Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

Expresión de Streptomyces lividans de la rata α integrina CD11b A-dominio como solubles secretadas y la proteína recombinante

Hindawi Publishing Corporation
Dorra Zouari Ayadi [1], Hichem Chouayekh [1], Sonda Mhiri [1], Khaled Zerria [2], M. Fathallah Dahmani [2], Samir Bejar [1]

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Resumen

Ya hemos informado de la utilización de una larga señal péptido sintético (LSSP) de secretar el Streptomyces sp. TO1 amilasa por Streptomyces lividans cepa. Estamos en este informe la expresión y secreción de la rata CD11b A-dominio utilizando el mismo LSSP y S. lividans como anfitrión cepa. Hemos utilizado la Escherichia coli / Streptomyces pIJ699 vector lanzadera para la clonación de la A-secuencia de ADN de dominio después del proceso de LSSP y bajo el control de la constituyente erm E-up promotor de Streptomyces erythraeus. El uso de este construir y S. lividans como una cepa de acogida, hemos logrado la expresión de 8 mg / L solubles secretadas de forma recombinante de la A-dominio de la rata de leucocitos β 2 integrina CD11/CD18 M subunidad alfa (CD11b). Este secretada recombinante CD11b A-dominio reaccionó con una función de bloqueo de anticuerpos que demuestran que esta proteína está debidamente plegado y probablemente funcional. Estos datos apoyan la capacidad de Streptomyces para producir proteínas recombinantes heterólogas como solubles secretadas utilizando el formulario "LSSP" señal péptido sintético.

1. INTRODUCCIÓN

Streptomyces especies son saprofitas gram-positivos bacterias del suelo que posee una gran variedad de enzimas hidrolíticas extracelulares, tales como α-amylases, agarases, celulasas, xilanasas, nucleasas, lipasas y [1]. El potencial de S. lividans, en su calidad de anfitrión para la expresión heteróloga de bacterias recombinantes y proteínas eucarióticas, ha sido ampliamente investigado [2]. De hecho, este microorganismo tiene varias características que lo convierten en un host adecuado para una eficiente expresión de proteínas recombinantes entre los que se encuentran los bien establecidos los procedimientos de manipulación genética [3] y la ausencia de una amplia modificación de los sistemas de restricción que son por lo general presentes en otras especies de Streptomyces. Por otra parte, S. lividans tiene muy baja endógeno actividad proteolítica extracelular cuando se compara con otras especies Streptomyces [4] y no obtener la formación del cuerpo de inclusión de proteínas recombinantes en el citoplasma, un problema detectado en la mayoría de los sistemas de expresión utilizada para eucariotas y las proteínas en procariótico E. coli. De hecho, la sobreproducción de algunas proteínas en E. coli llevado a su incorporación a los órganos inclusiones insoluble. Si bien es posible solubilize los órganos creados en virtud de inclusiones, no hay garantía de que intentó renaturation dará lugar a nivel significativo de la proteína activa. El alto nivel de solubilidad es una característica general de proteínas realizados en Streptomyces [3]. Por estas diversas razones, S. lividans es el anfitrión de elección para la producción secretora de proteínas heterólogas y una muy atractiva plataforma de la biotecnología.

En los dos últimos decenios, un número creciente de estudios han demostrado que S. lividans es un modelo de acogida para la producción de secretada proteínas recombinantes heterólogas [5 - 12]. En la mayoría de los casos, los genes de interés se fusionaron para bien caracterizado péptido señal de secuencias de forma natural muy proteínas secretadas por Streptomyces [11, 13, 14]. Por otra parte, señal de péptidos sintéticos se utilizaron como los 35 aminoácidos largo señal péptido sintético (LSSP) que hemos utilizado con éxito anteriormente para la secreción de la Streptomyces sp. TO1 amilasa [10], que es una proteína secretada naturalmente. Este péptido señal se deduce de la alineación de varios Streptomyces señal péptidos y llevó un nuevo ribosoma sitio de unión, así como un segundo codón de iniciación. La adición de un segundo ribosoma sitio de unión y un segundo aumento de iniciación codón el rendimiento de la proteína secretada en función de Pagé et al. [15].

Varios Streptomyces la secreción de sistemas se han desarrollado con éxito para la producción de proteínas eucarióticas en especial los de interés médico [9]. Por ejemplo, podemos mencionar la producción eficiente en S. lividans de la murino factor de necrosis tumoral (TNF) alfa fundido a la péptido señal secretora de la subtilisina inhibidor de la proteína S venezuelae [8, 16]. Expresión de biológicamente activos humanos interferón alfa-2 también fue logrado en S. lividans [17].

Las integrinas β 2 (CD11/CD18) son glicoproteínas de superficie heterodimeric y representan una de las más importantes familias de los leucocitos moléculas de adhesión. Esta familia está compuesta por 4 complejos glicoproteína cada uno de ellos consiste en una α y β heterodimer que contiene dos cadenas: la alfa (CD11a, CD11b, CD11c, y CD11d) y la beta (CD18) subunidades. Ellos tienen una amplia función vital en el desarrollo, embriogénesis, la organización tisular, la cicatrización de heridas y de la respuesta inmune [18]. El β 2 integrinas reconocen múltiples ligandos y mediar en varios importante sustrato celular de células y células adhesivo interacciones. Encuadernación de integrinas a sus ligandos fisiológicos es una dinámica, de cationes divalentes-dependiente, y estrictamente regulados. Las subunidades α mostrar un dominio A-amina en sus terminales que medie funciones proinflamatorias [19]. Se trata principalmente de la interacción con adhesivo las células endoteliales vasculares que conducen a la transmigración de leucocitos y diapedesis [20]. La A-dominio de la subunidad α M (CD11b) de la rata de leucocitos β 2 integrina CD11/CD18, que se utilizó para este trabajo, ya estaba clonado y expresado en E. coli en el compartimiento intracelular como soluble recombinante de proteína de fusión con GST. Recombinante CD11b A-dominio fue liberado de la proteína de fusión de la trombina corte. Este dominio recombinante conserva su función adhesiva como se muestra por su carácter vinculante in vitro con los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas [20]. Además, se utiliza para demostrar que es capaz de proteger a la del músculo esquelético de lesiones inflamatorias in vivo en ratas utilizando un modelo de síndrome de aplastamiento [21]. En este trabajo, nos informe por primera vez la expresión heteróloga y eficiente de la secreción, por S. lividans, de la rata soluble recombinante CD11b A-dominio; utilizando el constitutiva erm E-up promotor (P erm E) de Streptomyces erythraeus [22] y la señal de largo péptido sintético (LSSP) [10].

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2,1. Cepas bacterianas y los medios de comunicación

S. lividans 1326 fue utilizado como una célula huésped para la transformación. Protoplastos preparación y transformación de los procedimientos se realizaron según lo descrito por Hopwood et al. [23]. El R2YE se utilizó para la regeneración y Protoplastos thiostrepton (el antibiótico de selección llevado marcador de la E. coli / Streptomyces lanzadera pIJ699 vector [24]] se añadió a 50 μ g / ml para la selección de transformarse S. lividans células. Para el crecimiento de S. lividans acogida pMS115, thiostrepton se añadió a una concentración de 15 μ g / mL en medio líquido o en 20 μ g / mL en medio sólido y las culturas se cultiven en NMMP TSB o medios de comunicación [23] a 30 ° C durante 48 h con agitación .

Cepas de E. coli TOP10 fueron utilizados para la clonación de PCR en productos PCR-Blunt vector (Invitrogen) y DH5 α cepa de acogida como para la propagación plásmido. Las culturas se cultivaron a 37 ° C en Luria-Bertani medio en presencia de ampicilina (50 μ g / mL) cuando sea necesario.

2,2. Plásmidos y los procedimientos de clonación

El 276 bp Sac I-Bam HI fragmento de pIJ4070 abrigo a los constitutiva erm E-up promotor [22], fue subcloned en la pMS39 plásmido [10] llevando la señal a largo péptido sintético (LSSP), dando la pMS41 plásmido. A continuación, los 410 bp KPN I-Hin CII fragmento (P erm E-up-LSSP) de pMS41 fue clonado en el I-KPN Hin CII sitios de pIJ4070 dando la pMS51 plásmido (P erm E-up-LSSP).

La secuencia de codificación de la A-dominio de la rata de leucocitos β 2 integrina CR3 alphaM subunidad (CD11b) fue amplificado por PCR usando los siguientes dos primers: S43 5'-CTC GATATC TGTCCTCAGCAGGAGAGCAAC-3 'una acogida Eco RV sitio y S44 5' - CT CTGCAG CGTCAGTCAGTCACGAT-3 'una acogida Pst I sitio y como la plantilla pGEX-2T plásmido que contenía el CD11b A-dominio fundido a la glutation S-transferasa (GST) [20]. (Condiciones de PCR fueron 5 min a 94 ° C seguido de 35 ciclos de 30 s a 94 ° C, 45 s a 68 ° C, y 35 s a 72 ° C. La amplificación se llevó a cabo utilizando la Pfu ADN polimerasa de Stratagene). El 622 bp PCR fragmento correspondiente a la A-secuencia de codificación de dominio fue clonado en el PCR-Blunt vector para producir la pMS52 plásmido. A continuación, los 610 bp Eco RV-Pst I fragmento de pMS52 fue clonado en el Eco RV-Pst I de sitios pMS51 dar la pMS62 plásmido. Por último, el bp 1030 BGL II fragmento de pMS62 llevar el cassette "P erm E-up-LSSP-A-dominio" ligated fue a la corte pIJ699 vector de BGL II [24]. Después de transformación de la S. Protoplastos lividans 1326, la cepa recombinante que lleva el plásmido resultante pMS115 fue llamado S. lividans 1326/pMS115.

2,3. De aislamiento del ADN y la manipulación

Plásmido de ADN preparación y manipulación de la S. lividans 1326/pMS115 cepa se llevaron a cabo de acuerdo a Hopwood et al. [23] y de E. coli, tal como se describe en Sambrook et al. [25].

2,4. ARN aislamiento y RT-PCR

El S. lividans 1326/pMS115 cepa fue precultured a 30 ° C en medio TSB [23] entonces inocularon a 1 / 10 en las mismas condiciones. Culturas fueron detenidos al final de la fase exponencial (36 h), a principios fase estacionaria (50 h), y fines de fase estacionaria (60 h). Luego, las células fueron cosechadas por centrifugación (7500 xg, durante 15 min a 4 ° C). RNAs fueron elaborados a partir de estas culturas, tal como se describe por Hopwood et al. [23], salvo que una DNasa I (Promega) el tratamiento se utilizó, además de la sal de precipitación. Este ARN preparación se utilizó en RT-PCR experimentos. cDNA correspondiente a la A-dominio fue sintetizada a partir de la aislados RNAs (tratamiento con DNasa), utilizando la transcriptasa inversa AMV (AMV-RT) de Amersham como sigue: 2 μ l de ARN (2 μ g), 2,5 μ l de primer S259 de 10 μ m, y 9 μ l H 2 O - RNasa libre. Las reacciones se incubaron en un termociclador a 65 ° C durante 5 min colocado entonces en el hielo y los componentes siguientes se han añadido en cada una de las muestras: 4 μ l de AMV-RT buffer 5x, 1 μ l de AMV-RT (1 U / μ l ), 1 μ l de RNasin (Amersham), y 0,5 μ l de dNTP 10 mM cada uno. Las reacciones fueron incubadas a 42 ° C durante 90 min y luego a 70 ° C durante 15 min.

10% del cDNA sintetizado (2 μ l) fue amplificado por PCR usando primers interior-S258 adelante, 5'-CAGGAGAGCAACATTGCCTTC-3 ', y revertir-S259, 5'-GTGATCACCAGCTGGCTTAGA-3'. Como control, se han llevado a cabo una reacción de PCR utilizando como matriz de 1 μ g de ARN tratados con DNasa. El ciclismo parámetros fueron de 94 ° C durante 5 min, seguido por 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 52 ° C durante 45 s, y 72 ° C durante 30 s. En todos los casos, 10 μ l de 50 μ l de las reacciones de PCR fueron analizados en un 1,2% en gel de agarosa.

2,5. Western blot

S. lividans 1326/pMS115 cepa fue precultured en medio TSB entonces inocularon a 1 / 10 en NMMP medio [23] con el de 1% (W / V) de la glucosa y crecido durante 48 horas a 30 ° C. Después de cultura centrifugación (7500 xg, durante 15 min a 4 ° C), el sobrenadante fue liofilizado, resuspendido en una mínima cantidad de tampón fosfato salino (PBS) a pH 7,4, y luego dializados durante 24 h a 4 ° C contra el mismo buffer .

El contenido de proteína se determinó utilizando el método de Bradford con albúmina sérica como el estándar.

15 μ g de proteínas secretadas se cargaron y resueltas en un 15% SDS desnaturalización gel de poliacrilamida en un plazo Tris glicina electroforesis de amortiguación, tal como se describe por Laemmli [26].

El GST/CD11b A-proteína de fusión de dominio y el dominio A-liberado de la proteína de fusión de la trombina corte se utilizaron como controles [20]. El gel se transfirió a un immunobilon-P membrana. Inespecíficos unión de los anticuerpos fue impedida por la membrana remojo en PBS de amortiguación entre los 20 que contiene 5% de leche descremada en polvo durante una hora a 37 ° C. La membrana se incuba durante la noche a 4 ° C con la función de bloqueo de anticuerpos monoclonales anti-rata CD11b (clon OX42) adquiridos de Pharmingen y diluido a 1 / 1000 en TBS que contengan 1% leche descremada en polvo. Inmunorreactiva bandas se pusieron de manifiesto utilizando peroxidasa conjugada anti-rata anticuerpos IgG.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3,1. El MC E-up promotor impulsa una acción eficaz expresión de la integrina α rata CD11b A-dominio en S. lividans

Para investigar el potencial de S. lividans 1326 para expresar la integrina α-Un dominio como una proteína secretada recombinante, la A-dominio de la rata de leucocitos integrina β 2 M subunidad α (CD11b), la secuencia de codificación fue amplificado por PCR y fundido a la larga señal péptido sintético (LSSP) [10] de la pMS51 plásmido albergar el MTC E-promotor, tal como se describe en "Materiales y Métodos" (Figura 1]. Por último, el cassette "P erm E-up-LSSP-A-dominio" se introdujo en S. lividans 1326 utilizando el E. coli / S. lividans lanzadera pIJ699 vector [24] dando la pMS115 plásmido (Figura 1].

Para demostrar el éxito de expresión de la A-dominio en S. lividans 1326/pMS115, RT-PCR se llevó a cabo con ARN preparado a partir de esta cepa en diferentes fases de crecimiento (fines de la fase exponencial (36 h), a principios fase estacionaria (50 h), y fines de fase estacionaria (60 h)) y tratados con DNasa. Como se muestra en la Figura 2, se espera un fragmento de 495 pb interno de la A-dominio fue amplificado con eficacia y presentados a lo largo toda la etapa de crecimiento a prueba con la misma intensidad. Esta observación confirma la constitutivity del MC-up promotor que regula la expresión de la A-dominio. Esta amplificación de los resultados obtenidos a partir de cDNA A-dominio mensajeros de amplificación, ya que no se observó reacción de PCR cuando se realizó directamente con DNasa tratada con RNA. Este resultado confirma la expresión de S. lividans 1326/pMS115 de la rata M subunidad α (CD11b) Una secuencia de dominio bajo el control de la constituyente erm E-up promotor de Streptomyces erythraeus [22]. De hecho, esta fuerte promotor constituyente y fue ampliamente utilizado para la expresión de genes en diferentes especies de Streptomyces [10, 27 - 31].

3,2. El LSSP péptido señal permite la producción de la A-CD11 como un dominio extracelular de la proteína S. lividans

El S. lividans 1326/pMS115 se cultivó durante 48 horas en NMMP medio con glucosa como la fuente de carbono. A continuación, el sobrenadante fue liofilizado cultura, dializados contra buffer PBS y electrophorized en un gel de poliacrilamida SDS. Como se muestra en la Figura 3, el tamaño de la A-recombinante de dominio (21 kDa), expresado por S. lividans era el mismo de su homóloga expresada en E. coli como GST / A-dominio proteína de fusión (48,5 kDa) y puesto en libertad por la trombina corte [20]. Dado que se sabe que E. coli no es capaz de glycosylate el polipéptido, y teniendo en cuenta el hecho de que el tamaño de la proteína recombinante expresada en cada sistema es similar, podemos concluir que S. lividans no glysosylate la A-dominio, aunque la secuencia de la rata CD11b muestra un putativo N glicosilación sitio.

Por otra parte, el rendimiento de la rata recombinante CD11b A-dominio secretada por S. lividans se estimó en 8 mg por litro. Este rendimiento se basa en la comparación de la intensidad de banda tal y como se muestra en la Figura 3 y tiene en cuenta la concentración de 50x el sobrenadante antes de la carga de electroforesis en gel. Se estima que un dominio representa el 8% del total de proteínas extracelulares (100 mg / L). Este relativamente bajo nivel de proteínas extracelulares podría explicarse por el uso de un medio mínimo (NMMP) útil para el análisis ulterior. Western blot del sobrenadante de la S. lividans cultura de manifiesto (Figura 3] una proteína con una banda de masa molecular de aproximadamente 21 kDa correspondiente a la rata secretada CD11b A-dominio expresado en S. lividans. Encuadernación de la función de bloqueo de anticuerpos implica que este secretada forma recombinante está bien doblada y sugiere firmemente que la proteína sería funcional como anteriormente se muestra con su homólogo producido en E. coli.

Como se describe de Mhiri et al. [10], la señal de largo péptido sintético (LSSP) contiene dos cargas positivas en la N-terminal de la región y lleva dos sitios de unión ribosoma (RBS), así como dos traslacional inicio codones que se sabe que contribuyen a incrementar el rendimiento de la secretada proteínas [15, 32]. Este péptido señal se utilizó con éxito para la secreción de la Streptomyces sp. TO1 amilasa [10]. La secreción eficiente en el S. lividans 1326/pMS115 cultura sobrenadante de la A-dominio de la rata de leucocitos M subunidad α (CD11b) con el LSSP péptido señal a favor de ampliar el uso de este péptido señal para la secreción de procariótico eucariotas y las proteínas de interés en S. lividans. La capacidad de producir la A-CD11 como un dominio extracelular de proteínas es de gran interés para la realización de más estructura-función de estudios, así como para las solicitudes de este dominio recombinante como potencial agente antiinflamatorio.

Esta investigación fue apoyada por el Gobierno de Túnez "Contrato Programa CBS-LEMP".