PLoS ONE, 2007; 2(2): (más artículos en esta revista)

B-RAF y N-ras mutaciones se conservan durante el corto período de tiempo la propagación in vitro y diferencialmente impacto pronóstico

Biblioteca Pública de la Ciencia
Selma Ugurel [1], Ranjit K. Thirumaran [2], Sandra Bloethner [2], Andreas Gast [2], Antje Sucker [1], Jan Müller-Berghaus [1], Werner Rittgen [3], Kari Hemminki [2 ], Jürgen C. Becker [5], Rajiv Kumar [2], Dirk Schadendorf [1]
[1] Unidad de Cáncer de la piel, alemán Centro de Investigación del Cáncer de Heidelberg y el Departamento de Dermatología, Centro Médico de la Universidad de Mannheim, Mannheim, Alemania
[2] División de Epidemiología genética molecular, alemán Centro de Investigación del Cáncer, de Heidelberg, Alemania
[3] Unidad Central de Bioestadística, alemán Cancer Research Center, Heidelberg, Alemania
[4] Departamento de Biociencias, Karolinska Institute, Huddinge, Suecia
[5] Departamento de Dermatología de la Universidad de Wuerzburg, Alemania
Resumen

En el melanoma, el RAS / RAF / MEK / ERK vía de señalización es un área de gran interés, ya que regula la proliferación celular tumoral y la supervivencia. Un diverso tipo de mutación se ha informado de B-RAF y N-RAS, que ha sido en gran parte al diferencial de tumor fuente de ADN analizadas, por ejemplo, fijo o tejidos tumorales in vitro propagadas por las células del melanoma. En particular, esta variación también interfiere con la interpretación de los efectos de estas mutaciones en el curso clínico de la enfermedad. En consecuencia, se determinó el perfil mutacional de B-RAF y N-RAS en las biopsias y las correspondientes líneas de células de tumor metastásico lesiones de 109 pacientes con melanoma (AJCC estadio III / IV), y sus respectivos efectos sobre la supervivencia. 97 biopsias y 105 biopsia de células derivadas de líneas se examinaban para ver si B-RAF y N-RAS mutaciones por PCR capítulo único polimorfismo de conformación y secuenciación del ADN. Las mutaciones fueron correlacionados con la supervivencia de los pacientes los datos obtenidos en un período de seguimiento medio de 31 meses. B-RAF mutaciones se detectaron en 55% los tejidos y el 51% las líneas celulares, N-RAS mutaciones en un 23% los tejidos y el 25% las líneas celulares, respectivamente. Hubo una fuerte concordancia entre el estado mutacional de los tejidos y las correspondientes líneas celulares, con un diferente estado de B-RAF en sólo el 5% y el N-RAS en sólo el 6%, respectivamente. Los pacientes con tumores llevar mutado B-RAF mostró una alteración en la supervivencia media (8,0 frente a 11,8 meses, p = 0,055, tejidos; 7,1 frente a 9,3 meses, p = 0,068, líneas celulares), mientras que los pacientes con N-RAS-mutado presentan tumores con un pronóstico favorable (mediana de supervivencia de 12,5 versus 7,9 meses, p = 0,084, tejidos, 15,4 versus 6,8 meses, p = 0.0008, líneas celulares), cada uno en comparación con wildtype gen. El análisis multivariado cualificada N-RAS (p = 0,006) pero no B-RAF mutación como un factor pronóstico independiente de supervivencia global. Nuestros hallazgos demuestran que el B-RAF y N-RAS mutaciones están bien conservados en corto plazo la propagación in vitro y, sobre todo, diferente impacto de los resultados de los pacientes con melanoma.

Introducción

Melanoma maligno se asocia con la heterogeneidad genética y una compleja etiología. En contraste con otros cánceres de piel, el melanoma afecta a una población más joven y tiene una fuerte tendencia a la metástasis, con una consecuencia extremadamente pobre supervivencia global. En la mayoría de los melanomas, el RAS / RAF / MEK / ERK vía de señalización es constitutivamente activado ya sea debido a mutaciones oncogénicas en B-RAF y N-RAS genes o autocrina a través de la estimulación del factor de crecimiento [1]. RAS proteínas de membrana están sujetos a pequeñas proteínas G, mientras que RAF, MEK y ERK son proteínas quinasas citosólicas que forman una proteína quinasa niveles cascada abajo de RAS. De señalización se inicia, cuando se activa RAS reclutas RAF a la membrana plasmática para la activación a través de un proceso complejo que requiere de lípidos y proteínas, cambios conformacionales, y reglamentación de fosforilación y dephosphorylation eventos. Hay tres RAF proteínas en los mamíferos, A-RAF, RAF-B, y C-RAF, que puede activar todos los MEK, pero es evidente que desempeñar distintas funciones en vivo como lo demuestra la diferencias fenotípicas entre A-RAF, B-RAF, y C-MAR knock-out ratones.

Desde hace tiempo se sabe que la activación de N-RAS codón 61 mutaciones ocurren en hasta un 30% de todos los casos el melanoma cutáneo. En 2002, Davies et al. informó de que B-RAF mutaciones se producen con una alta frecuencia en el melanoma, se encontraron mutaciones en 20 de 34 líneas celulares de melanoma (59%), 12, de 15 a corto plazo culturas (80%), y seis de nueve tumores del melanoma (67% ) [2]. Las mutaciones en la B-RAF genes están localizados principalmente en la activación del dominio kinasa con la mayor participación de la sustitución de valina por ácidos o básicos residuos en el codón 600 [2], [3]. Esta mutación se traduce en una fuerte activación de B-RAF, constitutivamente estimular la MEK-ERK vía de señalización. En cambio, A-RAF y C-MAR no se han encontrado para ser mutado, porque su regulación es fundamentalmente diferente a la de B-RAF. El informe de Davies et al. estimulado un gran esfuerzo de investigación, confirmó que el originalmente informado de alta frecuencia de B-RAF mutaciones en el melanoma. Sin embargo, esta frecuencia oscila entre el 30% a 70%, una variación, que ha sido en gran parte al diferencial de la fuente analizó el ADN del tumor, por ejemplo, fijo o tejidos tumorales in vitro propagadas por las células del melanoma. En particular, la variación también interfiere con la interpretación concluyentes sobre los efectos de estas mutaciones en el curso clínico de la enfermedad.

La observación de que las mutaciones en B-RAF y N-RAS se excluyen mutuamente conducir a la hipótesis, que la activación de cualquiera de B-RAF o N-RAS resultados similares en un fenotipo celular [3], [4], [5], [6], [7]. Sin embargo, los recientes informes sobre la asociación de B-RAF y / o N-RAS mutaciones con el pronóstico de los pacientes con melanoma reveló resultados contradictorios [5], [7], [8], [9], [10], que requieren aclaración por nuevos estudios, sobre todo teniendo en cuenta las diferentes frecuencias de la presunta B-RAF y N-RAS mutaciones. El presente estudio es el primero en investigar el perfil mutacional de B-RAF y N-RAS en tanto, muestras de tejido tumoral y las biopsias correspondientes, biopsia de las líneas celulares derivadas de pacientes con melanoma metastásico, en correlación con un supuesto impacto sobre la supervivencia. El análisis incluyó 97 tejidos tumorales y 105 líneas celulares de 109 pacientes con melanoma con un período de seguimiento medio de 31 meses. El estudio se informó a raíz de la recién creada OBSERVACIÓN directrices [11].

Métodos
Los pacientes

Los pacientes fueron inscritos con arreglo a los siguientes criterios de elegibilidad: histológicamente confirmado melanoma de la piel, mucosa, o de origen desconocido; etapa III o IV según la enfermedad a AJCC [12], y al menos una lesión metastásica accesible para un bioptic procedimiento. El paciente se permitió la inclusión, con o sin tratamiento sistémico actual. Los pacientes con melanomas primarios oculares fueron excluidos. Después de un paciente por escrito del consentimiento informado, una biopsia se obtuvo ya sea de una sólida lesiones metastásicas o un derrame maligno. Las biopsias de lesiones sólidas posteriormente se divide en tres partes: una fue inmediatamente congelada en nitrógeno líquido hasta que un nuevo análisis, el segundo se utiliza para la confirmación histopatológica del melanoma, y el tercero fue utilizado para el establecimiento de un permanente crecimiento de células de melanoma. El paciente se revisaron los gráficos correspondientes a las características del tumor primario (el sitio y el tipo histológico de primaria). La edad del paciente y la enfermedad etapa en el momento de la biopsia se registraron. Los exámenes de seguimiento se realizaron al menos una vez cada tres meses. Todas las muestras tumorales y los datos clínicos fueron recolectados con la Junta de Revisión Institucional aprobación del paciente y consentimiento informado.

Los tejidos y líneas celulares

El tumor sólido congelado muestras de tejidos se utilizan para el aislamiento de ADN de RNasa y proteinasa K digestión y posterior de fenol-cloroformo extracción [13]. La biopsia derivados de las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY), complementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS; Tecnologías de la Vida), 5 mM L-glutamina, 100 U / ml penicilina y 100 μ g / ml estreptomicina a 37 ° C en un 5% humidificado atmósfera de CO 2. Ellos fueron utilizados para el análisis no antes de seis a ocho pasajes cultura. Después de crecer hasta 70 a 80% confluencia, las células fueron separadas utilizando suavemente al 0,05% de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) / fosfato-salina tamponada (PBS), se lava dos veces, resuspendido en 10% FCS / RPMI y congelado en nitrógeno líquido. El ADN genómico fue extraído por medio de la purificación del ADN Puregene kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN).

Detección de mutaciones de línea única conformación polimorfismo (SSCP)

SSCP fluorescente capilar se utilizó la técnica para detectar mutaciones en el exón 15 del B-RAF gen y el exón 2 de la N-RAS gen. En pocas palabras, los exones se han amplificado por PCR usando primers etiquetados con 6-FAM HEX y tinte fluorescente (Applied Biosystems, Foster City, CA) en las condiciones descritas anteriormente [6], [10]. La electroforesis de los productos amplificados se llevó a cabo en ausencia de condiciones de desnaturalización en una gama de 16 secuenciador capilar (ABI3100; Applied Biosystems). Las mutaciones fueron detectadas por los patrones de migración diferencial en comparación con los fragmentos que contenían secuencias de tipo salvaje. El análisis de los resultados se llevó a cabo utilizando el software GeneScan (Applied Biosystems). En el exón 11 del B-RAF gen y en el exón 1 de la N-RAS mutaciones genéticas fueron seleccionadas por 'radio-activa' SSCP técnica. Los fragmentos de ADN fueron amplificados por PCR en presencia de [α-32 P] dCTP y los productos amplificados se electrophoresed de no desnaturalización MDE geles en condiciones diferentes, tal como se describe anteriormente [6], [10].

Direct secuenciación del ADN

Direct secuenciación del ADN se utilizó para identificar y confirmar las mutaciones detectadas en la B-RAF y N-RAS genes de SSCP. Para la secuencia, los productos PCR fueron incubadas con ExoSapIT (USB Amersham, Upsala, Suecia) a 37 ° C durante 30 min seguido de calentamiento a 85 ° C durante 15 min. La secuencia de reacciones se llevaron a cabo utilizando el BigDye Terminator Cyle kit de secuenciación (Applied Biosystems) en un 10 μ l de volumen que contiene purificado producto de PCR y secuenciación de una cartilla. Las condiciones de temperatura establecidos para la secuencia de reacciones fueron 96 º C durante 2 minutos seguido de 27 ciclos a 96 ° C durante 30 segundos, 54 ° C durante 10 segundos y 60 ° C durante 4 minutos. Los productos de reacción se precipitó con 2-propanol, lavado con etanol 75%, resuspendido en 25 μ l de agua y cargados en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Ambos, adelante y atrás capítulos fueron secuenciados por separado. La secuencia primaria de datos fueron analizados mediante el análisis de una secuencia de software (Análisis de Secuencias 3,7; Applied Biosystems) y el análisis comparativo se realizó con el software en línea MultAlin ( http://www.prodes.toulouse.inra.fr/multalin/ multalin.html).

Estadísticas

Curvas de supervivencia y la supervivencia media veces eran, si no se indique otra cosa, calculado a partir de la fecha de biopsia, ya sea hasta la muerte por melanoma o el último contacto con los pacientes, respectivamente, y se presentan gráficamente usando el método de Kaplan-Meier para censurados fracaso de datos en tiempo. El diario rango de prueba se utilizó para comparar las probabilidades de supervivencia. El multivariado de regresión de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para evaluar el impacto de múltiples factores pronósticos de supervivencia. Los factores fueron probados estado mutacional de B-RAF y N-RAS, el género, las enfermedades fase en la biopsia, y el lugar de su tumor primario. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando los paquetes estadísticos ADAM (Unidad Central de Bioestadística, alemán Centro de Investigación del Cáncer de Heidelberg, Alemania) y SAS 8.1 (SAS Institute, Cary, NC). Las diferencias con ap valor <0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Resultados

109 pacientes con melanoma metastásico se matricularon en el estudio ( Cuadro 1 ), El flujo de pacientes se presenta en Figura 1 . El período de seguimiento medio fue de 31 meses. Las biopsias se obtuvieron de 102 sólidos lesiones metastásicas y siete derrames malignos. La sólida lesiones incluyen el 48% cutánea o subcutánea metástasis, el 45% metástasis a los ganglios linfáticos, y un 7% las metástasis de órganos (cerebro, hígado, pulmón, intestino delgado, vejiga urinaria y riñón). Histopatología de rutina confirmó metástasis de melanoma en todos los casos. Los derrames malignos se originó a partir de ascitis (cinco pacientes) y la pleura (dos pacientes). Cada vez más líneas celulares de melanoma se podrían establecer de 98 de los 102 lesiones sólidas y de los siete derrames. Análisis de ADN de grado puedan ser aislados de 97 de los 102 biopsias y de todas las 105 biopsias procedentes de líneas celulares, y pruebas de mutaciones en los exones 11 y 15 de la B-RAF genes y exones 1 y 2 de la N-RAS gen . Detallada las características de los pacientes, así como los perfiles de mutacional de los tejidos tumorales y líneas celulares se presentan en Cuadro 2 . Los datos representativos de SSCP y secuenciación del ADN se muestran en Figura 2 .

Las mutaciones en B-RAF y N-RAS genes

Proyección de los exones 11 y 15 de la B-RAF gen dado como resultado la detección de mutaciones en 53/97 (54,6%) biopsias y 53/105 (50,5%) biopsia de células derivadas de líneas ( Los cuadros 2 y 3 ). La mutación más común en la B-RAF T1799A gen se detectó en 46/105 (43,7%) y las líneas celulares 47/97 (48,5%) biopsias. Esta mutación provoca un cambio de valina a ácido glutámico en el codón 600 en el exón 15 (V600E). Cinco líneas de células llevado la GT1798-99AA mutación en el codón 600 (V600K). El único no-600 mutación en el codón 15 del exón se G1780A (D594N), que se encuentra en una única línea celular (Ma-Mel-30). Todos los B-RAF mutaciones en el exón 15 fueron concordantes en las líneas de células y tejidos correspondientes, salvo en cinco casos: La línea celular UKRV-Mel-29, pero no la correspondiente muestra de tejido a cargo V600K la mutación, mientras que el correspondiente biopsias, pero no la líneas celulares UKRV-Mel-11, Ma-Mel-104, Ma-Mel-113 y Ma-Mel-121 bis llevado la mutación V600E. En el exón 11 del B-RAF gen que hemos detectado dos mutaciones, G469R y G469V. La primera se encontró en la línea celular Ma-Mel-48 bis y su correspondiente tejido, mientras que el segundo estuvo presente en una biopsia de tejido sin correspondiente línea celular disponible.

Las mutaciones en la N-RAS gen se produjo principalmente en el codón 61 del exón 2 y estuvieron presentes en 19/97 (19,6%) biopsias y 22/105 (21,0%) biopsia de células derivadas de líneas ( Los cuadros 2 y 3 ). La línea celular Ma-Mel-53 y su correspondiente tejido además del codón 61 mutación llevado una segunda N-RAS mutación en el codón 68 (R68T). Cuatro líneas celulares (Ma-Mel-31, Ma-Mel-37 ter, Ma-Mel-79b y Ma-Mel-53) ha puesto de manifiesto mutaciones en el exón 2 (Q61R, Q61L, Q61K y R68T, respectivamente) que no pudo ser detectada en las biopsias del tejido correspondiente. Una mutación (Q61R) detectó un tumor en los tejidos no estuvo presente en la casilla correspondiente línea Ma-Mel-02. Las mutaciones en el exón 1 en el codón 12 y 13 de la N-RAS genes fueron detectados en cuatro líneas celulares y tres correspondientes muestras de tejido, respectivamente. La mutación G12D en la línea celular Ma-Mel-27 no puede ser detectada en la biopsia de tejido se pongan en venta.

Tomados en conjunto, 73/97 (75,3%) biopsias de tejido tumoral y 77/105 (73,3%) biopsia de las líneas celulares derivadas llevado mutuamente excluyentes mutaciones en B-RAF o N-RAS ( Cuadro 3 ). Sólo una línea celular (Ma-Mel-30) y los tejidos correspondientes llevado a ambas mutaciones, B-RAF (D594N) y N-RAS (G13D) genes.

Impacto diferencial de B-RAF y N-RAS mutaciones en la supervivencia

Durante un período de seguimiento medio de 31,0 meses, 80 (73,4%) de un total de 109 pacientes falleció a causa de melanoma. Los pacientes cuyo tumor biopsias de tejido reveló una mutación en la B-RAF gen mostraron una disminución de la probabilidad de supervivencia global a partir de la fecha de la biopsia en comparación con los pacientes sin un B-RAF mutación (mediana de 8,0 frente a 11,8 meses, p = 0,055; Figura 3A ). Esta correlación de frontera importancia también pudieran ser detectados en los pacientes, de cuyas biopsias de tumores cada vez más líneas de células podría establecerse (B-RAF mutación en comparación con wildtype, la mediana de supervivencia global 7,1 frente a 9,3 meses, p = 0,068; Figura 3D ). Los pacientes que lleven una N-RAS mutación en muestras de tejido tumoral sus biopsias una mejor supervivencia en comparación con los pacientes sin un N-RAS mutación (mediana de 12,5 versus 7,9 meses, p = 0,084; Figura 3B ). Esta asociación podría ser detectado a una mayor medida en los pacientes cuya biopsia del tumor derivado líneas celulares llevó un N-RAS mutación en comparación con los pacientes sin dicha mutación (mediana de supervivencia global 15,4 versus 6,8 meses, p = 0.0008; Figura 3E ). Buscan a un subgrupo de 82 pacientes que se encontraban en etapa IV en el momento de la biopsia del tumor, los pacientes de nuevo la acogida a B-RAF mutación mostraron una reducción general de supervivencia en comparación con pacientes con wildtype B-RAF (p = 0,043, tejidos, Figura 4A , P = 0,091, las líneas celulares, Figura 4D ), Mientras que los pacientes que tengan una N-RAS presenta una mutación favorable la supervivencia en comparación con los pacientes sin N-RAS mutación (p = 0,052, tejidos, Figura 4B , P = 0,001, las líneas celulares, Figura 4E ).

Por lo que respecta a la supervivencia global medido desde el primer diagnóstico de melanoma, no se observaron diferencias significativas de B-RAF o N-RAS mutación, respectivamente, ni para los pacientes cuyo estado de mutación se determinó a partir de muestras de tejidos, ni para aquellos, cuyo estado era mutación medido en líneas celulares (datos no presentados). Cálculo de la supervivencia global a partir del primer diagnóstico de metástasis, los pacientes con un B-RAF mutación puesto de manifiesto una tendencia a una disminución de la supervivencia en comparación con pacientes con wildtype B-RAF (p = 0,052, tejidos, p = 0,072, líneas celulares), mientras que los pacientes llevar una N-RAS mutación mostró una tendencia favorable hacia una supervivencia en comparación con los pacientes sin N-RAS mutación (p = 0,18, tejidos, p = 0,12, las líneas celulares).

Un análisis multivariado mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox reveló la enfermedad en etapa biopsia como el único factor pronóstico independiente de impacto en la supervivencia global a partir de la fecha de la biopsia con respecto al análisis de tejidos (p = 0,03; Cuadro 4 ). B-RAF y N-RAS mutación estado ambos mostraron una p = 0.19). Sitio de primaria (p = 0,27), y el sexo (p = 0,79) no mostró gran influencia en la supervivencia. El análisis de la biopsia del tumor derivado líneas celulares reveló la N-RAS mutación estado como el más fuerte factor pronóstico (p = 0,006), seguida por la enfermedad en etapa biopsia (p = 0,02), sitio de primaria (p = 0.14), y B MAR-mutación (p = 0,29). Similares datos se obtuvieron analizando el subgrupo de 82 pacientes en etapa IV ( Cuadro 4 ). Adicionales se realizaron análisis de dividir los pacientes en tres grupos, (i) los pacientes acogida B-RAF mutaciones, (ii) la acogida pacientes N-RAS mutaciones, y (iii) los pacientes sin mutaciones en ambos genes. Estos análisis revelaron que en lo que respecta a toda la población de pacientes (n = 109), los pacientes acogida B-RAF mutaciones muestran una supervivencia similar en pacientes sin una mutación en B-RAF o N-RAS, mientras que los pacientes portadores de una N-RAS mutación presente con un favorable supervivencia (p = 0,11, tejidos, Figura 3C , P = 0,004, las líneas celulares, Figura 3F ). Este hallazgo podría ser observado de manera similar cuando se mira en el subgrupo de 82 pacientes, cuya biopsia del tumor se obtuvo durante la fase IV de la enfermedad (p = 0,087, tejidos, Figura 4C , P = 0,003, las líneas celulares, Figura 4F ).

Discusión

El fuerte concordancia entre el estado mutacional de los tejidos y las correspondientes líneas celulares, con un diferente estado de B-RAF en sólo el 5% y el N-RAS en sólo el 6%, respectivamente, sostiene enérgicamente contra la idea de que in vitro a corto plazo la propagación de los prejuicios frecuencia de eventos mutacionales en genes que codifican la vía de señalización MAPK. La conclusión de que estas mutaciones se conservan en todo tumor in vitro propagación sugiere, que pueden influir en el mantenimiento del tumor. En apoyo de esta idea, los estudios en un sistema modelo de ratón han demostrado, que RAS activado es necesario para el mantenimiento de melanoma [14]. Por otra parte, nuestros hallazgos validar los informes anteriores utilizando corto plazo propagado el cultivo de células de melanoma para análisis genotípicos.

Hasta hace poco, se ha previsto que el B-RAF y N-RAS mutaciones dar lugar a una activación de la RAS / RAF / MEK / ERK vía de señalización, por lo tanto, comparable a un fenotipo celular del mismo modo que influyen en el resultado clínico de los pacientes con melanoma. En consecuencia, la mayoría de los anteriores informes examinados los pacientes con mutaciones en B-RAF o N-RAS como un grupo de pronóstico. En este sentido, Houben et al. mostró mutaciones en B-RAF o N-RAS que se asocia con una alteración en la supervivencia global en pacientes con melanoma metastásico [5]. Del mismo modo, Daniotti et al. estudiaron pacientes derivados de las líneas celulares de melanoma y encontró una correlación de mutaciones en ninguno de los dos B-RAF o N-RAS pobres con la supervivencia global [8]. Sin embargo, Dumaz et al. cAMP demostrado que suprime C-MAR actividad en los melanocitos, y que esta supresión es esencial para disminuir el potencial oncogénico de C-RAF en estas células [15]. Como resultado, B-RAF es el único responsable de la señalización de MEK. Cuando N-RAS mutado es, sin embargo, las células cambiar su señalización de B-RAF a C-RAF, es decir, un cambio fundamental en el uso de la RAF isoforma se produce cuando se RAS mutado en melanoma. De hecho, en un reciente estudio que compara los perfiles de expresión génica de líneas celulares de melanoma con cualquiera de las dos mutaciones en B-RAF o N-RAS, encontramos el doble de genes upregulated en líneas celulares de ejecución N-RAS que las mutaciones en los que transportaban a mutaciones en B-RAF , Con una superposición de sólo el 16% [16]. Pathway análisis de los genes afectados sugirió, que los principales B-RAF mutación V600E afecta principalmente a la señalización de la vía ERK, mientras que las mutaciones en la N-RAS causar perturbación de la expresión de genes implicados en la apoptosis vía PI3K/AKT.

Estas observaciones tienen importantes implicaciones para el análisis de la importancia pronóstica de B-RAF y N-RAS mutaciones, así como el desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de esta vida que ponen en peligro la enfermedad [17]. Muchos de los recién desarrollado terapias dirigidas se multiquinasa inhibidores, pero, sin embargo, ejercer diferentes afinidades de fuerza para diferentes quinasas. Sorafenib (BAY 43-9006), un inhibidor multiquinasa recientemente a prueba en el melanoma metastásico con una eficacia significativa, tiene una afinidad mucho más fuerte a la RAF en comparación con el que a RAS, mientras que los inhibidores de farnesyl transferasa interferir con la translocación de RAS, pero no RAF a la membrana celular . Con respecto a esta cuestión, que distingue entre B-RAF y N-RAS mutaciones en lo que respecta a su influencia sobre la supervivencia de los pacientes con melanoma metastásico. Sorprendentemente, este análisis reveló que pacientes portadores de B-RAF mutaciones había una alteración en la supervivencia, mientras que los pacientes con N-RAS mutaciones se caracteriza por un pronóstico favorable, cada uno en comparación con el wildtype gen. Por otra parte, el análisis de datos multivariante mostró que la N-RAS, pero no B-RAF mutación estado fue un factor pronóstico independiente.

Los mecanismos de cómo la N-RAS mutaciones contribuir a mejorar la supervivencia del melanoma es aún no se comprenden totalmente. No obstante, se podría especular estar relacionada con las diferencias en los efectores abajo entre RAS y la RAF. Como se ha mencionado anteriormente, se presume que hasta hace poco, que la función primaria de RAS es simplemente para facilitar la activación de la RAF. Sin embargo, el descubrimiento de otras proteínas que son efectores de RAS función sugirió, que oncogénico actividades de RAS están mediadas por ambas dependientes de la RAF y RAF-independiente de señalización. En particular, mayor complejidad se plantea con la identificación de RAS efectores (por ejemplo, RASSF1-2 o NORE1) con supresor tumoral putativo, en lugar de oncogénico funciones [18]. Nuestro anterior análisis de perfiles de expresión génica de líneas celulares de melanoma con cualquiera de las dos mutaciones en B-RAF o N-RAS puesto de manifiesto diferencias sustanciales entre ellas la expresión de genes supresores de tumor y oncogenes [16]. A este respecto, es importante señalar, que Demunter et al. Describió un N-RAS mutación en el codón 18 en los tejidos de melanoma, que se asoció con un resultado favorable enfermedad [19]. Sin embargo, esta mutación no se detectó el tumor en el material analizado en nuestro presente estudio. No obstante, la asociación de mutaciones oncogénicas con un pronóstico favorable no es sin precedente. En el cáncer de vejiga, FGFR3 mutaciones se han asociado con una supervivencia prolongada y tumores llevar estas mutaciones constituyen una categoría de enfermedad favorable [20]. Una explicación completamente diferente podrán basarse en las diferentes inmunogenicidad de la mutación B-RAF y N-RAS o inducida por las respectivas moléculas efectoras, como recientemente se ha sugerido para la asociación aparentemente paradójico de un bcl-2 sobre-expresión con un mejor pronóstico en pacientes con cáncer [21].

El impacto negativo de B-RAF mutaciones en la supervivencia es ligeramente más evidente en el análisis de los tejidos que en el análisis de las líneas celulares. En contraste, N-RAS mutaciones se asocian con un pronóstico favorable, aunque la significación estadística se alcanzó sólo en los resultados de las líneas celulares. Una de las posibles razones podría ser que no tuvieron éxito en el establecimiento de una línea celular de cada tejido de la biopsia, que dio lugar a un sesgo de selección no deseados, lo que podría favorecer el establecimiento de líneas de células desempeño N-RAS mutaciones. Esto es apoyado por nuestra observación de que en cinco casos mutaciones en la N-RAS genes estaban presentes en las líneas celulares tumorales, pero no en las correspondientes muestras de tejido. Otro parámetro desequilibrado se basa en la inclusión de derrames malignos, a partir de la cual sólo las líneas celulares pero no los tejidos que se podrían derivar. Este hecho podría haber creado un sesgo entre las poblaciones de pacientes de los cuales las líneas celulares tumorales y / o los tejidos que podrían ser analizados, que es de particular importancia porque los pacientes con melanoma que presentan derrames malignos se sabe que muestran un muy mal pronóstico. Nuestra población de estudio incluyó a siete líneas celulares derivadas de derrames malignos, todos los cuales fueron negativos para el N-RAS mutaciones. Esta observación podría explicar las diferencias entre visto N-RAS mutado y wildtype líneas de células hacia el pronóstico.

Tomados en conjunto, demuestran que el estado mutacional de B-RAF y N-RAS están bien conservados en corto plazo la propagación in vitro y, lo más importante es que B-RAF y N-RAS mutaciones diferente impacto de los resultados de los pacientes con melanoma. Estos resultados deben considerarse en relación con estrategias terapéuticas en virtud de la actual investigación, utilizando B-RAF y N-RAS como dianas moleculares [22], por ejemplo, teniendo en cuenta la observación de que los inhibidores de la N-RAS gusta farnesyltransferase inhibidores podría no ser eficaz en el tratamiento del melanoma [ 23]. Los futuros ensayos clínicos en este campo debe ir acompañada de una centrado molecular workup de materiales de pacientes con el fin de proporcionar más conocimientos sobre los efectos de mutaciones en los perfiles de pronóstico y respuesta terapéutica de los pacientes con melanoma.

Damos las gracias a Roland Houben y Héctor von Waldrapp para la lectura crítica del manuscrito y el suministro de útiles debates.