redujo, como la proporción de CD28, CD27-(tarde-fenotipo diferenciado) se incrementó sustancialmente. Este hallazgo apoya ampliamente la idea de que el patrón de diferenciación del linaje de HCMV específicas células CD8 + CD28 + es CD27 + CD28 →-→ CD27 + CD28-CD27-, aunque se sugiere que el movimiento de las células a través de este espectro no es continuo en el tiempo. Curiosamente, sin embargo, también observó una pequeña proporción de CD28 + CD27-T-células que se elevó a 22% de tetramer positivo CD8 + T-células en el grupo de ancianos.

Naïve linfocitos T CD8 + expresar CD45RA, y esto es expresado de manera uniforme en la sangre del cordón umbilical. Aunque el antígeno experiencia linfocitos T CD8 + inicialmente expresar CD45RO, re-expresión de CD45RA puede ocurrir lo que ha sido descrito como un estado de tarde o diferenciación terminal - aunque los estudios longitudinales de células individuales no se han realizado. De acuerdo con este sistema, se esperaba que un subconjunto de CD45RA + CD45RO-tetramer + células que se acumulan con la edad. En contraste, los CD45RA + CD45RO-subconjunto es predominante en todos los grupos de edad, incluso en los niños más pequeños y la proporción no ha cambiado a través de la vida. Hay dos posibilidades para explicar estas observaciones. En primer lugar, este estado puede ser impulsada por la continua interacción con el antígeno. Sin embargo, esta hipótesis no es del todo coherente con los resultados de CD28/CD27 subconjuntos de este estudio, en la que CD28-CD27-"tardía" células diferenciadas, son sólo predominante en los ancianos. Por otra parte, los niveles de expresión CD45 isoformas correlacionar mal con las etapas del antígeno T-impulsado por la diferenciación celular. Esta conclusión se apoya en un estudio anterior, lo que demuestra que CD45RA expresión no fue correlacionada con la diferenciación de fenotipos (28). Expresión de otros marcadores celulares de superficie, como CCR7, CD57 o CD85j podría correlacionar más estrechamente con la evolución de las respuestas de células T en el tiempo [31 - 37].

En este estudio, HLA-A2 + sujetos fueron seleccionados por citometría de flujo utilizando el HLA-A2 MAB. Sin embargo, el HLA-A2 moleculares de tipo japonés se clasifica en tres subtipos. HLA-A * 0201, A * 0206, A * y 0207 que representan el 10%, 10% y un 3%, de Japón, respectivamente [23]. Debido a que la diferencia entre los subtipos HLA pueden, en principio, afectar el antígeno de procesamiento y la presentación de epítopes CTL en el contexto de HLA clase I moléculas, la magnitud del CTL respuesta podría depender de los subtipos HLA [38]. Sin embargo, la frecuencia de individuos tinción positiva para el HLA-A2 pp65 tetramer fue superior a la que en un estudio anterior, en una población caucásica que expresan predominantemente HLA-A * 0201 [9]. Además, no hubo diferencia en el porcentaje de tetramer/CD8 en los 20-29 años de edad, entre el grupo de estudio previo y el estudio. Estas observaciones sugieren que la diferencia entre los tres subtipos, no influyen sustancialmente en los resultados de tetramer tinción. Sin embargo, se necesitan más estudios para determinar si la diferencia entre HLA-A2 subtipos pueden influir en los ensayos funcionales.

CMV estado serológico de los sujetos no fue evaluado en este estudio. Nos informó de que el 77% de los seropositivos HCMV-HLA-A2 temas fueron positivos para CMV tetramer [9]. Estos hallazgos sugieren que el resultado de tetramer ensayo puede estar relacionada con estado serológico, porque tetramer reactiva las células T son células T de memoria. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar si los resultados de los ensayos de tetramer están en consonancia con el HCMV estado serológico en diferentes poblaciones.

En el estudio anterior [9], que puso de manifiesto "la inflación de memoria" en un HLA-A2 positivo población. Sin embargo, el tema fue un Caucasioan población. Por lo tanto, existe la posibilidad de que la frecuencia de HCMV específicas tetramer podría ser diferente en una población japonesa. Con el fin de confirmar "la inflación de memoria" en japonés, HLA-A2 positivo adultos mayores se pusieron a prueba. En este estudio, hemos podido confirmar que "la memoria de inflación" estuvo presente en una población japonesa. Sin embargo, HLA-A24 adultos mayores no fueron probados por HLA-A24 temas no fueron examinados en nuestro estudio anterior.

En conclusión, el mantenimiento de grandes poblaciones de HCMV específicos de linfocitos T CD8 + se observó durante toda la niñez, con una importante respuesta a la infección en la primera infancia. En general las principales relacionados con la edad cambios en tetramer + linfocitos T CD8 + no se observaron en las dos primeras décadas de vida tetramer + y CD8 + células de los niños pequeños mostraron un fenotipo maduro y función similar a la de los adultos. Estos datos proporcionan una idea novedosa en la relativa madurez de la respuesta antiviral infantil, y el impacto de CMV en la infancia del sistema inmunológico. Además, demuestran la viabilidad técnica detallada de los estudios inmunológicos celulares en la población pediátrica, llevado a cabo a gran escala que puedan ser aplicables a otras infecciones de la infancia y los programas de vacuna.

Abreviaturas

HCMV, citomegalovirus humano

MCMV, citomegalovirus murino

Tetramer, tetrameric complejos

ELISPOT, enzima-ligado immunospot

ICS, tinción intracelular de citoquinas

HLA, antígenos humanos leukocytic

FITC, isotiocianato de fluoresceína

PerCP, peridinina clorofila proteína

APC, allophycocyanin

PE, ficoeritrina

PBMCs, las células mononucleares periféricas

Autores de las contribuciones

HK, SS, JN, ML, AV y PK concebido y diseñado los experimentos. HK realizado los experimentos. HK, AI, TS, TF, SN, HN y participó en la recopilación de datos. HK JN y analizó los datos. HK y PK escribió este documento.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Damos las gracias al Dr Kuzushima de la prestación de los HLA-A * 2402-expresando plásmido. Este estudio fue financiado por el Ministerio japonés de Salud, Trabajo y Bienestar Social, el Wellcome Trust y The James Martin Siglo 21 School, Oxford