Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(3): 89-94 (más artículos en esta revista)

Linfocitos ampliada ilíaca de los ganglios linfáticos como la fusión de Asociados para la producción de anticuerpos monoclonales después de una sola cola Base intento de Inmunización

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Yoshikazu Sado [1], Satoko Inoue [1], Yasuko Tomono [1], Hiroyuki Omori [1]
[1] Shigei Instituto de Investigaciones Médicas, 2117 Yamada, Okayama 701-0202, Japón

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Resumen

Un nuevo método de preparación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de ratón fue establecido, llamado "el ratón ilíaca los ganglios linfáticos método". Linfocitos iliacas ampliada de los ganglios linfáticos de ratones inyectados por vía intramuscular en la base de la cola con una emulsión de antígenos y adyuvante de Freund se utilizaron para la fusión de células. En su mayor parte, los ganglios linfáticos linfocitos de dos ratones fueron utilizados para un único intento de fusión de células. Ovoalbúmina se utilizó como antígeno y los resultados de la fusión se compararon con los resultados de un informe anterior (struct Cell. Funct. 20, 151-156, 1995). Alrededor de 100 pozos productores positivo de anticuerpos de interés fueron identificados mediante este método. En comparación, unos 10 pozos positivos se identificaron utilizando el ratón más convencional método de bazo después de tres inyecciones de inmunización. Las proporciones relativas de la producción de hibridomas IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, y IgG3, tras la fusión utilizando los ganglios linfáticos ilíaca linfocitos obtenidos 14 días después de la inyección fueron 14,0%, 78,7%, 3,2%, 3,5% y 0,5%, respectivamente. Este método ha demostrado las siguientes ventajas: (1) una única inyección del antígeno emulsión era suficiente, (2) los ganglios linfáticos estaban listos para su uso 14 días después de la inyección, y (3) un alto rendimiento de hibridomas positivos se obtuvo.

I. Introducción

Dado que los anticuerpos monoclonales producidos por primera vez en ratones hace 30 años [7], un ratón anticuerpos monoclonales han sido producidos usando linfocitos sensibilizados desde el ratón bazo. El uso del ratón los ganglios linfáticos linfocitos para la producción de anticuerpos monoclonales de ratón no ha sido ampliamente examinado [2, 3, 8], sin embargo pueden ser utilizados para la fusión de células. El único factor limitante hasta la fecha ha sido el pequeño número de ganglios linfáticos linfocitos capaces de ser obtenidos a partir de un ratón, que es insuficiente para la fusión de células [2, 9].

En 1995, se describe un novedoso método, conocido como la rata método de los ganglios linfáticos, en la que medial ilíaca los ganglios linfáticos de las ratas linfocitos inmunizados con un antígeno a través de la emulsión posterior footpads se utilizan como socios para la fusión de células fusión [5]. Esto produce aproximadamente 10 veces el número de anticuerpos específicos de producción de hibridomas que el método más convencional a través del ratón o rata linfocitos esplénicos [5]. Sin embargo, este método no puede ser utilizada en los ratones, ya que la inyección de un antígeno en la emulsión posterior footpads de ratones no resulta suficiente a la ampliación de los ganglios linfáticos de drenaje, tales como la poplítea, inguinal, ilíaca y los ganglios linfáticos, para permitir la fusión de células.

A través de ensayo y error, hemos descubierto que la inyección intramuscular de la base de la cola con un antígeno emulsión amplía ratón ilíaca los ganglios linfáticos de una manera muy eficaz, y que los ganglios linfáticos linfocitos de los ratones inmunizados dos son suficientes para un único intento de fusión de células. El ratón usando el método de linfocitos ganglios linfáticos agrandados demostrado características similares a la rata los ganglios linfáticos método [5], con las siguientes ventajas: (1) una inyección de antígeno emulsión era suficiente, (2) los ganglios linfáticos estaban listos para usar dos semanas después de la inyección, y (3) un alto rendimiento de hibridomas positivos se obtuvo.

II. Materiales y Métodos
Animal de inmunización

Pollo ovoalbúmina (Grado VII, Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y Freund completo del tratamiento adyuvante (Laboratorios Difco, Detroit, IL, EE.UU.) se utilizaron para hacer el antígeno emulsión. Freund completo del adyuvante (0,6 ml) y 1,5 mg / ml de solución de ovoalbúmina de pollo (0,3 ml) fueron emulsionar en dos de 1 ml Luer-lock jeringas de cristal con un doble bloqueo de aguja terminado el conector. Después de emulsificación se completó, una de las jeringas de vidrio que contiene la emulsión fue desconectado del conector de bloqueo y un 27G × 3 / 4 "aguja.

Ocho semanas de edad, las mujeres se utilizaron ratones. BALB / cAnNCrlCrlj ratones (BALB / c) se compraron de Charles River Laboratories Japón, Inc, Yokohama, mientras que los ratones C3H/HeNJcl (C3H/He), y cerrado colonia JCL: ratones ICR (ICR), se compraron de Clea Japón, Inc, Tokio. Los ratones fueron anestesiados y se inyecta por vía intramuscular a la derecha y la izquierda la cola con una base de emulsión (0,1 ml en total) que contienen 50 μ g de pollo ovoalbúmina y Freund completo del tratamiento adyuvante. Nueve ratones BALB / c fueron inoculados por vía subcutánea en la base de la cola con la misma cantidad de antígeno emulsión.

Los ratones fueron mantenidos en jaulas de plástico de policarbonato que contiene virutas de madera para la ropa de cama. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las Directrices para el Laboratorio de Experimentos con Animales de la Shigei Instituto de Investigaciones Médicas.

Fusión celular

Un ratón línea celular de mieloma, SP2/0-Ag14 [10], se utiliza para la fusión celular. Los ratones fueron sacrificados 11, 14, 21 y 28 días después de la inyección. Ilíaca los ganglios linfáticos se recogieron los ganglios linfáticos y los linfocitos de los ratones 2 se combinaron y se utiliza para cada intento de fusión de células. Número de células se determinó mediante un corpúsculo de sangre tras la cámara contando los ganglios linfáticos se aprobaron a través de una malla de 200 de acero inoxidable de malla de alambre. Fusión celular se realizó de acuerdo al método de Kishiro et al. [5], después de que las células fueron cultivadas en cuatro placas de 96 pocillos. En los días 9 y 10 después de la fusión de células, la cultura sobrenadante se recogió y ensayadas de fase sólida inmunoensayo enzimático (ELISA).

Los títulos de anticuerpos séricos y la detección de ensayo

Mouse suero se recogió en el sacrificio y los títulos de anticuerpos séricos contra la ovoalbúmina se determinó por ELISA usando las 2 veces el método de dilución [5].

Sobrenadante recogido de los 96-y la cultura placas se proyectó para la producción de anti-ovoalbúmina utilizando anticuerpos ELISA, según el método de Kishiro et al. [5]. Conejo anticuerpos frente a las inmunoglobulinas de ratón (Dako A / S, Glostrup, Dinamarca), y ovejas de anticuerpos IgM de ratón, IgG1, IgG2a, IgG2b, y IgG3 (nórdicos inmunológicos Laboratories, Tilburg, Holanda), se utilizaron como y conjugado con peroxidasa secundaria de anticuerpos. Positivo pozos se definieron como los pozos que mostraron una absorbancia de 0,3 unidades o superior.

El análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statview (Abacus Concepts, Berkeley, CA, EE.UU.) de Student's t-test. Valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

III. Resultados
Ampliada ratón ilíaca los ganglios linfáticos

Vía intramuscular base de la cola de inyección (Fig. 1], de una emulsión que contiene antígenos y adyuvante indujo hipertrofia de los ganglios linfáticos ilíaca en los ratones (Fig. 2 a). La ampliación de la derecha e izquierda ilíaca nodos por lo general se produjo, y una variedad de tamaños se observó. A menudo, dos ilíaca los ganglios linfáticos están presentes en ambos lados de la vena cava caudal, sin embargo, a veces, tres ganglios linfáticos estaban presentes. Eran en forma esférica y por lo general alrededor de 2 a 4 mm de ancho, 3 a 5 mm de largo, y que figuran en cualquier lugar de 1 × 10 7 a 2 × 10 7 células por ratón después de la vacunación (Fig. 2 b). El antígeno se inyecta emulsión siempre se encuentran en los músculos de la base de la cola, y suele encontrarse en el sacro y los ganglios linfáticos dentro de quistes en la cavidad peritoneal.

Para buscar y recopilar la ilíaca de los ganglios linfáticos emparejados por edad ratones normales fue más difícil que encontrar y recoger la ampliada ilíaca los ganglios linfáticos de ratones inmunizados, debido al pequeño tamaño de los nodos y por ser enterrados bajo la membrana retroperitoneal en el normal ratones. El ilíaca los ganglios linfáticos de los ratones normales son en forma esférica, por lo general alrededor de 1 mm de ancho, 1 a 2 mm de largo, y que figuran en cualquier lugar de 1 × 10 6 a 2 × 10 6 células por ratón (Fig. 2 c).

Nueve ratones inyectados con emulsión de antígenos por vía subcutánea en la base de la cola se sacrificaron 14 días después de la inyección para confirmar el lugar de la inyección. Los ganglios linfáticos inguinales se ampliaron a todos los ratones, sin embargo, la ilíaca los ganglios linfáticos se mantuvo en tamaño normal en 7 de los 9 ratones. En la 2 ratones con la ampliación de los ganglios linfáticos ilíaca, una parte de la emulsión estuvo presente en el músculo en el lugar de inyección.

Los títulos de anticuerpos séricos

Los títulos de anticuerpos en suero de ratones sacrificado 11, 14, 21 y 28 días después de la inyección se midieron (Tabla 1]. A pesar de las grandes variaciones individuales se observó que el valor medio a los 14 días se mantuvo baja, pero posteriormente aumentó rápidamente, alcanzando una meseta en torno a 21 días.

Cultura hibridoma de células

Después de la fusión de células, las células fueron cultivadas en cuatro de 96 placas y la cultura. Hibridoma colonias fueron confirmados 4 días después de la fusión celular. Hubo varios bien crecido colonias en cada pocillo. Pozos fueron positivos detectados por ELISA de la cultura sobrenadante al menos 9 días después de la fusión celular. La Figura 3 muestra un histograma de los resultados de ELISA para detectar el cribado positivo pozos tras la fusión de células utilizando ilíaca los ganglios linfáticos linfocitos de los ratones sacrificaron 14 días después de la inmunización con el antígeno emulsión.

Calendario de fusión

El número de pozos positivos se examinó utilizando linfocitos obtenido 11, 14, 21 y 28 días después de la inyección del antígeno emulsión. La fusión se realizó a través ilíaca los ganglios linfáticos linfocitos de dos ratones inyectados. Tres independientes de fusión experimentos se realizaron con los linfocitos de cada post-inyección período de tiempo examinado. Como se muestra en la Figura 4, un gran número de pozos positivos se obtuvieron utilizando linfocitos 14 y 21 días después de la inyección. Pozos positivos también estuvieron presentes utilizando linfocitos obtenidos a 11 y 28 días, pero a un tercio de la concentración observada utilizando linfocitos obtenidos a 14 y 21 días.

IgM y subclases de IgG

La producción de IgM y anticuerpos IgG fue identificado después de ganglio linfático del ratón fusión de linfocitos (Cuadro 2].

IgG1 fue el principal subclase observó linfocitos obtenidos utilizando 11, 14, 21 y 28 días después de la inyección. Esto fue seguido por IgM, que se encuentra en aproximadamente el 14% de positivos los pozos a los 14 días, tras lo cual disminuyó los niveles con el tiempo, estando presente en sólo el 3,4% de positivos los pozos 28 días después de la fusión (Tabla 2]. En contraste con las tendencias demuestra IgM e IgG1, las proporciones relativas de IgG2a y IgG2b varía de un experimento de fusión a otro. Sólo el 4,0% al 6,7% de positivos estos pozos producidos subclases. Sólo dos pozos que producen anticuerpos subclase IgG3 fueron observados en un total de 12 experimentos de fusión en el presente estudio.

Ilíaca los ganglios linfáticos de C3H/He y ratones ICR

Además de ratones BALB / c, C3H/He ICR y ratones fueron inyectados con el antígeno emulsión. Como era de esperar, los ganglios linfáticos ilíaca de estas cepas de ratones ampliada tras la inyección del antígeno, aunque más variación en tamaño de los ganglios linfáticos de la derecha y la izquierda se observó que en los ratones BALB / c.

Dos intentos de fusión celular se hicieron para cada cepa utilizando ilíaca los ganglios linfáticos linfocitos obtenidos 16 días después de la inmunización. Cuarenta y cuatro positivas y 111 pozos se encontraron en ratones C3H/He, y 92 y 103 en ratones ICR, en cada intento. Por lo tanto, este método puede ser utilizado para otras cepas, además de ratones BALB / c.

IV. Discusión

El número de pozos positivos obtenidos con el método actual era de 75 a 130 por intento de fusión de células cuando los ganglios linfáticos linfocitos se utilizaron 14 a 21 días después de la inyección. Estos números son mucho más elevados que los obtenidos en un estudio anterior [5] con el ratón método bazo, lo que generó 9 a 11 pozos positivos por intento de fusión de células. Además, el ratón bazo método requiere de tres inmunizaciones durante un período de cuatro semanas de vacunación. Estos resultados indican claramente que el uso ampliado de los ganglios linfáticos ilíaca linfocitos de los ratones inyectados por vía intramuscular con un antígeno a través de emulsión base de la cola es un excelente método por el cual la preparación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de ratón. Hemos llamado a este método, los "mouse ilíaca los ganglios linfáticos método" o más simplemente, el "ratón de ganglios linfáticos método". Tiene varias ventajas. En concreto, sólo una inyección del antígeno que se requiere y los ganglios linfáticos puede ser utilizado de aproximadamente dos semanas después de la inyección. Los ganglios linfáticos linfocitos de dos ratones son suficientes para un único intento de fusión, así como un alto rendimiento positivo de los pozos se obtiene. Este método ahorra tiempo, esfuerzo, antígeno requisitos, costo, y tiene una mejor oportunidad de éxito.

Ha sido 30 años desde que el primer informe de Köhler y Milstein de anticuerpos monoclonales apareció en la revista Nature [7]. Sin embargo, el presente estudio es el primero en describir la producción de anticuerpos monoclonales de ratón utilizando un ganglio linfático ilíaco método. La principal razón de este retraso ha sido el pequeño tamaño de los ganglios linfáticos de ratón, que requiere 5 o más ratones a ser inyectado para la inmunización de una única célula de fusión [2, 8, 9]. Otra razón es que los altos títulos de anticuerpos en el suero se han pensado para indicar las posibilidades de éxito de la fusión de células, y altos títulos se logran con el ratón el bazo método. Esto generalmente requiere de dos o tres inyecciones de refuerzo, que requiera al menos cuatro semanas desde el momento inicial de la inyección. Este largo período de inmunización podría de hecho reducir el número de pozos positivos obtenidos y hacen que sea difícil lograr el éxito de la presente ratón método de los ganglios linfáticos.

Una etapa de diferenciación de células B se piensa que es más adecuado para la fusión de células para producir anticuerpos de secretar hibridomas [1, 4, 12]. En el bazo de ratón convencional método [12], la última inyección de refuerzo se suele hacer por vía intravenosa con solución salina antígeno en 3 o 4 días antes de la fusión de células para inducir la esplénica linfocitos en un momento oportuno para la fusión de células [12]. Usando el ratón presente ilíaca método de los ganglios linfáticos, el mayor número de pozos positivos se observó el uso de linfocitos obtenido 14 a 21 días después de la inyección, y la disminución de los números se observaron utilizando linfocitos obtenidos 28 días después de la inyección. Desde la ilíaca ganglios linfáticos son similares en tamaño 14 y 28 días después de la inyección, y desde números similares de hibridomas fueron observados en cada pocillo de un intento de fusión a la próxima, la disminución observada a los 28 días de la proporción de positivos los pozos pueden haber sido debido a un cambio de células B en un escenario inadecuado.

Hibridomas producidos utilizando el ratón los ganglios linfáticos método principalmente IgG1 producido anticuerpos (aproximadamente el 80% del total de la producción de anticuerpos), pero IgM, IgG2a y IgG2b anticuerpos También se obtuvieron. IgM fue fácil de obtener cuando los ganglios linfáticos del ratón se utilizaron dos semanas después de la inyección. Individual ratón se observaron diferencias con respecto a la producción de IgG2a y IgG2b, sin embargo, estas subclases se obtuvieron después de varios intentos de fusión celular.

Mirza et al. [8] reportaron en 1987 que la inmunización de la inyección del antígeno en la posterior footpads de ratones con posterior fusión de linfocitos poplítea y de los ganglios linfáticos inguinales produjeron más anticuerpos hibridomas secretores de que cualquiera de los dos inmunización intradérmica y los ganglios linfáticos o la fusión de linfocitos convencionales subcutánea de inmunización intraperitoneal con inyecciones de refuerzo seguida por la fusión de linfocitos esplénicos. Sin embargo, este método sigue siendo impopular desde los ganglios linfáticos linfocitos de cinco ratones son necesarios para un único intento de fusión. Por otra parte, los ganglios linfáticos la ampliación es menos exitosa que con el método actual. Tratamos de inmunizar a ratones de la misma manera que Mirza et al. [8], pero considera imposible inyectar 50 μ l de antígeno en una emulsión footpad sin fugas. En la mayoría, fuimos capaces de inyectar 15 μ l de la emulsión. De nota, el lugar de la inyección se hizo menos evidente varios días después de la inyección (datos no publicados). Por el contrario, intramuscular cola base de inyección de 50 μ l de emulsión fue fácil, y la emulsión se inyecta todavía evidente en el espacio intramuscular 28 días después de la inyección.

Davis et al [3]. Anticuerpos monoclonales producidos a raíz de un único intento de fusión usando una mezcla de linfocitos de inguinal ilíaca y los ganglios linfáticos de 10 ratones. A pesar de que utiliza los ganglios linfáticos ilíaca linfocitos como la fuente de linfocitos B por primera vez, su método es claramente diferente de la actual ganglio linfático del ratón método. Que los ratones inyectados por vía subcutánea, no por vía intramuscular, a base de la cola cuatro veces en dos semanas, y se utiliza tanto inguinal ilíaca y los ganglios linfáticos. A juzgar por los resultados de la inyección subcutánea en el presente estudio, la inyección subcutánea en la base de la cola de un ratón induce hipertrofia de los ganglios linfáticos inguinales, aunque la ampliación de ambas inguinal ilíaca y los ganglios linfáticos se produce de vez en cuando. El principal objetivo de los ganglios linfáticos en la Davis et al. Estudio se cree que la inguinal ganglios linfáticos. Establecieron 43 clones de anticuerpos, sin embargo, estos resultados fueron similares a los obtenidos después de tres intentos de fusión utilizando los linfocitos esplénicos de ratones tras la administración de un programa de similares intraperitoneal inyecciones [3]. Como tal, no se sienten existe alguna gran ventaja de utilizar los ganglios linfáticos linfocitos como la fuente de los linfocitos B.

El efecto de las inyecciones de refuerzo no fue examinada en el presente estudio, debido a las inyecciones de refuerzo dado tres o cuatro días antes de su sacrificio no haya influido en el número de pozos positivos obtenidos mediante la rata los ganglios linfáticos método en un estudio anterior [5]. Normalmente, las inyecciones de refuerzo se da al menos una semana después de la primera inmunización, lo que alargaría el período de inmunización necesarios para este experimento y aumentar la cantidad de antígeno necesario. El antígeno guardado podría ser utilizado para inmunizar a más ratones.

Hemos informado anteriormente sobre una rata método de los ganglios linfáticos [5]. Este método utiliza linfocitos obtenidos a partir de medial ampliada ilíaca los ganglios linfáticos siguientes posterior footpad de células de inmunización para la fusión. Vía intramuscular cola base de inyección de los antígenos en las ratas de obtener linfocitos para la fusión de células también fue examinado en el presente estudio, y la cola base de inyección se observó para la producción ampliada rata medial ilíaca los ganglios linfáticos, de que los linfocitos de células para la fusión y se obtuvieron una serie de hibridomas detectados por ELISA (datos no publicados). Por lo tanto, el presente estudio es el primer informe que indica que la ilíaca los ganglios linfáticos método también es útil en ratas. La base de la cola es un sitio más humano para la inmunización de la posterior footpads. De este modo, los investigadores deben usar la cola de base para la inmunización cuando se usa la rata los ganglios linfáticos método para lograr la producción de anticuerpos monoclonales utilizando linfocitos de medial ampliada ilíaca los ganglios linfáticos.

Dada la immunotolerance de ratas ratas a diferentes antígenos, anticuerpos monoclonales de ratón tienen un importante papel en la investigación. Conejo anticuerpos monoclonales están disponibles comercialmente de Knight el grupo [11]; sin embargo, una serie de investigadores están interesados en producir sus propios anticuerpos monoclonales de roedores. Aunque estos datos no ha sido publicado, hemos sido capaces de producir anticuerpos contra el antígeno de una rata con el ratón los ganglios linfáticos método. Hemos producido más de 30 clones de anticuerpos contra la rata renal membrana basal de colágeno, también conocido como el colágeno tipo IV [6]. Para ello se utilizó una fracción soluble purificado de rata solubilized renal membrana basal como el antígeno [6]. Hemos creado unos 10 clones de cada una de IgG1, IgG2a, y IgG2b, todas las cuales fueron fuertemente reactiva con nativos rata renal membrana basal, como se ha demostrado por inmunofluorescencia indirecta. Esto obligó a cuatro intentos de fusión de células, ya que sólo aproximadamente el 10% de los pozos que figuran positivo IgG2a y IgG2b de anticuerpos, mientras que el resto figura IgG1. Esto indica claramente que el ganglio linfático del ratón método es una técnica fiable.

Nos gustaría dar las gracias al Dr Fumihiro Shigei, Presidente de la Junta, para el apoyo financiero, y el doctor Masafumi Taki, Director de la Shigei de Investigación Médica del Hospital, así como Dr Yoshifumi Ninomiya, profesor de Okayama University Medical School, por su consejos útiles. También queremos dar las gracias a Sra Chieko Takahashi para solicitar ayuda con la cría de animales.