Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(3): 95-100 (más artículos en esta revista)

Survivin como un factor pronóstico para los pacientes osteosarcoma

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Eiji Osaka [1], Takashi Suzuki [2], Shunzo Osaka [1], Yukihiro Yoshida [1], Hideyuki Sugita [1], Satoru Asami [2], Keiichi Tabata [2], Akihiro Hemmi [4], Masahiko Sugitani [4], Norimichi Nemoto [4], Junnosuke Ryu [1]
[1] Departamento de Cirugía Ortopédica, Nihon University School of Medicine
[2] Colegio de Farmacia, Universidad Nihon
[3] Departamento de Pediatría, Nihon University School of Medicine
[4] Departamento de Patología, Nihon University School of Medicine

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Resumen

Objeto: Survivin es uno de los genes inhibidor de la apoptosis y rara vez se expresan en tejidos adultos. Sin embargo, survivin expresión se ha detectado en diversos cánceres humanos y las correlaciones han sido reconocidas entre el nivel de expresión de este gen en los tumores y el pronóstico. En este estudio, se investigó la correlación entre la expresión mRNA survivin osteosarcoma en los tejidos y clinicopathological parámetros.

Métodos: Se incluyeron 22 pacientes con osteosarcoma en nuestro hospital con parafina de los tejidos incrustados que pueden ser extraídas de biopsias. Se ha utilizado la RT-PCR método después de la extracción de RNA total y densitométricas llevó a cabo un análisis para determinar la proporción de survivin en relación con h-GAPDH como un marcador interno.

Resultados: La expresión de mRNA survivin se detectó en todas las muestras de osteosarcoma. Los pacientes con metástasis survivin había elevado los niveles de mRNA en biopsias iniciales (p <0,01). Por otra parte, hubo una diferencia estadísticamente significativa en survivin mRNA expresión entre los pacientes con y sin metástasis (p <0,01).

Conclusión: Llegamos a la conclusión de que los altos niveles de mRNA expresión survivin sugieren mal pronóstico para pacientes con osteosarcoma.

I. Introducción

El osteosarcoma se asocia con una elevada tasa de morbilidad en adultos jóvenes y adolescentes. Es un tumor agresivo que con frecuencia metástasis al pulmón. Las actuales protocolos de tratamiento para el osteosarcoma incluyen la resección quirúrgica amplia del tumor primario y la quimioterapia multirresistente [4, 19]. Clínicamente, se determina el pronóstico del postoperatorio de la respuesta a la quimioterapia y, en el pasado, por el tamaño del tumor y amplia los márgenes quirúrgicos. Estos han sido desde hace mucho tiempo los únicos factores pronósticos útiles para pacientes con osteosarcoma.

Survivin es miembro de la apoptosis inhibidor de la proteína (IAP) y la familia se caracteriza por una estructura única. Contiene un solo baculovirus inhibidor de la apoptosis proteína repetir (BIR) y carece de un carboxilo terminal muy interesante nuevo gen (RING) dedo de la mano de dominio. También se une directamente a ambos caspasa-3 y caspasa-7, lo cual inhibe la apoptosis [5].

Por otra parte, survivin es lo suficientemente expresadas durante el desarrollo fetal, pero no en tejidos humanos de adultos [3]. Survivin ARNm se ha detectado en diversos tumores malignos humanos, como cáncer gástrico, el cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga urinaria, sarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma y neuroblastoma. Survivin este modo, se ha pensado para promover la progresión tumoral [12 - 17, 20, 21, 25, 27].

En este estudio, que mide los niveles de expresión survivin en parafina de tejidos embebidos osteosarcoma, y llegó a la conclusión de que los altos survivin niveles de mRNA expresión puede servir como un factor pronóstico para pacientes con osteosarcoma.

II. Material y Métodos
Pacientes y muestras de tejidos

Veintidós muestras de tejidos, todos obtenidos de pacientes con osteosarcoma en el Departamento de Cirugía Ortopédica, Nihon University School of Medicine, durante el período comprendido entre 1992 y 2000, fueron incorporados en parafina. Los pacientes fueron 14 hombres y ocho mujeres, con una media de edad de 25 años (rango 8 a 62 años). Veinte pacientes tenían Enneking la etapa II B, y los dos restantes fase III B [9]. Los tumores se localizaron en el fémur distal en nueve pacientes, la tibia proximal en cinco pacientes, peroné proximal en un paciente, húmero proximal en dos pacientes, vértebras en dos pacientes y en otros sitios en tres pacientes. El tipo histológico fue de osteosarcoma osteoblásticas en 14 pacientes, chondroblastic en cuatro pacientes y fibroblástica en cuatro pacientes. Veintiún pacientes fueron sometidos a resección después de la biopsia inicial, pero recibió una resección amplia como la operación inicial. Después de la primera biopsia, 21 pacientes recibieron múltiples agentes de quimioterapia neoadyuvante y resección amplia, y once casos había metástasis. Los fármacos citotóxicos utilizados como la quimioterapia preoperatoria se cis-diammine dichloroplatinum, adriamycin, iphosphamide, y altas dosis de metotrexato. Once pacientes tuvieron metástasis, y 5 años después del primer examen médico, nueve pacientes habían muerto de su enfermedad, y dos pacientes fallecieron de complicaciones intra o postoperatorias (Tabla 1].

Normal hueso, músculo y tejido adiposo se obtuvieron muestras de donantes sanos que habían sufrido una artroplastia total de rodilla. El consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos antes de realizar el estudio.

Cultivo celular

Un osteosarcoma humano línea celular (NOS-1) se obtuvo del Banco de Genes de Riken, Bioresources Center. Las células fueron cultivadas en medio RPMI1640 complementado con un 10% inactivado por calor suero fetal bovino, 100 U / ml penicilina, y 0,1 mg / ml estreptomicina menos del 5% de CO 2 a 37 ° C.

ARN aislamiento
La cuantificación del ARN

El ARN total fue determinada cantidad de radiación ultravioleta (UV) mediante espectrofotometría de Gene Espec III (Hitachi). Hemos ajustado la concentración de ARNm a 0,5 g / ml.

Transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)

ARN transcrito fue inversa a cDNA utilizando un ARN Takara PCR kit (AMV) Versión 3.0 (Takara, Otsu, Japón) con oligo (dT) como una cartilla. RT reacciones se llevaron a cabo a 42 ° C durante 30 min, seguido de recocido a 99 ° C durante 5 min y, por último, la celebración a 4 ° C. Amplificaciones de PCR se realizaron en un MasterCycler (Eppendorf, Westbury, NY, EE.UU.).

Para determinar la fase de saturación de RT-PCR de amplificación, empezamos con titulaciones de ciclo survivin. Las reacciones fueron detenidos después de 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 y 60 ciclos. El ciclo de PCR número determinado de survivin fue de 35, por lo tanto, la fase de saturación no se alcanzó.

Se utilizó humanos glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH h-) como un marcador interno y NOS-1 como un control positivo. En parafina embebido en los tejidos, los productos PCR de más de 200 pb fueron indetectables a causa de la degradación de ácidos nucleicos. Por lo tanto, los primers diseñados con menos de 200 bp, y primer pares para survivin mRNA fueron los siguientes. La secuencia de los primers para avanzar survivin fue 5'-TGCCCCGACGTTGCC-3 ', y la secuencia inversa de la cartilla de survivin fue 5'-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3'.

Análisis y cantidades de productos PCR

Productos de PCR fueron electrophoresed a 12% en gel de poliacrilamida, a causa de dificultades para obtener los productos PCR corto de parafina de los tejidos incrustados cuando se utiliza en gel de agarosa. Se utilizó Scion Image (Scion Corp, Frederick, MD) para determinar con precisión la densidad de banda. Para cada muestra, se determinó la survivin / GAPDH mRNA ratio.

El análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el SPSS 11.0J paquete de software para Windows (SPSS Inc, Chicago, IL). Las diferencias de expresión mRNA survivin con diversos clinicopathological parámetros fueron analizados utilizando ya sea el de Mann-Whitney U test o la prueba de Kruskal-Wallis. Tiempo de supervivencia se calculó como la fecha de la resección hasta la fecha del fallecimiento o la fecha del último seguimiento. Supervivencia Se diagramaron las curvas por el método de Kaplan-Meier; diferencias estadísticas se analizaron mediante el test log-rank. Un valor de probabilidad inferior a 0,05 se considera que indique una diferencia estadísticamente significativa.

III. Resultados

RT-PCR se realizó para determinar las expresiones de survivin mRNA en tejidos normales, el osteosarcoma línea celular NOS-1, y muestras clínicas de pacientes con osteosarcoma. Survivin expresión mRNA se detectó en todas las muestras de osteosarcoma pero ninguno de los tejidos normales. Se utilizó antes de la saturación de la fase del ciclo de amplificación de PCR para los números survivin y GAPDH. Esto hizo densitométricas evaluación y comparación de los niveles de mRNA entre muestras de tejido viable.

Survivin Expresión de mRNA en tejidos normales, NOS-1 y muestras clínicas

No survivin mRNA se detectó en un hueso normal, grasa o tejidos musculares, y survivin expresión mRNA se detectó en NOS-1 (Fig. 1]. Survivin mRNA fue detectable en todas las muestras de osteosarcoma, y los niveles de mRNA survivin fueron 0,83 ± 0,25 en las primeras muestras de biopsia (Fig. 2]. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Correlaciones entre metastásico, la supervivencia de 5 años y los niveles de mRNA expresión survivin

En los pacientes con metástasis, en comparación con aquellos sin metástasis, los niveles de mRNA survivin fueron mayores en los dos iniciales muestras de biopsia (Fig. 2]. Entre los pacientes que fallecieron dentro de los 5 años de ser diagnosticada con osteosarcoma, survivin los niveles de mRNA fueron también elevadas en ambos muestras de biopsia inicial. Sin embargo, no hubo relaciones estadísticamente significativas con otros parámetros clinicopathological (fase, el tipo histológico, edad, sexo y localización tumoral) (Tabla 3]. Además, la comparación de fase IIB y IIIB no se puede decir que es totalmente fiable, debido al pequeño número de pacientes que participan en IIIB.

Valor pronóstico de la expresión mRNA survivin

La supervivencia fue evaluada en 20 pacientes (excluidos los dos pacientes que murieron de otras enfermedades) de acuerdo a los niveles de mRNA expresión survivin obtenidos en su primera biopsia. La elevada expresión de un gen se define como el nivel por encima de la media, mientras que la baja expresión grupo incluye todos los casos con niveles por debajo de la mediana. La supervivencia de los pacientes con alto survivin expresión en la biopsia inicial fue significativamente más pobre que la de aquellos con baja expresión survivin, evaluadas por método de Kaplan-Meier (p <0,05) (Fig. 3].

IV. Discusión

El osteosarcoma es el más común primaria tumor maligno de hueso en los niños, niñas y adolescentes. Se trata de una neoplasia muy agresiva típicamente compuesto de células fusiformes que producen osteoids. El pronóstico para los pacientes con osteosarcoma ha sido generalmente muy pobres, y clínicamente se ha determinado postoperatorio de la respuesta a la quimioterapia y, en el pasado, por el tamaño del tumor. Estos han sido desde hace mucho tiempo los únicos factores pronósticos útiles para pacientes con osteosarcoma.

Recientemente, varios estudios han demostrado survivin expresión mRNA para ser detectados en diversos cánceres humanos, y que hay correlaciones entre los niveles de expresión de este gen y el pronóstico [12 - 17, 20, 21, 25, 27]. El único informe sobre survivin expresión utilizada en osteosarcoma inmunohistoquímica. Survivin expresión es también informó de un marcador pronóstico útil en el osteosarcoma, y pacientes que presentan un survivin expresión podría beneficiarse potencialmente de selección óptima de la quimioterapia neoadyuvante [25]. En este estudio, hemos demostrado, por primera vez, las expresiones del mRNA survivin en parafina de tumor de tejidos embebidos, obtenido por biopsia inicial, utilizando la competencia RT-PCR.

Por otra parte, survivin ha sido considerada como un nuevo miembro de la familia IAP. Survivin estructuralmente es única entre los mamíferos IAP's, que contiene un solo BIR y carecen de un carboxilo terminal dedo anular de dominio. Survivin ha demostrado inhibir la transformación de procaspase-3 y procaspase-7 y específicamente obligan a ambas activa caspasas in vitro [5, 24]. Sorprendentemente, la caspasa-3 desempeña un papel fundamental en la promoción de la señal de apoptosis [6].

Que últimamente se ha hecho posible aislar ARN de fijado en formol e parafina de los tejidos incrustados y para llevar a cabo RT-PCR utilizando este ARN [10, 22]. De hecho, varios informes han descrito análisis de genes usando ARN extraído de parafina embebido en los tejidos de retinoblastoma [22], Ewing's sarcoma [2, 18], pequeñas y redondas de células tumorales [7], sarcoma sinovial [26], Liposarcoma [ 11], rabdomiosarcoma [8] y el cáncer de colon [23]. Abrahamsen et al. [1] se describe el análisis cuantitativo de mRNA en archivados y tejidos de diagnóstico de rutina como sea posible para el melanoma.

Survivin Se analizaron los niveles de mRNA expresión utilizando la RT-PCR método. En cuanto a osteosarcoma, de alta expresión de mRNA survivin en muestras de biopsia inicial es especialmente común en los casos con metástasis. En las primeras muestras de biopsia de pacientes que fallecieron dentro de los 5 años, los niveles de expresión de este gen eran elevados. Por otra parte, los 5 años la tasa de supervivencia es mucho menor en la expresión más alta en el grupo bajo la expresión (Fig. 3]. Nuestros resultados no entren en conflicto con los de estudios anteriores [12 - 17, 20, 21, 25, 27]. A pesar de su pequeño tamaño, osteosarcoma en pacientes con alto survivin expresión mRNA puede ser de rápido crecimiento y metastasizing con mayor resistencia a los regímenes de quimioterapia.

Llegamos a la conclusión de que survivin niveles en muestras de biopsia inicial son útiles indicadores de pronóstico, que puede utilizarse no sólo para determinar si este gen se expresa o no, sino también el nivel de expresión, utilizando parafina embebido en los tejidos. Nuestros resultados plantean la posibilidad de realizar retrospectiva de perfiles moleculares, en el ARNm, de archivar los tejidos que emplean una técnica de diagnóstico de rutina.

Damos las gracias al Dr Christine A. Towle (Laboratorio de Ortopedia del Hospital General de Massachusetts) por su ayuda en la preparación del manuscrito, y los Dres. Tetsuo Hotta y Teiichi Motoyama (Yamagata University School of Medicine) para proporcionar la línea celular (NOS-1). Esta obra fue financiada en parte por el Proyecto Académico de la Frontera universidades privadas, se pongan en venta un fondo de subvención de MEXT (Ministerio de Educación, Cultura, Deportes Ciencia y Tecnología) 2002-2006.