Neural Development, 2007; 2: 3-3 (más artículos en esta revista)

POU-domain factor Brn3a regula tanto distintas y los programas comunes de la expresión génica en la columna vertebral y los ganglios del trigémino sensorial

BioMed Central
S Raisa Eng (sreng@ucsd.edu) [1], Iain M diques (idykes@ucsd.edu) [1], Jason Lanier (jlanier@ucsd.edu) [1], Natalia Fedtsova (nfedtsova@ucsd.edu) [1], Eric E Turner (eturner@ucsd.edu) [1]
[1] Departamento de Psiquiatría de la Universidad de California, San Diego y San Diego VA Healthcare System, Gilman Drive, La Jolla, CA 92093-0603, EE.UU.

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Resumen
Fondo

General somáticas sensación se transmite al sistema nervioso central a nivel craneal por el ganglio del trigémino (TG), y en los niveles de la columna vertebral de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). A pesar de que estos ganglios tienen funciones similares, tienen distinto origen embriológico, en que ambas contienen las neuronas procedentes de la cresta neural, mientras que sólo el GT incluye células procedentes de la placodal ectodermo.

Resultados

En este sentido, el uso de microarrays E13.5 análisis de embriones para demostrar que el desarrollo de DRG y TG tienen en general muy similares patrones de expresión génica. En los ratones que carecen de dominio POU-Brn3a factor de transcripción, los DRG y TG exposición común muchos cambios en la expresión génica, pero un subconjunto de los genes Brn3a objetivo mostrar incremento en la expresión sólo en el GT. En la de tipo salvaje TG-Brn3a estos genes son reprimidos en silencio, pero su promotor regiones exposición histonas H3-acetilación niveles similares a constitutivamente gen transcrito loci. Este aumento de H3-acetilación no se observa en los DRG, lo que sugiere que la cromatina modificaciones juegan un papel en la celda objetivo específico sobre la regulación de genes de Brn3a.

Conclusión

Estos resultados demuestran que un desarrollo de Brn3a papel es reprimir a posibles diferencias en la expresión de genes entre las neuronas sensoriales generados axiales en diferentes niveles, y para regular un programa convergente de desarrollo de la expresión génica, en la que funcionalmente similares poblaciones de neuronas se generan a partir de diferentes substratos embriológico .

Fondo

La generación de diversidad celular en el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados es uno de los problemas más complejos en biología, y un gran número de factores de transcripción se han identificado que orquestar neurodesarrollo y regular la identidad molecular de las neuronas. Tal vez la mejor de los sistemas estudiados para el establecimiento de fenotipos neuronales en los vertebrados son el principal insumo (sensorial) y salida (motor) de las vías sensoriales los ganglios periféricos, la médula espinal y tronco cerebral. En estas zonas, varios reguladores transcripcionales clave han sido identificadas, muchas de las cuales son miembros de la base-hélice-loop-hélice (bHLH) y del homeodominio factor de transcripción clases [1, 2].

El sensorial periférica del sistema nervioso está organizado anatómicamente según la naturaleza de la información externa se informó a la del sistema nervioso central (SNC). Las modalidades sensoriales del dolor, el tacto, la temperatura y la propiocepción son transduced de las neuronas sensoriales innervating la piel y las estructuras musculoesqueléticas, y se conocen como sensación somática general. Neuronas sensoriales periféricas también transmitir los sentidos del gusto y el oído, y la sensación visceral, que informa del estado de los órganos internos. En los niveles espinal, somáticas sensación general es transmitida por la raíz dorsal o ganglios espinales (GRD), mientras que en la anterior cabeza y el rostro, estas modalidades sensoriales están mediadas por el ganglio del trigémino (TG).

Sorprendentemente, a pesar de las funciones similares de la DRG y TG, estos ganglios no tienen diferentes orígenes embriológicos. El DRG se forman por completo la columna vertebral de la cresta neural. En contraste, el GT está formada por parte de la oftalmología y maxilo-mandibular placodes originarios de la superficie ectodermo, así como la cresta neural craneal células derivadas de rhombomere 2, que migran y se condensan para formar el ganglio [3, 4]. El trigémino sistema también incluye una población de neuronas sensoriales que se encuentran fuera de los ganglionares anatómicos, la mesencephalic trigémino (mesV), el origen exacto de lo que es todavía un tanto controvertido [5, 6]. El desarrollo de mecanismos que conducen a la diferenciación funcional de las poblaciones similares de las neuronas de estas diferentes fuentes embriológico no se conocen bien.

Reguladores transcripcionales de desarrollo sensorial pueden ser ampliamente divididas en principios de factores que son esenciales para la neurogénesis, pan-sensorial factores que comienzan a ser expresada en todo el tiempo de ciclo celular de salida y finales de factores que caracterizan a los subtipos específicos sensoriales. En ratones, los proneural bHLH factores Ngn1 y Ngn2 se expresan transitoriamente embrionarias de 8,5 días en craneal sensorial precursores y han demostrado tener un papel crucial en la neurogénesis [7 - 9]. Cerca de la hora de ganglionares de la condensación del ciclo celular y de salida, a partir de E9.5-10,5, casi todas las neuronas sensoriales, tanto en la columna vertebral y craneal niveles de co-expresar el homeodominio Brn3a factores de transcripción y Islet1 [1, 10]. Más adelante en el desarrollo, los factores asociados con el desarrollo de subtipos específicos sensoriales incluyen la familia runt factores Runx1 y Runx3, la variante de proteína homeodominio Prrxl1/DRG11, y el miembro de la familia Ets Etv1/Er81 [1, 11 - 15].

Los estudios de ratones knockout Brn3a han demostrado que este factor es necesario para el correcto crecimiento axonal, objetivo inervación, y la supervivencia de TG y DRG neuronas [16 - 19]. Microarray estudios de los países en desarrollo de TG Brn3a null ratones han demostrado que Brn3a es necesaria para un programa complejo sensorial de la expresión génica [20]. En el presente estudio, se analiza el papel de Brn3a sensorial en la neurogénesis en troncular y craneal. En ratones normales, los países en desarrollo y DRG TG tienen muy similares patrones de expresión génica global. La pérdida de Brn3a expresión en los países en desarrollo DRG conduce a cambios en la expresión de determinados neurotransmisores, los receptores, reguladores de desarrollo, los mediadores de la transducción de señales, y factores de transcripción. Muchos de estos cambios se conservan entre la TG y DRG de Brn3a ratones knockout, pero algunas transcripciones son sólo aumentó notablemente en los ganglios craneales. El promotor de estas regiones normalmente silenciosa pero diferencialmente regulados los genes son hyperacetylated sólo en el GT, lo que puede indicar un estado latente de "expressability 'que pueden variar entre los espinal y craneal. Por lo tanto, un papel clave el desarrollo de Brn3a puede ser para reprimir posibles diferencias en la expresión de genes entre el desarrollo de DRG y TG neuronas, y así promover la generación de funcionalmente similares poblaciones de neuronas a partir de diferentes fuentes embriológico.

Resultados
Mundial de la expresión génica es muy conservadas en las neuronas sensoriales de los distintos niveles axial

Para empezar a comparar el programa molecular de las neuronas sensoriales en el desarrollo craneal y espinal, hemos realizado análisis global de la expresión génica en los países en desarrollo y DRG TG. E13.5 fue elegido para esta comparación porque, a estas alturas, la mayoría de las neuronas del DRG y TG han salido del ciclo celular y han comenzado a expresar marcadores definitivo de la neurogénesis. Dado que las neuronas sensoriales han conservado las funciones de la columna vertebral y en los niveles craneal, la hipótesis de que el patrón global de expresión génica en los DRG sería mucho más similar a la de TG a otros tejidos neuronales. La Figura 1 ilustra una comparación de la expresión génica en el DRG a un análisis repetidos de un mismo tejido, a la TG, y para el neocórtex embrionarias. Estos resultados muestran un alto grado de similitud general en la expresión génica entre los ganglios sensoriales de los distintos niveles axial, y confirman que es mucho mayor divergencia entre los patrones de expresión génica en los DRG y el desarrollo de la corteza cerebral.

En general, sólo una fracción muy pequeña de las aproximadamente 44000 transcripciones ensayadas por el conjunto mostró profundas diferencias de expresión entre los DRG y TG (Tabla 1]. Un número significativamente mayor de las transcripciones se expresó únicamente en el DRG, y siete de cada diez de las transcripciones con la más alta expresión relativa a la DRG Hox codifican factores de transcripción, uno espera encontrar axial dada la restricción de la expresión Hox. Varios de los otros genes expresados diferencialmente puesto de manifiesto en el análisis de microarrays podría ser validada por hibridación in situ (véanse los ficheros adicionales 1], a pesar de algunas diferencias parecen representar los resultados anómalos que pueden estar relacionados con factores como alta expresión de las regiones periféricas neuroglia (Ednrb, Sostdc1).

Aparte de los factores Hox, la transcripción con la mayor expresión relativa a la DRG fue Etv1, una familia Ets-factor de transcripción expresado en 1a huso muscular afferents [13, 21]. Inmunofluorescencia para Etv1 expresión en el E13.5 DRG confirmó expresión en neuronas sensoriales y de gran tamaño intermedio, mientras que la expresión está totalmente ausente en la TG en esta fase (Figura 2 bis, b]. Por el contrario, expresión de Runx3, un antes y más general proprioceptive marcador de neuronas [13, 14], se observó tanto en los DRG y TG en E13.5 (figura 2c, d].

Por E16.5, Etv1 expresión puede ser detectada en algunas neuronas de la TG, así como los GRD. En el DRG, una población de Etv1-expresando neuronas muestran grandes núcleos soma y en consonancia con 1a proprioceptors. Sin embargo, en los TG de casi todos los Etv1-expresando neuronas son de tamaño intermedio, y los grandes Etv1-positivas en consonancia con las neuronas 1a proprioceptors son raros. En tanto el DRG y el GT, esta de tamaño intermedio y, posteriormente, en desarrollo de la población de Etv1 de las neuronas sensoriales que expresan podría distinguirse de la 1a proprioceptors de la co-expresión de Islet2 (Figura 2e, f].

Una característica distintiva de la TG es que un subconjunto de neuronas que son parte funcional del sistema trigémino, el mesV, se encuentra dentro de la CNS. El examen de la mesV a finales de gestación puesto de manifiesto las grandes neuronas sensoriales positivos para Etv1. Estas neuronas co-expresó una tauLacZ transgén integrado en el locus Brn3a, y Brn3a es un conocido marcador de la mesencephalic trigémino [6]. La posición de estas neuronas en el cerebro medio caudal es coherente con el papel de algunas de estas neuronas como afferents huso muscular de los músculos de la masticación [22]. De este modo, la expresión exclusiva de Etv1 en el DRG, pero no a la TG E13.5 parece resultar de una población de Etv1 +, Islet2 - proprioceptive neuronas que están presentes en los DRG sino que se limita básicamente a la mesV a nivel craneal.

Brn3a regula abajo múltiples objetivos en la DRG

Para entender los programas de desarrollo regulados por Brn3a en la columna vertebral frente a los niveles craneal, el próximo mundial analizaron la expresión génica en E13.5 DRG Brn3a mutante de embriones y de tipo salvaje controles. Los cuadros 2 y 3 se resumen las transcripciones más aumentó y disminuyó en E13.5 en el GRD de Brn3a ratones knockout, y una lista más completa figura en el archivo adicional 2. Hibridación in situ y de inmunofluorescencia se utilizan para verificar la expresión alterada de varios de los destinatarios genes (Figuras 3 y 4], con énfasis en la recientemente identificados Brn3a objetivos y los genes de expresión que no ha sido previamente descrito en los ganglios de los sentidos.

La mayoría de los Brn3a reguladas genes de función conocida tienen funciones específicas en la neurotransmisión, axonogenesis / sinaptogenesis, transducción de señales, la regulación de las vías de desarrollo, o transcripción. Entre los mediadores de la neurotransmisión, varios receptores de glutamato (Gria3, Gria4, Grik1), un transportador de GABA (Slc6a1), un receptor de serotonina (Htr3a) y el neuropéptido somatostatina se incrementan, mientras que un receptor GABA (Gabra2) y neuropéptidos específicos con funciones sensoriales ( Galanin, Adcyap1/PACAP) se redujo. También se redujo latexin, un inhibidor de secretada carboxypepidase con un papel en la nocicepción [23].

Los profundos cambios también fueron observados en los genes que codifican conocidos o potenciales, los mediadores de neurogénesis sensorial, y el crecimiento axonal o de orientación. El aumento de las transcripciones de esta categoría incluyen la molécula de adhesión celular Chl1, que tiene un conocido papel en el crecimiento de dendritas corticales [24], y, como Nel-2, un factor de crecimiento epidérmico (EGF)-que contengan factor de repetición con una función previamente demostrada en el desarrollo sensorial [25]. El aumento de expresión también se observó durante varias moléculas con conocidos o probables en el axón funciones de orientación, incluidos los Disabled1, Sema3c, Sema3d, f-spondin, Cadherin22, Protocadherin 8, Protocadherin 17, DCC, y NetrinG1. Disminución de expresión se observó para advillin, una proteína de unión de actina que es un conocido mediador de neurite resultado sensorial [26], así como Ncam2 los receptores Eph y A7. Estos cambios sugieren que los profundos defectos observados en los axones sensoriales de Brn3a ratones nulos [17] el resultado de Daño Articular de un programa coordinado de expresión de los mediadores de crecimiento axonal y orientación, más que de una sola lesión molecular.

Pérdida de Brn3a también dio lugar a cambios significativos en la expresión de otros factores de transcripción. En particular, la supresión de Brn3a efectivamente dio lugar a un triple de las eliminatorias Pou4 homeodominio clase, porque Pou4f2 (Brn3b) expresión es casi eliminado, y Pou4f3 (Brn3c) expresión es reducido en gran medida en los ganglios Brn3a knockout. Marcado descensos se observaron también en marcadores específicos de neuronas sensoriales subclases, incluidos Prrxl1/DRG11, Runx1 y Runx3. Por el contrario, bHLH genes específicos, incluidos los de codificación NeuroD1, NeuroD6, Msc, y Nhlh2, se aumentaron y, tal vez en consonancia con lo anterior, la bHLH factor inhibitorio ID 1, el cual puede actuar para oponerse a la acción de los genes bHLH neurogénica, se redujo. La importancia de algunos de estos cambios en la jerarquía de la regulación de genes en las neuronas sensoriales en desarrollo se examinan a continuación.

Pérdida de Brn3a expresión dio lugar a incremento en la expresión de prácticamente todos los de la anterior HoxA, HoxB y HoxC genes, y los cambios alcanzó significación estadística (p <0,005 o p> 0,995, Materiales y Métodos) durante siete genes de este grupo (Figura 5]. Los genes Hox posterior se expresaron en niveles mucho más bajos que los anteriores factores, como era de esperarse para braquial a nivel de GRD, y exhiben ya sea sin cambios o disminución de expresión en la eliminatoria. Los miembros del grupo HoxD no fueron significativamente expresada en el GRD (datos no presentados), con la excepción de HoxD1 que, a diferencia de la anterior otros productos de genes Hox, exhibió disminuyó expresión en Brn3a null DRG, y también fue el único producto de genes Hox expresadas en niveles significativos en el GT (ver ficheros adicionales 3] [20].

En estudios previos hemos demostrado que Brn3a regula su propia expresión directa a través de retroalimentación negativa, y que, en heterocigotos Brn3a ratones knockout, exención parcial de esta autorregulación resultados negativos en el aumento de expresión de los alelos intactos, lo que resulta en casi completa de compensación de dosis génica. Para determinar si la dosis de genes indemnización también está presente en los niveles de la columna vertebral, se examinaron los niveles de aumento de todas las transcripciones y la disminución en Brn3a + / +, Brn3a + / - y Brn3a - / - ganglios (ver archivos adicionales 2 y 4]. En cada caso, la media del efecto de la pérdida de un alelo Brn3a objetivo en la expresión génica fue del 16% al 19% del efecto de la pérdida de ambos alelos, en comparación con el 50% de variación que se espera sin ningún mecanismo de compensación, lo que indica importante pero incompleta indemnización por la dosis de genes.

Un subconjunto de Brn3a objetivos son únicos a los ganglios sensoriales craneal

Comparación de los objetivos de regulación de Brn3a en los países en desarrollo DRG con nuestro análisis previo de la TG [20] sugiere que hay muchas aguas abajo genes en común entre estos ganglios. Sin embargo, los resultados de la más avanzada de microarrays utilizado en el presente estudio (Affymetrix 430) no puede compararse directamente con el TG antes de los datos derivados de una gama de más edad (Affymetrix U74v2). Para efectuar tal comparación, hemos realizado un nuevo análisis de estas muestras E13.5 DRG U74v2 con la matriz. También actualizó la interpretación de los resultados de la TG U74v2 de datos utilizando las anotaciones de Build 34 del genoma del ratón. Este análisis confirmó que los DRG y TG de E13.5 Brn3a ratones knockout han conservado muchos cambios en la expresión de genes (véase ficheros adicionales 3]. Las transcripciones aumentó en los DRG y TG de ratones knockout Brn3a incluir la bHLH factores de transcripción musculin y NeuroD1, los neurotransmisores y receptores de somatostatina, CCK-A receptor, los receptores 5HT-3A, y transportador de GABA-1, y el factor de crecimiento FIGF / VEGF - D. Conservadas por las disminuciones incluyen los factores de transcripción Hmx1, Runx1 y basonuclin, los péptidos galanin y PACAP, así como advillin y latexin.

Aunque la mayoría de los objetivos de abajo Brn3a se conservan en el DRG y TG, un subconjunto de los genes fue singularmente regulada en cada nivel axial. La más profunda se observaron diferencias para un conjunto de genes aumentado notablemente en los TG de Brn3a knockout embriones, y no se han modificado en los GRD (Figura 6]. Estos genes regulados diferencialmente incluir la codificación de los factores de transcripción Tcfap2b (AP2 β), NeuroD4 (Math3) y Gata3, la proteína de unión de calcio Calb2 (calretinin) y las pequeñas GTP-proteína de unión Rab3b. Estos resultados nos llevaron a considerar los posibles mecanismos de la célula objetivo específico sobre la regulación de genes de Brn3a en estos dos estrechamente relacionados con los tejidos neuronales.

Las células específicas del tipo de efectos de factores de transcripción son generalmente atribuidos a distintos complementos de socios que interactúan, o para la expresión de factores relacionados con los que proporcionar redundancia en algunos tipos de células, pero no en otros. Sin embargo, con la excepción de los Hox factores, la muy similares perfiles de expresión génica de los DRG y TG no sugieren muchos candidatos para Brn3a distintos socios en estas neuronas. Además, la pérdida de Brn3a elimina eficazmente expresión de todos los factores Pou4 clase tanto en el DRG y TG, haciendo poco probable despido selectivo.

Un enfoque para comprender la célula específica de los efectos de la pérdida de Brn3a expresión ha sido propuesto por los trabajos recientes en que hemos demostrado una correlación entre Brn3a vinculantes para sus destinatarios sitios en vivo y H3-acetilación en las proximidades de los posibles sitios de unión [[ 27] en prensa]. En vista de estos resultados, un posible mecanismo para la regulación diferencial de los genes objetivo de Brn3a podrían ser distintas modificaciones de la cromatina a la meta de genes en los loci DRG y TG, que podría modular los efectos de Brn3a o regulador factores. Para examinar esta cuestión para la diferencialmente regulados loci Tcfap2b, NeuroD4 y Gata3, hemos utilizado la cromatina immunoprecipitation (CHIP) a H3 perfil de acetilación de histonas en el medio silvestre de tipo E13.5 DRG y TG (Figura 7]. También se examinaron el Msc lugar como un ejemplo de un gen que muestra igualmente una mayor expresión en los DRG y TG de Brn3a ratones knockout. Chip ensayos del promotor regiones de tres genes expresados constitutivamente, Gapdh, Mapt (tau), y Eno2 (enolasa neurona específica), se utilizaron como controles positivos, y los resultados fueron negativos normalizado para los ensayos de control de la región promotora de la Alb1 ( albúmina) gen, que no se expresa en el sistema nervioso. Debido a que las secuencias genómicas que regulan estos genes en los ganglios sensoriales no han sido definidos, estudiados a través de acetilación de histonas estos loci utilizando múltiples pares de oligonucleótidos espaciados a 500 a 1000 pares de bases (pb) intervalos de aproximadamente -10 a +15 kb kb relativa para el inicio de la transcripción, usando cuantitativa en tiempo real PCR ( 'locus-chip ») [" locus-chip ", [27] en prensa].

Chip de perfiles de la Msc locus puesto de manifiesto niveles similares de H3-acetilación en el DRG y TG. Sin embargo, los ensayos de chip de la Tcfap2b y NeuroD4 loci reveló significativamente mayor H3-acetilación de la TG en relación con la DRG (p = 0.0003 y p = 0.0005, respectivamente), mientras que el locus Gata3 mostrado una tendencia (p = 0,09) hacia una mayor acetilación en la TG. Como era de esperar, los promotores del control positivo fueron muy acetilado, y el control negativo, Alb1, se desacetilizado tanto en el DRG y TG. Por lo tanto, el estado de acetilación H3-silvestre en los ganglios de tipo parece estar correlacionada con la expresión basal y también con un estado potencial latente de expresión que puede ser inducido en los ganglios Brn3a nula.

Discusión

Numerosos factores de transcripción se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la diferenciación de tronco cerebral, espinal, la columna vertebral y las neuronas sensoriales, sin embargo, en su mayor parte, los programas de la expresión de genes regulados por estos factores siguen siendo desconocidos. Una capa de complejidad se añade al análisis de los objetivos de abajo de estos factores por el hecho de que sus patrones de expresión son a menudo muy complejas, y pueden incluir diversos tipos de neuronas y no de tipos de células neuronales con no obvia características comunes. Brn3a, por ejemplo, se expresa en la mayoría de la diferenciación de las neuronas sensoriales periféricas, y también en determinadas neuronas de la médula espinal, Olivo-cerebelar sistema, cerebro medio, DIENCÉFALO y la retina. El LIM-domain factor de transcripción Islet1 es co-expresada con Brn3a en el sistema sensorial [10], pero en el SNC y se expresa principalmente en neuronas motoras [28, 29], y también tiene un importante papel en el desarrollo del corazón [ 30] y las células islote pancreáticas [31]. Una cuestión fundamental sin respuesta es si estos factores, y muchos otros con los patrones de expresión de similar complejidad, regular los mismos objetivos en diferentes tipos neuronales, y en las neuronas o no las células neuronales.

Para entender mejor las vías moleculares de desarrollo sensorial, se inició el presente estudio mediante el examen de la expresión génica global en el braquial a nivel de GRD y TG en E13.5. En esta etapa, cuando prácticamente todas las neuronas sensoriales han salido del ciclo celular y marcadores sensoriales de los subtipos están empezando a ser expresadas, las modalidades de la expresión génica de los DRG y TG son bastante similares. Algunas transcripciones muestran diferencias cuantitativas entre los ganglios, lo que puede representar diferencias relativas a la composición celular o el calendario de desarrollo, pero muy pocas transcripciones son expresadas en forma exclusiva o bien el DRG o TG. El más destacado entre los pocos transcripciones restringida a un determinado nivel axial son las codificadas por los genes Hox y Etv1, que en esta etapa se expresan sólo en los GRD. La restricción de las transcripciones Hox (con la excepción de HoxD1) a los niveles de la columna vertebral se espera basado en el bien caracterizado axial patrón de expresión de estos genes. Etv1 expresión está restringida a la DRG E13.5 porque en la primera neuronas para expresar este marcador, los grandes proprioceptive neuronas innervating husos musculares, se desarrollan dentro de la DRG a la columna vertebral a nivel craneal, pero los niveles son en gran parte en el secuestro de mesV. Etv1-expresando neuronas que se desarrollan en los TG de E16.5 se distinguen de menor tamaño y la co-expresión de Islet2, y parecen representar un subconjunto de neuronas sensoriales.

Análisis global de la expresión génica en Brn3a eliminatoria y de tipo salvaje DRG demuestra que regula Brn3a, directa o indirectamente, un amplio programa de la expresión génica. Los avances en la tecnología de microarrays y en la anotación del genoma del ratón nos han permitido ampliar significativamente el número de identificados Brn3a objetivos de un estudio previo de la TG [20]. Un gran número de los objetivos de abajo Brn3a en el DRG haber sabido funciones en la neurogénesis o función neuronal, e incluyen componentes de los axones y sinapsis, neurotransmisores y sus receptores, los mediadores de señalización intracelular, y factores de transcripción. Debido a que las secuencias reguladoras de muchos de estos genes no han sido descritas, en muchos casos no es posible distinguir los objetivos de regulación directa de secundaria o efectos compensatorios. Sin embargo, en estudios recientes que hemos utilizado locus-chip para demostrar que Brn3a es una consecuencia directa de NeuroD1 represor NeuroD4 y en la embrionaria TG [[27] en prensa], así como un modulador negativo de su propia expresión [32, 33] .

La mayoría de Brn3a objetivo genes se conservan entre las neuronas sensoriales a craneal y espinal. Sin embargo, un subconjunto de los genes con la mayor incremento en la expresión en la TG no cambian su expresión en las eliminatorias Brn3a DRG, y son por lo general no detectables en las E13.5 DRG de los animales de cualquier genotipo. Estas transcripciones diferencialmente regulados incluyen los factores de transcripción Tcfap2b, Gata3 y NeuroD4, la proteína de unión de calcio calbindin2 (calretinin), y las pequeñas GTP-proteína de unión Rab3b, implicados en la liberación de vesículas sinápticas [34]. Debido a que hay normalmente pocas transcripciones que distinguen a la TG de la DRG, en esta fase de desarrollo, los patrones de expresión génica de los DRG y TG son mucho más diferentes a los ganglios Brn3a knockout que en el tipo silvestre. Esto sugiere que una de las funciones importantes para Brn3a es para reprimir posibles diferencias en la expresión de genes entre el espinal y los ganglios craneales, mediar un proceso de "desarrollo convergente", en la que funcionalmente similares poblaciones de neuronas se generan a partir de diferentes fuentes embriológico.

El estado de acetilación de histonas H3 de Brn3a objetivo de genes loci ofrece alguna información sobre el mecanismo subyacente de la regulación diferencial de estos objetivos en la columna vertebral y craneal. Normalmente, acetilación H3 se asocia con la reglamentación en las secuencias de los promotores de los genes transcritos activamente. En consonancia con esto, hemos demostrado previamente que la región promotora de Pou4f1 en sí es muy acetilado en la TG, y los promotores de los genes que están en silencio los ganglios sensoriales independientemente de Brn3a genotipo son desacetilizado [[27] en prensa]. En silvestres de tipo DRG y TG, los genes regulados diferencialmente NeuroD4 y Tcfap2b son casi en silencio, sin embargo, estos loci de genes se pueden distinguir en las neuronas del trigémino por el aumento de acetilación H3 más de una región que abarca la transcripción sitio web inicial. El Msc gen es también normalmente en silencio, sino que presenta una mayor expresión en ambos craneal y espinal en los niveles Brn3a null ratones, y, por tanto, H3 acetilado tanto en el DRG y TG. Así, en el caso de estos genes con el aumento de expresión en la eliminatoria Brn3a, acetilación H3 parece revelar un estado latente de posibles expresión, que es reprimido normalmente por Brn3a abajo o de sus efectores, y la remoción de Brn3a reprimidos en los ganglios del knockout.

El fracaso de DRG neuronas para aumentar NeuroD4 y Tcfap2b expresión en los ganglios Brn3a knockout sugiere que un mecanismo redundante de la represión existe para estos genes en la columna vertebral, pero no los niveles craneal. La acción de este represor puede ser reflejada en los bajos niveles de acetilación de histonas en estos loci en los GRD. Debido a que el más destacado rasgo distintivo de los sentidos de la expresión génica en los niveles de la columna vertebral es la expresión de múltiples genes Hox, estos factores son candidatos mediadores de esta represión selectiva de NeuroD4 y Tcfap2b en la DRG. Represor transcripcional funciones se han descrito para la Hox genes [35], y hay pruebas de que las proteínas Hox puede bloquear directamente la actividad de la gran histona acetiltransferasa expresó CBP-P300 [36]. Represión de genes Hox de un subconjunto de Brn3a objetivo de genes loci podría ser un proceso activo en E13.5, o la expresión de genes Hox en las primeras etapas de desarrollo podrían producir modificaciones persistentes de la cromatina, que se refleja en la deacetylation de estos loci observados aquí, lo que redujo la transcripción directa, incluso cuando la represión de los genes Hox ya no está activa .

Materiales y métodos
Emparejamientos, los embriones, y el aislamiento de ARN para el análisis conjunto

Para generar tejidos para análisis de microarrays, el tiempo de emparejamientos de Brn3a heterocigotos animales se realizaron, y los embriones fueron recolectados en E13.5. Sólo los embriones correspondientes a E13.5 ± 0,5 días sobre la base del sistema de clasificación por etapas de Theiler [37] se utilizaron para el análisis de microarrays. TG fueron retirados por la disección y romo cuidadosamente liberados de adherente no tejido neural multa con fórceps. DRG fueron aisladas de extracción de la médula espinal con sus adherentes ganglios, seguidos por la disección de los ganglios de la multa con fórceps. DRG fueron cosechadas de braquial sola región, incluido el C5-T1. Ganglios disecados fueron colocados en solución inhibidor de RNasa (RNAlater, Ambion, Austin TX), RNA y se preparó utilizando el sistema RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Los embriones fueron genotipo para Brn3a alelos tal como está descrita anteriormente [17] a partir de una muestra de cola o de la extremidad posterior del tejido recolectadas en el momento de la disección ganglionar. TG genotipo o DRG de cinco embriones eran suficientes para proporcionar aproximadamente 5 μ g de RNA total para un solo análisis de microarrays. La generación de cDNA, la producción de la etiqueta cRNA, hibridación y GeneChip para todos los arreglos se realizarán de acuerdo con protocolos estándar proporcionada por el fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA).

Análisis de expresión conjunto de datos

El director de microarrays de datos que aquí se presenta para el ratón y DRG TG se generaron utilizando la Affymetrix 430A y 430B microarrays. Además, el mismo DRG muestras fueron analizados utilizando Affymetrix U74A y U74B arrays para la comparación directa con los conjuntos de datos antes de la TG [20]. El principal análisis de microarray de datos, incluida la determinación de la ausencia / presencia de las transcripciones ensayadas, los niveles de transcripción de expresión, y la probabilidad de cambio en la transcripción de expresión entre las muestras ( «cambio p ') se realizó con Microarray Suite 5.0 (Affymetrix). Por defecto Microarray Suite 5,0 parámetros se utilizaron para aumentar (I) y descenso (D) llamadas. Para la serie 430 establecidos estos valores fueron de corte p <0,005 y p> 0,995 para I y D, respectivamente, y para los arrays U74, fueron los valores p <0,003 y p> 0,997. Todos los valores array inicialmente se adaptan a un valor medio de 500 usando la expansión mundial. Para permitir la comparación más significativa de los niveles de expresión de transcripciones ensayadas por el 430A y 430B arrays, la expresión inicial de los valores 430B gama se reajustarán sobre la base de los niveles de expresión de 100 conjuntos de sonda en común entre el 430A y 430B arrays. Microarray sonda se establece en relación con las correspondientes transcripciones ratón utilizando la base de datos NetAffx (Affymetrix), con sede en el NCBI Build 34 de la anotación del genoma del ratón. El conjunto de datos discutidos en esta publicación se han depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) [38] y son accesibles a través de GEO serie número GSE5658.

La comparación de la expresión génica entre los salvajes de tipo DRG y TG (Tabla 1] y entre los DRG de Brn3a de tipo silvestre, heterocigótica, y los ratones knockout (Cuadros 2 y 3] se realizaron por duplicado, utilizando piscinas aisladas de los ganglios. Para ser incluido en los cuadros de la evolución de las transcripciones de un determinado genotipo o de tejidos, los siguientes criterios se cumplen: los dos repeticiones fueron llamados como "presente" en la condición de una mayor expresión; ambas repeticiones mostraron un aumento o 'I' llamamiento en favor de la condición de mayor expresión, y la sonda identificó un conjunto anotado el nombre y transcripción en NCBI Build 34 del genoma del ratón.

Copia de la identificación de sonda fija la misma transcripción, se han eliminado, y los cuadros están anotados con el número de concordante sonda fija para cada transcripción. Concordancia fue identificado por el acuerdo de los presentes y el aumento de llamadas para duplicar la sonda conjunto, y un mínimo pliegue cambio de 2,0. En el caso de múltiples conjuntos de sonda concordantes, la sonda con el conjunto veces mayor cambio es que figuran en los cuadros. Resultados de la sonda fija reunión con los criterios de inclusión fueron clasificados por el cambio veces, y el valor de corte para la inclusión aparece en las tablas.

Hibridación in situ y de inmunofluorescencia

No isotópica hibridación in situ se realizó tal como está descrita anteriormente [38]. Una lista de sondas utilizadas y sus fuentes aparece en el archivo adicional 5. Inmunofluorescencia para Brn3a se realizó con antisueros policlonales de conejo como anteriormente tal como está descrita anteriormente [39]. Otros antisueros utilizadas incluyeron conejo antisueros contra Etv1/Er81 y Runx3 obtenidos de la Dra Sylvia Arber [13, 15], y conejillo de antisueros contra Islet2, obtenidos a partir de Pfaff Dr Sam [28]. Inmunofluorescencia para otros antígenos se realizó con anticuerpos disponibles comercialmente, incluida la de conejo anti-calretinin (Swant, Bellinzona, Suiza), conejo anti-galanin (Bachem, rey de Prusia, PA), conejo anti-somatostatina-14 (Península de Laboratorios), y cabra anti-β-galactosidasa (biogénesis (MorphoSys), Kingston, NH).

Locus de toda la cromatina immunoprecipitation

Locus-Chip ensayos se realizaron tal como está descrita anteriormente [[27] en prensa]. En breve, los embriones de chip ensayos fueron generados a partir de cruzamientos con fecha de ratones ICR. DRG y TG fueron disecados de E13.5 embriones y fija en 4% paraformaldehido durante 30 minutos, luego quenched con 150 mM glicina. El tejido fijado se lavó con buffer fosfato salino-y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis.

Selección de la cromatina complejos de los ganglios sensoriales de embriones se realizó por una modificación de un procedimiento ampliamente utilizado [40]. Para cada análisis, los ganglios fijos a partir del 30 de los embriones (60 TG o aproximadamente 300 GRD) se combinaron y suspendido en buffer de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 8,1, con 10 mM EDTA y 1% SDS, 1 mm 4 - (2 -- Aminoetil) benzenesulfonylfluoride, HCl (AEBSF) y un inhibidor de la proteasa de propiedad combinación (1 × Complete Mini, Roche, Indianápolis, IN; utilizarse según las instrucciones). Cromatina se fragmentada a un tamaño medio de 500 bp de ultrasonidos, insoluble y restos celulares fue removido por centrifugación. La fragmentación que contenga la cromatina se diluye en 15 mM Tris-HCl, pH 8,1, con 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Tritón-X-100, 0,01% SDS, y la combinación de un inhibidor de la proteasa. Un sin seleccionar ( 'entrada') muestra del 10% del total de homogenado fue removido antes de que la selección de anticuerpos.

Chip se realizó a través de conejo anti-histonas H3 acetilado de anticuerpos (Upstate Biotechnology, Inc, Bellerica, MA, no catálogo. 06-599), que reconoce la histona H3 acetilado a lys9 y lys14. Para cada selección, 50 μ g de anti-histonas anticuerpo se juntaba a 250 μ l de anti-conejo IgG bolas magneticas (Dynal M-280), en tampón de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 8,1, con 10 mM EDTA y 1% SDS. Para no reducir determinados conocimientos, la cromatina muestra fue pre-limpiado utilizando la bolas magnéticas con el anticuerpo secundario solo. La muestra se incubaron durante la noche con el anticuerpo secundario acoplado por bolas para seleccionar la acetil-H3 complejos que contienen la cromatina. Las bolas fueron lavados durante 5 minutos a temperatura ambiente con cada una de las siguientes soluciones: 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, con 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% y Triton-X-100, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, con 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% y Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8,1, con 1 mM EDTA, 0,25 M LiCl, 1% NP-40, y el 1% deoxycholate. Sal y detergente fueron retirados por lavado dos veces con 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8. Se extrajo el ADN de la cromatina de anticuerpos complejos y muestra la entrada de calefacción en 0,1 M NaHCO 3 con 200 mM de NaCl y 1% SDS a 65 ° C durante 4 horas con agitación constante. La entrada y muestras seleccionadas fueron digeridos con proteinasa K, extracción con fenol / cloroformo, y precipitado con etanol.

En tiempo real a escala locus análisis PCR

Cromatina fragmentos recuperados de la entrada y immunoprecipitated muestras fueron ensayadas por PCR en tiempo real usando un termociclador ABI 7300 y SYBR Green detección fluorimétrica. Para pantalla de todo un gen locus, pares de oligonucleótidos fueron diseñados en 1000 a 500 pb intervalos de toda la región, seleccionados y no seleccionados y las muestras se realizaron en paralelo en una placa de 96 pocillos formato. El primer pares utilizados para locus-Chip ensayos de la NeuroD4, Msc, Tcfap2b y Gata3 loci aparecen en ficheros adicionales 5.

El enriquecimiento de la cromatina immunoprecipitated fragmentos fue ensayada por el ciclo de umbral diferencia método [41]. Por este método, PCR en tiempo real las señales se miden a través del "ciclo límite", o Ct parámetro, que es el número de ciclos necesarios para la amplificación de productos para llegar a un nivel arbitrario de intensidad de fluorescencia (umbral), y es logarítmica a la la abundancia inicial de la secuencia diana en la muestra. Para cada uno de amplificación de PCR, una Δ Ct comparando el valor no seleccionado (entrada) y los anticuerpos seleccionados de muestras de ADN se calcula restando el seleccionado Ct Ct de la señal de entrada:

Δ Ct = Ct entrada - Ct seleccionados

Doble de enriquecimiento de los valores objetivo para las secuencias obligados por la selección de anticuerpos, lo que corresponde al eje "y" el locus de chip parcelas, se calcularon utilizando la siguiente ecuación:

E = 2 (Δ Δ CT-Ctcontrol)

Debido a la formación de producto, aproximadamente duplica con cada ciclo en el rango lineal de amplificación, un Δ Ct de un ciclo representa una doble diferencia en el inicio de plantilla. Una gran ventaja de este método es que, para cada par de primers, una muestra seleccionada se compara directamente a su control no seleccionado, que sólo difiere de la de anticuerpos proceso de selección. Posibles factores de confusión tales como pequeñas diferencias en la amplificación por PCR eficiencia de los diferentes pares de primers son eliminados en esta comparación.

El Δ Ct ensayos para cada grupo de materiales seleccionados se normalizaron a una referencia arbitraria (un pliegue de enriquecimiento), determinado utilizando dos pares de primers en la región promotora de la Alb1 (locus de albúmina), que fue elegido como un control negativo porque no es transcrito en el sistema nervioso. Doble de enriquecimiento de los valores de la Alb1 locus son muy similares a los valores de los no seleccionados, las regiones intergénicas de los loci de genes objetivo. Primer pares en las regiones promotoras de Mapt (microtúbulos de proteína tau asociada) y Eno2 (enolasa neurona específica), que presentan el tejido expresión concreta en el sistema nervioso, y Gapdh (glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa), que se expresa doquier, se utilizadas como controles positivos. Las comparaciones de acetilación de histonas H3 en un determinado lugar en el DRG y TG se hicieron utilizando tres a seis veces el enriquecimiento valores utilizando pares de oligonucleótidos en una región contigua del genoma cerca de la transcripción sitio web inicial de los genes analizados loci. La significación estadística (p valores) de la diferencia de acetilación H3 se determinó a través de dos muestras, la desigualdad en diferencia t-pruebas.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Material complementario
1 de ficheros adicionales
La expresión génica diferencial en trigémino y ganglios de la raíz dorsal. Hibridación in situ muestran transcripciones expresadas diferencialmente en el trigémino y ganglios de la raíz dorsal.
2 ficheros adicionales
Aumento y Disminución de transcripciones en E13.5 DRG Brn3a de ratones knockout. Esto muestra una versión más completa del conjunto de datos presentados en el Cuadro
1
3 ficheros adicionales
Comparación directa de la expresión de genes alterados en DRG y TG Brn3a eliminatorias de los ganglios sensoriales. Expresión de genes en el DRG se analizó mediante el U74v2 serie configurado para permitir una comparación directa a un conjunto de datos antes de la TG.
4 de ficheros adicionales
Ganglios de la raíz dorsal muestra grandes indemnización por la pérdida de un alelo Brn3a. La expresión de genes se comparan los niveles de Brn3a de tipo silvestre, heterocigotos, y los ganglios del knockout para demostrar la medida en que la compensación de dosis génica reduce el fenotipo heterocigoto.
5 de ficheros adicionales
Resumen de InSitu andLocus hibridación sondas de oligonucleótidos-chip. Resumen de InSitu andLocus hibridación sondas de oligonucleótidos-chip.
Agradecimientos

Nos gustaría reconocer a Bill Wachsman y Lutfunnessa Shireen de asistencia con la tecnología de microarrays. Dr Sylvia Arber ofrecido generosamente antisueros para Runx3 y Etv1/Er81, y Islet2 antisuero fue el generoso obsequio del Dr Sam Pfaff. También queremos dar las gracias a los doctores Jean-Francois Brunet, Allan Basbaum, Ryoichiro Kageyama, Nobuyuki Itoh, Eric Olson y sus asociados para la hibridación in situ las sondas. Microarray datos utilizados en este estudio están depositados en la Expresión Génica Ómnibus, número de serie GSE5658. Apoyado en parte por el Departamento de Asuntos de los Veteranos MERIT financiación y VISN 22 MIRECC (EEG), y los premios NIH HD33442 y MH065496. EEG y NF son un NARSAD investigadores.