Genetic Vaccines and Therapy, 2007; 5: 3-3 (más artículos en esta revista)

Análisis inmunológicos de un Lactococcus lactis basada en vacunas de ADN que expresan el VIH gp120

BioMed Central
Gregers J Gram (gjg@ssi.dk) [1], Anders Fomsgaard (afo@ssi.dk) [1], Mette Thorn (mth@ssi.dk) [1], Søren Madsen M (sma@bioneer.dk) [2], Jacob Glenting (jag@bioneer.dk) [2]
[1] Departamento de Virología, Estado Serum Institute, Artillerivej 5, DK-2300 Copenhague, Dinamarca
[2] Tecnología de Vacunas, Bioneer A / S, Kogle Alle 2, DK-2970Hørsholm, Dinamarca

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Resumen

Por razones de eficiencia Escherichia coli se utiliza hoy en día como la microbiana fábrica para la producción de vacunas de ADN plásmido. Para evitar los riesgos de resistencia a los antibióticos y los genes de endotoxinas plásmido sistemas utilizados hoy en día, hemos desarrollado un sistema basado en la calidad alimentaria Lactococcus lactis y sin un plásmido los genes de resistencia a los antibióticos. Se comparó la L. lactis a un sistema tradicional en E. coli utilizando idénticos vacuna codificación construye la gp120 del VIH-1. Transfección estudios demostraron comparables gp120 expresión utilizando los dos niveles de sistemas de vectores. Vía intramuscular inmunización de ratones con L. lactis vectores desarrollado gp120 comparables los títulos de anticuerpos como los ratones que reciben E. coli vectores. Por el contrario, la inducción de la respuesta citolítica fue menor uso de la L. lactis vector. La inclusión de motivos CpG en los plásmidos un aumento de células T de activación más cuando el E. coli en lugar de la L. lactis vector se utilizó. Esto podría deberse a las diferentes ADN contenido del vector troncales. Es interesante señalar que la estimulación de esplenocitos mostraron mayor efecto adyuvante de la L. lactis plásmido. El estudio sugiere que los países desarrollados L. lactis plásmido sistema como nueva alternativa de vacunas de ADN con un mejor sistema de seguridad. Las diferentes propiedades inmune mediante la inducción de la expresión génica similar unidades, pero diferentes vectores principales de producción y dar información anfitriones de la función adyuvante de la columna vertebral en silencio plásmido. Los resultados también muestran que la correlación entre adjuvanticity in vitro de ADN plásmido, así como su capacidad para inducir el celular y la respuesta inmune humoral en ratones no es sencillo.

Fondo

Genéticos de inmunización o vacunación de ADN ha iniciado una nueva era de investigación de vacunas. La tecnología consiste en la inoculación de ADN plásmido en la vida de acogida para obtener una respuesta inmune a una proteína codificada por el plásmido [1]. Las ventajas potenciales de vacunas de ADN incluyen la inducción de celular y la respuesta inmune humoral, flexible diseño genético, la falta de riesgo de infección, la estabilidad de los reactivos, y el relativamente bajo coste de producción microbiana en un host. Estas ventajas están siendo explotados para infecciones como el VIH, donde las vacunas tradicionales han resultado infructuosos [2 - 5]. Las ventajas de las vacunas de ADN han dado lugar a una extensa investigación se centró principalmente en la respuesta inmune inducida contra una variedad de antígenos, pero menos en los instrumentos necesarios para la producción microbiana de los plásmidos. Plásmido de ADN utilizado para las vacunas de ADN tienen dos características generales que refleja su doble funcionalidad: la unidad responsable de la propagación de células microbianas en el llamado plásmido columna vertebral, y la unidad que expresa el gen vacuna en el tejido transfectadas. Por razones de eficiencia, Escherichia coli, con las consiguientes ventajas e inconvenientes, ha sido la producción de acogida de elección. Los beneficios incluyen un alto rendimiento de ADN y bien establecidos los procedimientos para el flujo de procesamiento de la plásmido [6]. Sin embargo, como gram-negativas bacteria, E. coli contiene altamente inmunogénica endotoxinas o lipopolisacáridos (LPS), en su membrana externa. Debido a la carga negativa neta de LPS y el ADN, estas moléculas pueden ser co-purificado por el principio de intercambio iónico utilizados en la purificación de ADN plásmido [7], a pesar de kits comerciales que existen pueden excluir LPS. Por otro lado, el uso de bacilos gram-positivos anfitriones, ninguno de los cuales producen LPS, eliminar esta dependencia absoluta a la eficiencia de LPS-eliminando carpetas. Además, la E. coli vacuna plásmidos suelen ser mantenido durante el crecimiento de plásmidos codifican la resistencia a los antibióticos y la adición de antibióticos en el medio de cultivo. Por lo tanto, los antibióticos pueden ser contaminantes en las muestras de vacunas con la posibilidad de inducir respuestas alérgicas en individuos eliminados [8]. Por otra parte, hay mucho científica y normativa se centran en la utilización de genes de resistencia a los antibióticos. La preocupación es que el plásmido pueda transformar la microflora del paciente y la propagación genes de resistencia [9]. Hemos desarrollado un sistema de acogida de vectores para la producción de ADN plásmido sobre la base de Lactococcus lactis con la mejora de la seguridad propiedades en relación con la producción microbiana de acogida y el contenido genético del plásmido [10]. Como anfitrión L. lactis es atractiva para la producción de vacunas debido a su condición de grado alimentario. El plásmido desarrollado es libre de los genes de resistencia a los antibióticos y se basa enteramente en L. lactis genes, el tipo mínimo theta replicón plásmido [11] y los hom-thrB operón [12] codificación de la homoserine deshidrogenasa quinasa y homoserine catalizar dos pasos en la biosíntesis de treonina. El uso de este marcador auxotrophic se basa en la complementación de una L. lactis acogida cepa que contiene un interior supresión en el hom-thrB operón en el cromosoma. Así plásmido complementación alivia las tensiones requisito de treonina. Otros alimentos grado marcadores genéticos se han desarrollado en L. lactis para satisfacer las demandas de alta seguridad y de optimización de las culturas recombinante de arranque para su uso en la fabricación de productos lácteos. Un ejemplo es el uso de suppressible pirimidina auxotrophs tRNA supresor donde está codificado por el plásmido y permite leer a través de la pyrF gen que contiene una mutación ámbar [13]. Un marcador de selección basado en la utilización de lactosa también se ha desarrollado [14]. Ambos calidad alimentaria marcadores genéticos permitirá elegir en la leche que contiene tanto la lactosa y baja cantidad de pyrimidines. Sin embargo, la aplicación de antibióticos no basada en marcadores genéticos en L. lactis para la producción de ADN plásmido es nuevo. Hemos investigado la utilización de las nuevas L. lactis basado en el plásmido como un posible VIH-1 vacuna de ADN mediante la inclusión de una expresión eukaryote unidad de codificación de la molécula de superficie gp120 de la primaria de CCR-5-trófico VIH-1 BX08 [5, 15]. Aunque las vacunas de ADN desnudo puede ser muy útil en el cebado humoral y celular del sistema inmune para su posterior impulsar con más inmunogénica agentes como virus recombinante o proteínas [3, 15], la relativamente baja potencia de las vacunas de ADN sí es problemático. La falta de estímulo inmunológico endotoxinas o secuencias de estimulantes inmunes (ISS) como CpG motivos pueden influir en la potencia de la preparación de vacunas de ADN. De hecho, el ADN en sí actúa como adyuvante [16 - 19], que depende del contenido de la ISS motivos CpG y la dosis administrada. A este respecto puede ser de importancia que L. lactis genes son relativamente ricos en comparación con los más ricos GC E. coli los genes y, por tanto, pueden llegar a contener menos putativo ISS.

El objetivo de este estudio fue desarrollar una alternativa de acogida vector sistema basado en L. lactis y compararlo con un tradicional utilizando una vacuna contra el mismo casete. El sistema desarrollado muestra potencial como un nuevo sistema de producción plásmido, pero también da información sobre el papel coadyuvante de la columna vertebral en silencio plásmido de ADN en la vacunación.

Métodos
Construcción de E. coli y L. lactis basado vectores de expresión

La E. coli expresión plásmido WRG7079 (PowderJect Inc, Madison, WI, EE.UU.) kanamicina contiene el gen de resistencia, un ColE1 basada en el origen de replicación y una unidad de expresión eucarióticos albergar la cytomegalo virus (CMV), promotor y potenciador región, Intron A, el tejido activador del plasminógeno (tPA) la secreción de señal, un polylinker, y la polyadenylation señal de la hormona de crecimiento bovino (BGHpA). El gen sintético gp120 humanos con los codones de la primaria, de CCR5 trópico, clade B del VIH-1 BX08 ha sido clonado en WRG7079 [5] y es nombrado pEC120 (6,2 kb). Una variante de pEC120 que contienen motivos CpG ISS fue construida. Un 80 bp CpG cassette (AT ACTCT CG CG CG AG TTCTAT CG ACTCT CG CG AG AG TTCTCACTCT CG CG TTCT CG CTAGA CG TTAG CG TTCAA CG TTGA) que contiene 12 CpGs (negrita), incluyendo humanos y de ratón ISS motivos [20 - 23], se introdujo entre el codón de parada de la gp120 de genes y la BGHpA. Este plásmido fue nombrado pEC120CpG. La expresión eucarióticos unidades de pEC120 y pEC120CpG fueron clonados en la L. lactis pJAG5 clonación vector [10]. PJAG5 contiene los hom - thrB auxotroph marcador, el tipo mínimo theta replicón, y un polylinker región de la clonación (Fig. 1]. La treonina auxotrophic L. lactis cepa, MG1614 Δ homthrB, fue utilizado para la clonación y la producción plásmido [12]. Selección de transformantes primaria y el crecimiento selectivo en virtud de condiciones se hizo en medio definido que carecen de treonina [10]. El VIH-1 BX08 gp120 unidad de expresión se obtuvo de pEC120 mediante PCR y los cebadores homólogas a las 5 'final del promotor CMV (5'-CGG GGTACC CTTGTGCAATGTAACATCAGAG-3') y el extremo 3 'del BGHpA (5'- CGG GGTACC CTGTGGATAACCGTATTACCG-3 '). Del mismo modo, hemos aislado la gp120 expresión incluida la cinta de 80 bp motivo CpG mediante PCR, la misma primers y pEC120CpG como ADN. El terminal presenta primers KPN I restricción secuencias (subrayado). La expresión gp120 unidades ligated a KPN I-pJAG5 tratados y electroporated competentes en L. lactis MG1614 Δ homthrB. PCR y secuenciación del ADN confirmó la correcta estructura de la quimérico pJAG5 vectores. El resultado 7,8 kb vacuna plásmidos fueron nombrados pLL120 y pLL120CpG.

Plásmido preparación para la producción de vacunas de ADN

La E. coli basada en los plásmidos se produjeron y se purifica mediante Qiagen Midiprep de acuerdo con el fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). La L. lactis basados en plásmidos se purifica de manera similar pero con modificaciones como sigue. A 100 ml (OD 600 = 3) la cultura ha sido cosechado y lavado en 20 ml de buffer TE con 7% de sacarosa (STE). Las células fueron resuspendido en 4 ml de STE que contiene 20 mg / ml lisozima (Sigma) y 0,1 mg / ml RNasa H (Sigma) y se incuba a 37 ° C durante 60 min. Cuatro ml NaOH-SDS de amortiguación (# P2 de Qiagen) y se añadió incubados durante 5 min a temperatura ambiente. Cuatro ml de helada tampón de acetato de potasio (# P3 de Qiagen) y se añadió mixtas antes incubados 30 min en hielo y centrifugar a 20000 g a 4 ° C durante 1 h. El claro sobrenadante se aplicó a midi cartuchos y posteriormente manipulados como se sugiere (Qiagen). La calidad de la PBS disuelto ADN fue analizado por electroforesis en gel de agarosa y la evaluación de la relación A260/A280.

Expresión in vitro de la proteína gp120 BX08

Para examinar la expresión eucarióticos syn.gp120 BX08 gen, los humanos HEK293 riñón línea celular de fibroblastos (ATCC, Rockville, MD) fue transfectadas con pLL120, pLL120CpG, pEC120, y pEC120CpG, respectivamente, mediante transfección Effectene kit (Qiagen). Radioimmunoprecipitation (RIPA) del 35-S se reunieron y 35 S-Cys etiquetados proteína gp120 utilizando anticuerpos específicos se realizó tal como se describe [5].

ADN de vacunación

6-7 semanas de edad, ratones BALB / c fueron adquiridos de Bomholdtgaard (Taconic, Ry, DK) y mantenerse en grupos de cinco por jaula con comida y agua ad libitum y la luz artificial de 12 horas por día. El período de aclimatación antes de la inmunización fue de 5 días. Los ratones fueron inmunizados por vía intramuscular (im) en Tibialis anterior con 50 μ l de 2 mg / ml de endotoxina en el plásmido libre de PBS buffer utilizando pLL120, pLL120CpG, pEC120, y pEC120CpG, respectivamente. Las cuatro construcciones de la vacuna fueron probados en cuatro grupos de 10 ratones cada uno (n = 10). Un grupo de 5 ratones recibieron PBS buffer solo y sirvió como control negativo. Los ratones fueron vacunados en la semana 0, 9 y 15. Las muestras de sangre se extrajeron un día antes de la primera vacunación como un pre-inmune suero de control (día 0), y, posteriormente, cada tercera semana. El experimento se dio por terminada en la semana 19.

Ensayos serológicos

Mouse anti VIH-1 gp120 anticuerpos fueron medidos por ELISA indirecto. Los pozos de placas de poliestireno (Maxisorb, Nunc, Roskilde, Dinamarca) fueron recubiertas por 2 días a temperatura ambiente con el VIH-1 IIIB recombinante gp120 (Intracel) a 0,2 μ g/100 μ l de carbonato de buffer, pH 9,6. Antes de utilizar las placas fueron bloqueadas por 1 h a temperatura ambiente con 150 μ l / pocillo de tampón de lavado (PBS, 0,5 M NaCl, 1% Tritón-X-100), más el 2% de BSA y el 2% de leche desnatada en polvo. Después de 3 × 1 min de lavado de ratón plasma se añadió a 100 μ l / así diluido en amortiguador de bloqueo y las placas de ELISA fueron incubadas durante 90 min a temperatura ambiente usando un agitador de placas microtiter. La curva estándar se hizo de una reserva de plasma consistente en BX08 gp120 sueros positivos ratones [5]. Las placas fueron nuevamente lavadas 5 × 1 min y se incubaron 1 h a temperatura ambiente con 100 μ l / pocillo de HRP-conejo conjugado anti-ratón IgG (-Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) diluido 1:1000 en tampón de bloqueo. El color fue desarrollado con 100 μ l / pocillo de la enzima peroxidasa sustrato compuesto de 4 mg de o-fenilendiamina en 11 ml de agua más 4 μ l de peróxido de hidrógeno (30% w / w). La reacción se dio por terminado después de 30 min de 150 μ l / pocillo de 1 MH 2 SO 4. La densidad óptica (DO) de los pozos se midió a 492 nm utilizando un fotómetro microplaca. Anti-HIV-gp120 títulos de IgG se expresaron como el recíproco de la dilución del plasma que dio lugar a un OD 492 nm valor de 0,500.

IgG1 e IgG2a fueron analizadas por la captura gp120 sandwich ELISA [24, 25]. En pocas palabras, Maxisorb placas de 96 pocillos (Nunc) se pre-recubiertas la noche a la mañana con PBS que contenía 1 μ g / ml de piel de oveja anti-gp120 (Aalto, Dublín, IR), se lava 5 veces en PBS que contenía 0,05% de Tween-20 y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con 100 μ l 1% Tritón X-100 tratarse de células de la cultura libre sobrenadante de células 5.25.EGFP.Luc.M7 (donado por Ned Landau, Instituto Salk, CA, EE.UU.), que estaban infectadas crónicamente con VIH-1 BX08 . Una serie de dilución de muestras de plasma de cada ratón se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron cinco veces en PBS-Tween-20 e incubadas con HRP-Rat conjugado anti-ratón IgG1, IgG2a o anticuerpos (Pharmingen Brøndby, DK), tanto diluido 1:1000 en buffer de dilución (0,5 M NaCl, 3 mM KCl, 15 mM KH 2 PO 4, 6 mM Na 2 HPO 4: 2H 2 O, 2% Tritón X-100, 1% w / v BSA, 0,1% w / v fenol-rojo) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron cinco veces por encima y por una vez con agua destilada antes de colorimétrica desarrollo mediante la utilización de 100 μ l o-fenilendiamina solución de sustrato (Kem-En-Tec, Taastrup, DK). La reacción fue detenido con 150 μ l 1 MH 2 SO 4 y absorbancia medidos a 490 nm.

Intracelular de IFN-γ de citoquinas análisis de citometría de flujo (IC-FACS)

Mouse bazos fueron removidos aséptica en la semana 19 y suavemente para homogeneizar la suspensión única célula, se lava 3 veces en frío RPMI1640 (Invitrogen, Taastrup, DK), complementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS) (Invitrogen) y resuspendido a una concentración final de 5 × 10 7 células / ml. El bazo de los ratones fueron individuales homogeneizadas y trasladado a una ronda final de placa de 96 pocillos (2 × 10 5 células por pocillo). Wells, que contiene un volumen total de 200 μ l RPMI1640 con un 10% de FCS, se incubaron durante 6 horas a 37 ° C con 50 U / ml de IL-2 (Roche, Hvidovre, Dinamarca), monensina (3 μ M) (Sigma, Brøndby , DK), con y sin un 15-mer péptido derivado de la V3-loop del VIH-1 que contiene una BX08 conservadas murino H-2D d restringido CTL epítopo (IGPGRAFYTT). Los pozos se lavaron las células y re-suspendido a 50 μ l medio que contiene anticuerpos fluorescentes para los marcadores de superficie, CD4-FITC, CD8-PECy7, y CD44-APC (Pharmingen) y se incubarán durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Luego 100 μ l de monensina (3 μ M) en PBS se añadió antes de la centrifugación a 400 × g durante 5 min. Las células fueron resuspendido en 100 μ l de monensina (3 μ M) en PBS y 100 μ l de paraformaldehído al 2% (Merck, Damstadt, DE) y se incubarán durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Las células fueron pildoradas y resuspendido en 100 μ l de PBS solución que contiene 3 μ M monensina y el 1% de BSA. Las células fueron pildoradas y resuspendido en 200 μ l de PBS que contiene saponina 0,5% (Sigma) y se incubaron en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas pildoradas y durante 20 min a 4 ° C con 50 μ l 0,5% saponina PE solución que contenga conjugado anti-IFN-γ anticuerpos (Pharmingen) a las manchas para intracelular IFN-γ. Las células fueron lavadas dos veces con 100 μ l 0,5% saponina / PBS solución antes de añadir la fijación de una solución que contiene 2% de paraformaldehído. Fija las células se analizaron en un LSR BD-II flowcytometer (Becton Dickenson) utilizando la BD FACS Diva software.

Linfocitos T citotóxicos ensayo

Para la determinación de los linfocitos T citotóxicos (CTL) esplenocitos fueron incubadas 5 días con mitomicina C tratados (50 μ g / ml durante 1 h) y CTL péptido epítopo cargado ratón P815 (H-2D d) Estimulador de células en una proporción de 10: 1 en el medio suplementado con 5 × 10 -5 M β-mercaptoetanol. Para la determinación de citolítica CTL respuesta al VIH-1 BX08, P815 objetivo eran células pulsos con 20 μ g / ml de la pandemia del VIH-1 BX08 V3 péptido que contiene la SIHIGPGRAFYTTGD H-2D d restringido CTL epitopeCorbet, 2. Después de la estimulación esplenocitos fueron lavadas tres veces con RPMI1640 complementado con un 10% de FCS y resuspendido a una concentración final de 5 × 10 6 células / ml. Suspensión celular (100 μ l) fue añadido por triplicado, a U-96-parte inferior y placas microtiter y un nivel 4 h 51 Cr-liberación ensayo realizado tal y como se describe [4].

In vitro splenocyt activación de ADN plásmido

Esplenocitos fueron elaborados a partir de bazo de los no vacunados 6-12 semanas de edad las mujeres ratones BALB / c. Las células fueron cultivadas en 96-U-así parte inferior placas a 37 ° C y el 5% de CO 2 y mantenerse en RPMI1640 complementado con un 10% de FCS, 1% penicilina / estreptomicina, y el 0,1% mercaptoetanol. Esplenocitos (3 × 10 5 células / pocillo) fueron tratados con medio RPMI1640, plásmido (3 ug / así) o el plásmido de ADN tratados con DNasa I (Biolab, Risskov, DK), utilizando 1 U DNasa por 1 ug de ADN de 1 hr a 37 ° C seguido de la inactivación a 75 ° C durante 10 min. La síntesis de IL-6 e IFN-γ en sobrenadantes de células cultivadas de 0, 1, 2 y 3 días fue medido por sandwich ELISA kits (R & D Systems, Minneapolis, MN).

Resultados
Vectores y estimulante inmune motivos CpG

Las características de la L. lactis (pLL120 y pLL120CpG) y E. coli (pEC120 y pEC120CpG) basado en vectores se muestra en la Fig. 1. Secuencia de análisis mostró que la L. lactis vector columna vertebral tenía un contenido más bajo GC (37%) que el E. vector coli (48%) y contiene dos copias de un conocido estimulante inmune del ratón motivos CpG (CG GA TT), mientras que el E. coli vector columna vertebral sólo contenía un motivo CpG. A pesar de que el gen sintético gp120 es muy rica GC (56%) a causa de los codones humanizado, que no contenía clásico ISS motivos, pero el puerto tres motivos CpG humanos (dos copias de GT CG TT y una copia del CT CG AG) . El añadido CpG minigene figura 12 CpG dinucleotides dando lugar a seis consenso ISS motivos CpG (5'-dos purinas-CpG y dos pyrimidines-3 '), incluyendo dos ejemplares del ratón ISS motivos CpG (GA TT CG y CG AA TT) [ 22]. Por lo tanto, cuando se inserta el CpG minigene aumentado el número de ratón ISS por dos motivos. Sin embargo, no identificado ratón ISS o inhibidor inmune motivos CpG pueden estar presentes en los plásmidos.

Eucarióticas gp120 BX08 utilizando una expresión L. lactis basado Vector

Para evaluar la influencia de la columna vertebral del plásmido en la expresión de la gp120 de genes, células de riñón humano fueron transfectadas transitoriamente. La expresión del gen syn.gp120 BX08 utilizando la L. lactis o E. coli basada en vectores fue examinado por la Ley del 35-S etiquetados sobrenadante proteínas de las células HEK293 transfectadas y IgG purificada de un grupo de VIH seropositivos pacientes. S-35 etiquetado sobrenadante de células untransfected sirvió de control negativo y también se precipitó, pero no producir una proteína con un peso molecular de 120 kDa (Fig. 2]. Las células transfectadas con el cualquiera de los cuatro plásmidos vacuna produjo un producto 120 kDa (Fig. 2]. Los niveles de expresión de gp120 fueron comparables para pLL120 y pEC120, así como para pLL120CpG y pEC120CpG. Para ambos tipos de vectores de los importes expresados gp120 parece algo inferior cuando se abrigaba la CpG cassette. La L. lactis vectores basados en coche, por lo tanto, la síntesis de antígenos con tanta eficacia como la E. coli basada en vectores. Por otra parte, la gp120 se produjo inmunogénica como anticuerpos de VIH-1 en pacientes con sero positivo reconocer los producidos in vitro del VIH proteína (Fig. 2].

Respuesta de anticuerpos después de la inmunización genética

Hemos examinado las respuestas humorales en los ratones vacunados ADN utilizando ELISA (Fig. 3]. Los cuatro diferentes plásmidos (Fig. 1] se administra cada cuatro grupos de 10 ratones, respectivamente. Los ratones inmunizados con la im pLL120 y pLL120CpG en las semanas 0, 9 y 15 inducida por anticuerpos IgG específicos para la proteína gp120 con la misma cinética y máximo títulos como los ratones que reciben el E. coli basada en los plásmidos. La primera inmunización de alta inducida por anticuerpos específicos en todos los ratones. Los títulos obtenidos fueron similares a los obtenidos en los anteriores mouse experimentos de vacunación de ADN utilizando la syn.gp120 BX08 en WRG7079 [5]. La segunda inmunización en la semana impulsado los nueve títulos de anticuerpos un centenar de veces en todos los grupos. Además impulsar en la semana 15 tienen menos efecto. Los títulos obtenidos en cada momento se distinguen de los obtenidos con los correspondientes vectores que contienen la supuesta ISS CpG cassette. El grupo control negativo que reciben de amortiguación por sí sola no mostró anti-gp120 los títulos de anticuerpos por encima del fondo (datos no presentados). Por lo tanto, la cinética y la magnitud de la lucha contra la gp120 de inducción de anticuerpos fue similar utilizando la L. lactis basada en pJAG5 y el E. coli basados en el plásmido troncales.

El anticuerpo subclase perfil de la respuesta inducida se analizó. Aquí IgG1 específico gp120 y IgG2a se determinó por ELISA para ser utilizado como un marcador sustituto para el equilibrio Th1/Th2 (Fig. 4]. Los ratones inmunizados con la L. lactis basado plásmidos inducida por una proporción IgG1/IgG2a indistinguibles de que inducido por el E. coli basada pEC120 y pEC120CpG. Por otra parte, el IgG1/IgG2a ratios obtenidos a partir de los datos de vectores similares, con y sin el cassette CpG fueron estadísticamente indistinguible (dos muestras t-test, P> 0,05). Todas las IgG1 e IgG2a ratios fueron superiores a 1 y por debajo de 1,5, lo cual es indicativo de una sociedad mixta Th1: Th2 respuesta con un ligero predominio Th2 (Fig. 4].

CD8 + T la respuesta inmune de linfocitos después de la inmunización genética

Hemos examinado la respuesta inmune celular en ratones después de vacunas genéticas con syn.gp120 BX08 CTL citolítica de ensayo y tinción intracelular para la inducción de IFN-γ (IC-FACS) (Figs. 5 y 6]. Una fuerte respuesta inmune celular fue inducida por los cuatro vectores que fueron significativamente más altos que tanto el fondo (descargadas las células diana) y la respuesta plana unimmunized obtenidos a partir de ratones (datos no presentados). Esto confirma la expresión in vivo e inmunogenicidad de gp120 BX08 expresó de ambos L. lactis y E. coli vectores. Después de cinco días de estimulación epítopo un poco superior citolítica CTL respuesta se obtuvo con la E. coli basada en un plásmido, en comparación con la L. lactis basada en un plásmido (Fig. 5]. Además de la ISS CpG cassette aumentado este CTL respuesta para los dos vectores aunque más pronunciada para el E. coli basada en vectores (Fig. 5].

La respuesta celular también fue analizada por FACS IC-tinción directa de péptido epítopo inducida por IFN-γ en la producción de CD8 + T-células (Fig. 6]. El análisis confirmó la inmunidad específica celular inducida por la vacuna de genes en los cuatro vectores. Este IFN-γ inducción es, sin embargo, inferior en el caso de la L. lactis basado vectores que para el correspondiente E. coli basados en vectores.

Estimulación in vitro de esplenocitos de ADN plásmido

Para evaluar las propiedades estimulantes inmune de la vacuna plásmidos esplenocitos fueron co-incubadas con el plásmido de ADN y la inducción de citocinas pro-inflamatorias principalmente se analizaron. Es interesante señalar que la L. lactis basado en vectores inducida por una mayor síntesis de ambos IFN-γ e IL-6 que el correspondiente E. coli vectores (Fig. 7]. Por otra parte, además de los CpG minigene a la L. lactis vector causó una inducción significativamente mayor de los dos IFN-γ e IL-6 en comparación con el pLL120 sin el CpG minigene. Para analizar si este efecto estimulante es causada por el plásmido de ADN o de contaminantes en el ADN la preparación de ADN se degradadas enzimáticamente. DNasa tratamiento del plásmido soluciones abolido la pro-inflamatorias efecto (Fig. 7]. Por lo tanto, el estímulo inmunológico de inducción de la L. lactis vectores de vacuna está directamente relacionada con el ADN plásmido, y no a los contaminantes que pueden estar presentes en los preparativos de ADN.

Discusión

Vacunas de ADN plásmido son la próxima generación de vacunas. Hasta el momento, la investigación se ha centrado principalmente en la creación de vacunas orgánicas mediante el aumento de la antigenicidad de los genes codificados o de nuevos métodos de entrega plásmido. Por lo tanto, se centran en el plásmido columna vertebral y en la producción microbiana de acogida ha sido limitado. El principal impulsor de este estudio fue desarrollar una alternativa plásmido columna vertebral en vacunas de ADN y una nueva producción microbiana de acogida y de compararlo con un tradicional utilizado E. coli vacuna basada en ADN. Este estudio representa a nuestro conocimiento la primera alternativa para E. coli basada en vacunas de ADN plásmido y proporciona nueva información sobre la función de la columna vertebral del plásmido en vacunas de ADN.

Hemos examinado el uso de un nuevo L. lactis vector como el plásmido columna vertebral en vacunas de ADN. Las principales ventajas de este vector y su producción son evitar la cepa de genes de resistencia a los antibióticos y los antibióticos contaminantes, la falta de LPS y endotoxinas, y la mejora de la seguridad como la L. lactis sistema pueden considerarse como de grado alimentario. En presencia del thr portadoras de plásmido columna vertebral, la cepa auxotrophic de acogida es capaz de crecer en un medio química definida, a falta de treonina. El sistema es compatible con el uso en un medio de cultivo libre de componentes animales que pueden contener virus y priones. En concreto, hemos construido L. lactis basado en vectores de expresión con y sin ISS CpG una unidad que contiene el VIH-1 BX08 gp120 vacuna génica con los codones humanizado y ha desarrollado un procedimiento adecuado para la purificación del plásmido de ADN de L. lactis. Por otra parte, hemos demostrado expresión eucariótico in vitro, y las vacunas de ADN de los ratones y los compararon resultante humoral y celular la respuesta inmune con los obtenidos a partir de inducción con las tradicionales E. coli basada en vectores [5].

Purificación de ADN plasmídico de bacterias grampositivas se complica debido a la presencia de una gruesa pared celular peptidoglicano. Purificación de L. lactis ADN plásmido se ha basado en los procedimientos modificados alcalinos [26] incluido el uso de sustancias tóxicas como el fenol, cloroformo y el bromuro de etidio. El método que aquí se presenta convenientemente emplea la comercial de intercambio iónico cartuchos con algunas modificaciones que incluye un tratamiento inicial mediante una pared celular de enzimas degradantes. El plásmido preparación desarrollados que figuran sólo cantidades bajas de ADN genómico y ARN y fue demostrado su utilidad en análisis de rutina de plásmidos, transformación, transfección in vitro de 293 células humanas, in vivo y la inmunización de ADN. Aunque L. lactis es atractivo en términos de seguridad la eficiencia del sistema es un inconveniente. Debido al número de copias medio de la pJAG5 plásmido el rendimiento durante un proceso de fermentación es 5 veces menor que la de alto número de copias de plásmidos E. coli (datos no presentados). Sin embargo, un mayor número de copias de plásmidos se probó también en L. lactis, pero mostraron menores segregaciones estabilidad o una distribución menos favorable entre supercoiled y no supercoiled plasmid formas (datos no presentados).

La transfección de células HEK293 humanos demostrado por VIH-1 BX08 gp120 utilizando la expresión L. lactis pJAG5 columna vertebral como la entrega del vehículo. La diferencia en el contenido de nucleótidos y / o diferencia en el patrón de metilación en L. lactis ADN podría influir en la expresión y / o la respuesta inmune. Sin embargo, la intensidad en la Ley de gp120 producidos a partir de células transfectadas con pLL120 y pLL120CpG fue similar a la de las células transfectadas con E. coli vectores. Esto ilustra que la columna vertebral de vectores no afecten al nivel de expresión, que no podrá ser sorprendente, ya que ambos vectores contienen la misma unidad gp120 expresión. Las razones para un poco más baja expresión in vitro de dos vectores cuando la ISS CpG se incluye la unidad no se conocen, pero podría ser en parte debido a la metilación del ADN y el silenciamiento de los genes [27, 28].

La utilidad de pJAG5 para llevar la expresión eucariotas gp120 unidad e inducir una respuesta de anticuerpos a los codificados gp120 se evaluó mediante la inmunización de ADN desnudo. Ratones suero de anticuerpos IgG específicos para gp120 y la inducción siguió la misma cinética y potencia como la obtenida mediante el correspondiente E. coli plásmidos. Por otra parte, la IgG1/IgG2a coeficientes obtenidos con la L. lactis y el E. coli basada en vectores no fueron estadísticamente diferentes en este modelo murino. Por lo tanto, el balance Th1/Th2 inducida por el sustituto IgG1/IgG2a marcador fue similar para la L. lactis y E. coli basada en vectores, respectivamente. Curiosamente, tanto los títulos de anticuerpos y IgG1/IgG2a ratios fueron en gran parte no afectados por la presenta CpG minigene debe actuar como un adyuvante Th1 a través del Toll-like receptor 9 [29 - 33]. No puede descartarse que el uso de una diferente y menos propensos a Th2 ratón cepa o dosis altas de ADN plásmido podría dar pequeñas diferencias. Algunos investigadores también han observado efecto mínimo sobre la respuesta inmune humoral inducida por la vacuna de ADN de plásmidos con un número variable de motivos CpG presentes [34, 35]. De este modo, en oposición al orden inmune efecto de estimulantes sintéticos y de un solo hundidos oligodeoxynucleotides, el efecto de ADN plásmido es más controvertido.

En contraste con la idéntica respuesta humoral inducida por los cuatro plásmidos, CD8 + T-células se activaron menos de la L. lactis basado en vectores que por el E. coli basados en vectores, medido por tanto IC-FACS y CTL actividad. En estudios previos de sintético del VIH-1 sobre genes de cepas BX08 MN y no se encontró correlación entre la respuesta CTL y los niveles de expresión, secretada o membrana sujetos a los antígenos, el modo de entrega de ADN, las células T helper respuesta, o respuesta de anticuerpos [5 , 36, 37]. Esto puede no ser sorprendente ya que los mecanismos implicados y las limitaciones son muy diferentes. El humoral similar pero menor respuesta inmune celular de la L. lactis basado en vector puede ser debido a un menor efecto adyuvante en linfocitos T CD8 + ejercida por las diferencias en los motivos CpG ISS desde la introducción del CpG unidad mostró una tendencia a aumentar el CTL actividades dentro de cada grupo de ratones (Fig. 5]. Varios CpG la ISS, su número, ubicación o su espaciamiento o las secuencias de acompañamiento que puede estimular la activa las células inmunológicas y su producción de citoquinas diferente, y de esta forma influir en el diferencial resultante la respuesta inmune [35]. Tanto la presencia de desconocidos CTL-inmune de neutralización de las secuencias de plásmido en la espina dorsal [17, 38] o la falta de LPS contaminantes pueden causar la menor inducción de CTL observó utilizando la L. lactis vacuna basada en ADN. Para explicar este evaluamos la capacidad de activación inmune de los plásmidos en esplenocitos. Sorprendentemente, la L. lactis plásmidos mostró superior in vitro propiedades estimulantes inmunes que la prueba E. coli plásmidos. Para probar si este pro-inflamatorias efecto se debía a componentes contaminantes como el LPS de E. teichoic coli o ácido de L. lactis, el plásmido se degradadas enzimáticamente. Los resultados indican que la estimulación inflamatoria de los esplenocitos se debió a la plásmido de ADN en sí. Por ello, la estimulación in vitro de ensayo no puede explicar la menor citotóxicos T-respuesta celular inducida por los dos L. lactis vectores. Por otra parte, el mayor efecto adyuvante de la L. lactis vectores in vitro no se correlaciona con las vacunas de ADN in vivo donde los dos sistemas similares inducir respuestas de anticuerpos. Esto pone de relieve la importancia de los estudios en animales. Debido a la compleja naturaleza del efecto adyuvante de ADN plásmido, que mide el efecto resultante de ADN in vivo mediante la vacunación de grandes cantidades de ADN como habitualmente utilizados en mejorar la inmunización sin ningún tratamiento previo o adyuvante añadido para permitir la máxima inmune de la injerencia plásmidos. La diferencia observada en el celular pero no inmune humoral inducción de la L. lactis y E. coli basada en vectores puede dar lugar a nuevas formas de tratamiento adyuvante vacunas de ADN. En este sentido, la L. lactis vector puede ser una herramienta para analizar secuencias de ADN que se pueden agregar para un máximo de inducción de la respuesta inmune celular. El desarrollo de una mejora de L. lactis basado plásmido que puede inducir una mayor respuesta inmune celular es, sin embargo, esencial para que esto sea una verdadera alternativa a la E. coli basada en vacunas de ADN.

Conclusión

En este estudio sugieren una alternativa de acogida sistema de vector para su uso como vacunas de ADN plásmido. La L. lactis sistema se basa en una endotoxina-libre y seguro y el organismo plásmido columna vertebral está libre de genes de resistencia a los antibióticos. La L. lactis vacuna basada en ADN vector expresó el VIH-1 BX08 gp120 componente de la vacuna de manera similar a E. coli y los vectores inducida similar respuesta inmune humoral como correspondiente E. coli basada en los plásmidos. Sin embargo, en comparación con E. coli los plásmidos L. lactis vacuna basada en ADN inducidas por un sistema inmune celular más bajos. Esto no es debido a la falta de efecto estimulante inmune como la L. lactis basado plásmido mostraron alto efecto pro inflamatorias en esplenocitos. A pesar de que el sistema desarrollado es menos potente en comparación con la prueba E. coli sistema puede ser una valiosa herramienta para identificar nuevos componentes CTL adyuvante.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

GJG llevaron a cabo los estudios inmunológicos, junto con JG. MT hizo la in vitro splenocyte pruebas de ensayo inmunológico estimulante papel de los plásmidos. AFO supervisó la inmunológicos estudios, el diseño de la vacuna plásmidos y ayudó a redactar el manuscrito. SMM dio útil aportación a la genética de diseño de los plásmidos. JG hizo la vacuna de ADN construcciones, la producción de vacunas y redactó el manuscrito.

Agradecimientos

Reconocemos Irene Jensen, Poulsen Ulla, Pernille Smith, y Anne Cathrine Steenbjerg por su excelente asistencia técnica. Damos las gracias a Bjarne Albrechtsen para lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Ministerio danés de Ciencia e Innovación.