Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(3): 79-87 (más artículos en esta revista)

Una compañía de Time-y de ahorro de costes Método de producción de anticuerpos policlonales Rat

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Tomohiko Wakayama [1], Yukio Kato [2], Rie Utsumi [2], Akira Tsuji [2], Shoichi Iseki [1]
[1] Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Kanazawa, Kanazawa 920-8640, Japón
[2] División de Ciencias Farmacéuticas, Escuela de Graduados de Ciencias Naturales y Tecnología, la Universidad de Kanazawa, Kanazawa 920-1192, Japón

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados.

Resumen

La producción de anticuerpos por lo general toma más de tres meses. En el presente estudio, introducir una forma más rápida de producir anticuerpos policlonales basada en la preparación de oligopeptide recombinante como antígeno seguida de la inmunización de ratas. El uso de este método, los anticuerpos producidos contra dos proteínas de ratón: ERGIC-53 y c-Kit. Una expresión del vector ligated con un par de complementarios sintéticas oligodeoxyribonucleotides la codificación de la proteína se introdujo en las bacterias, y la recombinante oligopeptide fusionados con la proteína transportadora de glutation S-transferasa fue purificado. Ratas Wistar fueron inmunizados por la inyección subcutánea de antígenos emulsionar en la posterior footpads, seguida de una inyección de refuerzo después de 2 semanas. Una semana después de la dosis, los sueros fueron recogidas y analizadas por el título de anticuerpos mediante técnicas de inmunohistoquímica. Antisueros con 1.600 veces el título en la máxima se obtuvieron para ambos antígenos y confirmado por su especificidad a través de Western Blot. Anti-ERGIC-53 antisueros reconoció células acinares en la glándula sublingual, y anti-c-Kit antisueros reconocido espermatogénica y células de Leydig en el testículo. Estos antisueros son aplicables a doble fluorescente inmunoticción con monoclonales de ratón o conejo anticuerpos policlonales. En consecuencia, este método nos ha permitido producir específicas rata antisueros policlonales disponibles para inmunohistoquímica en menos de un mes a un costo relativamente bajo.

I. Introducción

Los anticuerpos son herramientas indispensables para analizar las funciones de la proteína en la amplia esfera de las ciencias de la vida. Son particularmente útiles para la inmunohistoquímica, una técnica que visualiza el tejido específico y localización celular de las proteínas y otros antígenos [2, 8]. En muchos casos, se puede adquirir anticuerpos monoclonales y policlonales de fuentes comerciales, u obtener de otros investigadores. Sin embargo, en los casos en que vamos a estudiar nuevas proteínas o raras o comercial cuando los anticuerpos son de calidad insatisfactoria, tenemos que producir los anticuerpos para nosotros o para ellos como los productos personalizados.

En general, la producción de anticuerpos, si son policlonales o monoclonales, es costoso y consume tiempo [3]. Cuando la producción de anticuerpos policlonales en conejos, muchos investigadores, a menos que el propio antígeno purificado las proteínas de las fuentes de vida, ya sea emplean proteínas recombinantes o sintéticos como antígenos oligopeptides. Proteínas recombinantes generalmente se producen en las bacterias mediante la introducción de la expresión del vector ligated con toda la secuencia de codificación de las proteínas del antígeno. Sin embargo, los de larga duración proteínas producidas por bacterias son a menudo difíciles de aislar debido a su insolubilidad. Oligopeptides sintéticas se componen de 10 a 25 residuos de aminoácidos que representan porciones de los antígenos de proteínas que poseen una alta especificidad y antigenicidad. Sin embargo, que normalmente requiere varias semanas de tiempo y un costo considerable para obtener oligopeptides como productos personalizados. En ambos casos, dos o más conejos inmunizados se inyectan en repetidas ocasiones por los antígenos por vía subcutánea cada dos semanas durante un período de unos meses. En consecuencia, el tiempo total necesario para la preparación de antígenos y la inmunización es superior a tres meses. Por otro lado, cuando la producción de anticuerpos monoclonales en ratones, todo el procedimiento que consiste en la inmunización de puras (Balb / c) los ratones mediante la inyección de los antígenos por vía intraperitoneal, esplénica fusión de linfocitos B con células de mieloma, y la clonación de células hibridoma la cepa en la cultura toma por lo menos seis meses.

Recientemente, Sado et al. Introdujo una forma novedosa de producir anticuerpos monoclonales en ratas llamado la "rata de ganglios linfáticos método" [5, 9, 10]. Este método se caracteriza por la inyección de antígenos en la piel de footpads seguida de la recogida de células B ilíaca medial de los ganglios linfáticos en un puras (WKY) cepa de rata. Este método toma un tiempo mucho más corto que el método ordinario de ratón producción de anticuerpos monoclonales, ya que emplea una única inyección de los antígenos seguida de la recogida de los ganglios linfáticos dos semanas más tarde. Aunque los mismos autores sugirieron que los antisueros obtenidos de las ratas en el momento de sacrificio se dispondrá como anticuerpos policlonales, los antisueros a menudo tienen demasiado bajos títulos de anticuerpos para su uso en inmunohistoquímica, probablemente a causa de su breve período de inmunización. El refuerzo de inmunización se evitó en este método con el fin de aumentar la frecuencia de hibridomas positivos después de la fusión de células B con células de mieloma.

Estas consideraciones nos llevaron a explorar un método mejorado de la obtención de anticuerpos policlonales en un tiempo mucho más corto. Este método incluye la producción de la oligopeptide recombinante en bacterias y la modificación de la rata de ganglios linfáticos método para producir anticuerpos policlonales. En el presente estudio, hemos utilizado este nuevo método para aumentar la antisueros contra dos proteínas membranoso, ERGIC-53 y c-Kit. ERGIC-53 es un animal L transmembrana de tipo lectina que se sabe están involucrados en el transporte de determinadas glicoproteínas de la áspera retículo endoplasmático (ER) para aparato de Golgi en las primeras vía secretora. Una estructura subcelular membrana llamada ER-Golgi compartimento intermedio (ERGIC) ha postulado basado en la localización de ERGIC-53 [14]. C-Kit es un receptor transmembrana tirosina quinasa y postula a desempeñar funciones en los primeros fenómenos de desarrollo incluyendo la hematopoyesis, la gametogénesis y la melanogénesis. En el testículo, c-Kit es considerado como un marcador de diferenciación de las espermatogonias y células de Leydig [17]. Varios de los nuevos hallazgos utilizando estos antisueros policlonales en ratón y la glándula sublingual testículo se presentará.

II. Materiales y Métodos
Animales

Diez semanas de edad las mujeres ratas Wistar para la inmunización y diez semanas de edad de sexo masculino SLC: ratones ddY para inmunohistoquímica, tanto en colonias cerradas, se compraron de Nippon SLC, Inc (Hamamatsu, Japón). Ellos se mantuvieron menores de 12 hr light/12 Horas oscuras condiciones de laboratorio con libre acceso a la norma de los alimentos y el agua. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo a las Directrices para el Cuidado y Uso de animales de laboratorio en la Universidad de Kanazawa.

Preparación de antígenos

Pares complementarios sintéticas oligodeoxyribonucleotides para ERGIC-53 (número de GenBank, AK011495), y c-Kit (GenBank número, NM_ 021099 [1]] fueron adquiridos de Japón BioService (Asaka, Japón) como productos personalizados. El sentido y antisentido capítulos fueron concebidos para formar un doble hundidos de ADN que contiene una porción de codificación de cDNA 12 o 15 aminoácidos de ERGIC-53 o c-Kit, respectivamente, un codón de parada, y EcoRI y la enzima de restricción SalI sitios a los 5 'Y 3' termina, respectivamente (Fig. 1]. Eran annealed de incubación en buffer TE con 150 mM de cloruro de sodio por 10 min a 65 ° C y luego dejen enfriar a temperatura ambiente (RT). El resultado de ADN doble hundidos se ligated con el vector de expresión bacteriana pGEX-6p-1 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) a la EcoRI / enzima de restricción SalI sitios multicloning en el sitio ubicado aguas abajo del promotor y glutatión-S-transferasa ( GST)-regiones codificantes. El vector fue construido luego introducido en las bacterias BL21 (Novagen, Madison, WI) y una colonia transformado fue recogida y cultivadas en la ampicilina que contienen medio LB hasta la densidad óptica de 0,5 (600 nm) a 37 ° C. Expresión de la recombinante oligopeptide fusionados con la proteína transportadora GST fue inducida mediante la adición de 1 mM isopropílico-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) a los medios de comunicación y seguir incubando la bacteria de 2 horas a 37 ° C. Las bacterias fueron homogeneizados en B-PER proteína bacteriana extracción reactivo (Pierce, Rockford, IL). Tras la centrifugación de homogenado, el sobrenadante que contiene el soluble recombinante GST-fundido oligopeptide (posteriormente denominado proteína recombinante) para ERGIC-53 o c-Kit se incubó con Glutatión Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech) la noche a 4 ° C. El complejo de la proteína recombinante y Glutatión Sepharose 4B se lavan una vez con PBS que contenía 0,1% Tritón-X de centrifugación, 4 tiempos con PBS y después 4 veces eluye con 20 mM de glutatión en 0,1 M Tris-HCl (pH 8.0) que contiene 0,1 M cloruro de sodio. La concentración y peso molecular de la proteína recombinante en el eluyente fue estimado por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Una alícuota del eluyente se electrophoresed en un gel de acrilamida, teñidas con azul de Coomassie brillante de 1 hora, y luego se lavan en la destaining solución que contenga un 5% de ácido acético y el 7,5% de metanol noche a la mañana.

La inmunización de ratas y la producción de anticuerpos policlonales

Mujeres ratas Wistar fueron anestesiados con pentobarbital sódico (75 mg / kg de peso corporal) por inyección intraperitoneal, y un 100 μ l de sangre periférica muestra se recogió de la cola vena para la preparación de preimmune suero. Tres ratas fueron vacunados para cada antígeno. Cada rata fue inyectada por vía subcutánea en la posterior footpads con 200 μ l de emulsión que contiene 200 μ g de proteína recombinante como antígeno en solución salina fisiológica y Freund completo del adyuvante (Difco, Detroit, MI) a 1:1 mixto (Fig. 2]. Dos semanas más tarde, un 100 μ l de muestra de sangre se recogió para la medición de los títulos de anticuerpos séricos, seguida de una inyección de refuerzo de los animales con la misma cantidad de antígeno emulsionar con Freund's adyuvante incompleto. Una semana después de la dosis, los animales fueron sacrificados por la anestesia profunda, toda la sangre se recogió a través de la vena pulmonar, y el suero fue separado por salir de la sangre durante 30 minutos a 37 ° C, seguido por centrifugación. Después de la determinación de los títulos de anticuerpos, alícuotas de antisueros para el uso práctico fueron absorbidos con GST en una concentración de 100 μ g / ml para 1 hora a RT para bloquear los anticuerpos reactivos con GST y almacenarse a 4 ° C con 0,05% azida sódica. El resto de antisueros fueron almacenadas a -80 ° C. Todos los experimentos posteriores se realizaron con el GST-absorbida antisueros.

Western blot

Alícuotas de lisados de células de ratón glándula sublingual que contiene los testículos y 30 μ g de proteínas fueron sometidas a SDS-PAGE seguida de la transferencia a membranas PVDF (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los blots fueron incubadas con ratas anti-ratón ERGIC-53 antisueros a 1:2000 dilución o anti-ratón c-Kit antisueros a 1:3000 dilución a 4 ° C durante la noche. Después del lavado, los blots fueron incubadas con peroxidasa de rábano marcado anti-rata de anticuerpos IgG (Dako, Glostrup, Dinamarca) a 1:5000 dilución de 1 hora a RT. El immunoreaction fue detectada con rayos X la película (Kodak, New Haven, CT, EE.UU.) tras el tratamiento de la blots con un reactivo quimioluminiscente ECL-plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia).

Preparación de tejidos y la titulación de anticuerpos con inmunohistoquímica

Hombre SLC: ddY ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico, muerto por la hemorragia de la aurícula derecha, y transcardially perfundidos con solución salina fisiológica fría seguida de un 4% de paraformaldehído fría (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) en 0,1 M tampón fosfato (pH 7.4) para fijación. La glándula sublingual y los testículos fueron disecados, más inmersos en el mismo fijador la noche a 4 ° C y luego enjuagar en PBS con 30% de sacarosa la noche a 4 ° C durante cryoprotection. Posteriormente fueron congeladas y cortadas en 8 - μ m secciones usando un criostato (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).

Por inmunoticción fluorescentes, las secciones fueron tratadas con 5% de suero normal de cabra en PBS durante 1 hora a impedir que los no-unión de los anticuerpos específicos. Posteriormente, las secciones de la glándula sublingual o testículo se incubaron durante la noche a 4 ° C con las muestras de rata anti-ratón ERGIC-53 o anti-ratón c-Kit antisueros diluidos 25 a 3200 veces con PBS. Para el control, la preimmune suero se utilizó con la misma dilución. Después de lavar las secciones con PBS, el immunoreaction fue visualizado por incubando las secciones, ya sea con anti-rata anticuerpos IgG o anti-rata anticuerpos IgM conjugado con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene, Oregón) a 1:400 de la dilución a 1 hr RT. Después del lavado, las secciones fueron montadas en glicerina y sometido a examen con un microscopio de fluorescencia (Olympus BX50/BX-FLA) usando verde de emisión. El número máximo de la dilución de antisueros para proporcionar immunoreaction positivo en la glándula submandibular (por ERGIC-53) o los testículos (por c-Kit), en comparación con la reacción negativa con la misma dilución de suero preimmune, se definió como el anticuerpo título de los antisueros. Tanto los títulos de IgG e IgM anticuerpos se obtuvieron mediante el uso de Alexa Fluor 594-etiquetados anti-IgG e IgM anti-anticuerpos secundaria, respectivamente.

Fluorescente doble inmunoticción

Las secciones de la glándula sublingual se incubaron con la mezcla de rata, ratón policlonal anti ERGIC-53 antisueros (1:400 dilución) y el ratón anti-BiP/GRP78 anticuerpo monoclonal (BD Biosciences, San Jose, CA, 2 μ g / ml) o el ratón anti-GM130 anticuerpo monoclonal (BD Biosciences, San Jose, CA; 5 μ g / ml) durante la noche a 4 ° C. Del mismo modo, las secciones de testículo se incubaron con la mezcla de rata, ratón anti-c-Kit antisueros (1:400 dilución) y conejo anti-ratón SgIGSF anticuerpos policlonales ([15, 16], 1 μ g / ml) durante la noche a 4 ° C. Tras el lavado con PBS, los sitios de immunoreaction se visualizaron por incubando las secciones, sucesivamente, con la mezcla de Alexa Fluor 594-etiquetados anti-rat IgG (1:400 dilución) y Alexa Fluor 488-etiquetados anti-mouse IgG (1:400 dilución ) O Alexa Fluor 488-etiquetados anti-conejo IgG (1:400 dilución) para anticuerpos en 1 hora RT. Después del lavado, las secciones se counterstained en los núcleos con 10 ng / ml de Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) durante 5 min, montado en glicerol y sometidos a examen con un microscopio de fluorescencia (Olympus BX50/BX- FLA, Tokio, Japón) usando verde de emisión de Alexa Fluor 594, azul de emisión de Alexa Fluor 488 y UV de emisión para Hoechst 33258. Para confirmar la especificidad de la immunoreaction, que es el principal antisueros fueron sustituidas por las preimmune suero o preabsorbed con el antígeno utilizado para la inmunización (50 μ g de proteína recombinante en 1 ml de antisuero diluido) para 1 hora a RT antes de su uso.

III. Resultados
La producción de recombinantes como antígenos oligopeptides

El recombinante oligopeptides para ERGIC-53 y c-Kit, que se purifica mediante la absorción de las bacterias homogeneizado con Glutatión-Sepharose 4B, fueron sometidos a análisis de SDS-PAGE (Fig. 3]. Única proteína bandas de aproximadamente 30 kDa en tamaño, lo que representa el fundido de proteínas GST (25 kDa) y oligopeptides, se detectaron sin contaminación con otras proteínas bacterianas.

La producción de antisueros en las ratas

Los títulos de IgG e IgM contra anticuerpos ERGIC-53 y c-kit se midieron en los sueros de 3 ratas para cada antígeno tiempo en dos puntos, es decir, dos semanas después de la vacunación inicial y una semana después de que el único refuerzo de inmunización (Fig . 4 A, B). Para ambos antígenos, los títulos de los anticuerpos IgG no eran más de 200 veces el primer tiempo, pero mostró notables aumentos de la segunda vez, hasta tan alto como 1.600 veces, lo que sugiere la eficacia del único refuerzo de inmunización. Hubo cierta heterogeneidad en los títulos de anticuerpos entre las ratas inmunizadas con c-Kit. Las ratas con una disminución del título la primera vez que tendían a mostrar un menor comparativamente título por segunda vez. En contraste, aquellos con títulos de anticuerpos IgM que tenían 50-400 veces la primera vez tienden a permanecer tan bajas como 50-100 veces la segunda vez, lo que sugiere que la mayoría de anticuerpos producidos tras el refuerzo pertenecían a IgG.

La especificidad de los antisueros

El Western blot, la glándula sublingual ratón mostró una sola banda immunopositive de alrededor del 58 kDa en tamaño, lo cual es coherente con el conocido 517 residuos de aminoácidos para ratón ERGIC-53 (número de GenBank, NP_081676). Además, la prueba mostró una amplia immunopositive banda de aproximadamente 140-160 kDa en el tamaño del ratón en representación de c-Kit [1] (Fig. 5]. No hubo banda extra immunopositive incluido el GST para alrededor de 25 kDa de tamaño. Estos resultados indican que la actual rata antisueros específicamente reconocido ratón ERGIC-53 o c-Kit.

Inmunohistoquímica caracterización de los antisueros

En la glándula sublingual ratón, rata anti-ERGIC-53 antisueros principalmente immunostained células acinares, donde la inmunoreactividad parecía ser localizados a delgada citoplásmica zonas situadas fuera de los gránulos secretores (Fig. 6 A, B). La absorción de los anticuerpos primarios con el antígeno recombinante de proteínas eliminadas por completo la inmunoticción, lo que confirma la especificidad de los antisueros (Fig. 6 C). A fin de determinar la localización subcelular de ERGIC-53, doble inmunoticción se realizó a través de rata anti-ERGIC-53 antisueros combinada con el anticuerpo monoclonal de ratón contra BiP/GRP78, un marcador ER [6], o GM130, un cis-Golgi marcador [ 7]. La inmunoreactividad para ERGIC-53 se superponen parcialmente, pero no completamente, con que para ambos BiP/GRP78 y GM130 (Fig. 6 D-I). En el testículo del ratón, rata anti-c-Kit antisueros immunostained la membrana plasmática de las células de Leydig y una subpoblación de células epiteliales seminíferos (Fig. 7 A, B). Una vez más, la absorción de los anticuerpos primarios eliminado completamente el inmunoticción (Fig. 7 C). Doble inmunoticción se realizó a través anti-c-Kit antisueros junto con el conejo anticuerpos policlonales contra SgIGSF, una molécula de adhesión que se sabe que se expresa en las células espermatogénica [15] (Fig. 7 A-F). SgIGSF fue localizado en la membrana de las dos espermátidas alargándose y la anterior fase espermatogénica células situadas en la membrana basal. Esta última población celular se superponen con c-Kit-positivos espermatogénica población celular casi por completo.

IV. Discusión

El método actual de la producción de anticuerpos para inmunohistoquímica, así como el Western Blot es novedosa en dos aspectos: la preparación de la oligopeptide recombinante como antígeno y la inmunización de ratones para aumentar antisueros policlonales. Para preparar el antígeno, hemos utilizado sintéticas oligodeoxyribonucleotides complementarias destinadas a producir un doble-hundidos ADN flanqueado por la enzima de restricción sitios, que luego fue ligated con el vector de expresión bacteriana para producir recombinante oligopeptides. Similar uso de oligodeoxyribonucleotides fue presentado por Sasaki et al. [12] para producir la etiqueta ribonucleotide sondas para hibridación in situ. El oligopeptide recombinante aprobado en la presente método posee ventajas de la recombinación de larga duración y la proteína sintética oligopeptide. El recombinante oligopeptide, al igual que la recombinante de larga duración proteína, pueden producir una gran cantidad de antígeno fusionados con la proteína transportadora GST como bacterianas producto. Por otra parte, la primera es más fácil solubilized que el segundo debido a su menor peso molecular. Por otra parte, la recombinante oligopeptide, al igual que los sintéticos oligopeptide, puede ser diseñado de acuerdo a la secuencia selectiva con una alta especificidad y antigenecity. A pesar de que el ex no puede obtenerse como una costumbre producto como éste, es menos costoso y requiere un tiempo más corto para producir.

Hemos empleado la rata como animal inmune, que es mucho menos costoso y requiere mucho menor cantidad de antígenos (menos de 1 mg por animal) que el conejo. Para obtener anticuerpos policlonales rata, los empleados "rata ganglio linfático método", que fue originalmente desarrollado para la producción de anticuerpos monoclonales [9], con varias modificaciones. En primer lugar, hemos utilizado SLC: Wistar, una cepa de rata en un circuito cerrado de colonia, en lugar de WKY, una pura cepa de rata utilizada en el método original. El primero es menos costoso que el segundo, mientras que confirmó en un experimento preliminar que no hay diferencia en los títulos de anticuerpos en suero entre las dos cepas. En segundo lugar, los antígenos administrados emulsionar en la posterior footpad a través de la vía subcutánea, en lugar de la intracutaneous ruta aprobada en el método original. Esto se debe a que el método original estaba destinada a restringir la reacción inmune a medial ilíaca los ganglios linfáticos para obtener anticuerpos monoclonales que producen los linfocitos en altas frecuencias [9], mientras que el método actual es simplemente para aumentar antisueros policlonales. Por último, hemos realizado un refuerzo de inmunización que se eviten en el método original. Un único refuerzo demostrado ser suficiente para producir más de 1000 veces títulos. Repetir la dosis dos veces o más no necesariamente rendimiento superior títulos de anticuerpos (datos no presentados). Valoración de los antisueros en el presente método se basa en tinción inmunohistoquímica y, por tanto, fiable cuando la dilución de antisueros para el uso práctico. La duración total de 3 semanas requeridas para la inmunización es mucho más corto que en los conejos, que es normalmente 3 meses o más. A pesar del concepto general de que la clase de inmunoglobulinas que aparecen anteriormente se IgM, hemos demostrado que la mayoría de los anticuerpos en ratas después de planteado el refuerzo es IgG. El volumen total de antisueros obtenidos a partir de una rata es de aproximadamente 5 ml, que es mucho menor que la de un conejo pero es suficiente para su uso en estudios inmunohistoquímicos realizados en un único laboratorio. Por otra parte, aunque es difícil de purificar rata anticuerpos IgG en la fracción debido a la menor afinidad de IgG de rata a una proteína G o, son suficientes para el uso de antisueros para inmunohistoquímica fines, siempre y cuando los títulos de anticuerpos son lo suficientemente alto .

Al utilizar el nuevo método actual, que produce los anticuerpos contra la rata ERGIC-53 y c-Kit y aplicado con éxito a doble inmunoticción con monoclonales de ratón y conejo anticuerpos policlonales, respectivamente. Dado que la mayoría de los anticuerpos utilizados para inmunohistoquímica se monoclonal de ratón y conejo anticuerpos policlonales, es una gran ventaja de rata antisueros policlonales para poder ser combinado con ambos tipos de anticuerpos de doble inmunoticción. El presente de lucha contra la ERGIC-53 antisueros immunostained la sublingual de células acinares, una glicoproteína moco de células productoras de población. ERGIC-53 es un tipo de proteína de membrana que pertenecen a una familia de animales de tipo L lectinas [13]. ERGIC-53 con su dominio luminal se une glicoproteína productos en la sala de emergencia y con su dominio citosólico se une COPII y Copi, el revestimiento de la vesícula-proteínas implicadas en ER-Golgi antero-retrógrada y Transportes, respectivamente [4]. Sobre la base de funcionales y moleculares estudios realizados en cultivos celulares, ERGIC-53 se considera responsable de la vesicular transporte de determinadas glicoproteínas de la sala de emergencia para aparato de Golgi. Aunque la parte interna de la membrana que alberga ERGIC-53 se definió como el ERGIC, ultraestructurales la base para ERGIC no está claro. El presente estudio demostró la superposición parcial de ERGIC-53 con ER y cis-Golgi marcadores, lo que confirma que representa el ERGIC membranoso compartimento intermedio de ER y cis-Golgi. Recientemente hemos descubierto SLAMP, un nuevo miembro del animal, tipo L-lectina familia, en rata y ratón glándulas sublinguales [11]. La localización intracelular y la función de SLAMP en comparación con los de ERGIC-53 es objeto de una investigación utilizando la actual lucha contra el ERGIC-53 antisueros.

Por otra parte, el actual anti-c-Kit antisueros immunostained la espermatogénica células ubicado adyacente a la membrana basal de los túbulos seminíferos, así como las células de Leydig. C-Kit es un receptor transmembrana de la célula de vástago de citoquinas y del factor es responsable de la supervivencia y / o la proliferación de la diferenciación de espermatogonias tipo A [17]. Se acepta en general que c-Kit es un marcador de las espermatogonias poblaciones distintas de la indiferenciada espermatogonias de tipo A, las células madre espermatogénica población. En el presente estudio, doble-inmunoticción demostrado que la mayor parte de la c-Kit-immunopositive espermatogénica células son al mismo tiempo positivo para SgIGSF. En nuestro anterior trabajo, se informó, sobre la base de la enzima-anticuerpo marcado método, que las células espermatogénica en el paso intermedio de (tipo B) espermatogonias o más tarde se immunopositive para SgIGSF [15]. Sin embargo, el presente estudio, utilizando la más sensible método de anticuerpos fluorescentes y doble inmunoticción con c-Kit, sugirió que la expresión de SgIGSF comienza tan pronto como en la etapa de diferenciación de tipo A espermatogonias. Esto también es coherente con nuestra anterior conclusión de que el epitelio seminífero de ratones mutantes WWv, que se carece en la c-Kit de genes y, por ende, se producen en el linaje de células espermatogénica más tardar el espermatogonias indiferenciadas, se carece de SgIGSF inmunoreactividad [15].

En conclusión, el método actual nos permitirá producir anticuerpos para inmunohistoquímica en menos tiempo ya menor costo.