BMC Neuroscience, 2007; 8: 13-13 (más artículos en esta revista)

AVPV las neuronas que contienen los receptores de estrógenos-beta en ratas macho adultas se ven influidas por isoflavonas de soja

BioMed Central
Lihong Bu (neuroscience@byu.edu) [1], Edwin D Lephart (Edwin_Lephart@byu.edu) [1]
[1] Fisiología y Biología del Desarrollo y Departamento de Neurociencias Centro de la Universidad Brigham Young, Provo, UT, EE.UU.
[2] División de Medicina del Recién Nacido, Children's Hospital Boston, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Isoflavonas, los fitoestrógenos más abundante en los alimentos de soja, son estructuralmente similares a 17beta-estradiol. Se sabe que 17beta-estradiol induce apoptosis en el núcleo anteroventral periventricular (AVPV) en cerebro de rata. Además, hay pruebas de que el consumo de isoflavonas de soja reduce el volumen de AVPV en ratas macho. Por lo tanto, en este estudio, hemos examinado la influencia de la dieta isoflavonas de soja sobre la apoptosis en AVPV de 150 días de edad de sexo masculino ratas alimentadas ya sea de soja isoflavone una dieta libre de (Phyto-free) o una soja isoflavone-rica dieta (Phyto-600) .

Resultados

La aparición de la apoptosis en AVPV fue examinado por la tinción de TUNEL. La incidencia de la apoptosis es unas 10 veces mayor en los Phyto-600 grupo (33,1 ± 1,7%) que en la Phyto libre de grupo (3,6 ± 1,0%). Por otra parte, estas células apoptóticas se identificaron como las neuronas de doble tinción de inmunofluorescencia GFAP y NeuN como marcadores de astrocitos y neuronas, respectivamente. Entonces la neuronas dopaminérgicas en AVPV fueron detectados por tinción inmunohistoquímica de la tirosina hidroxilasa (TH). No se encontraron diferencias significativas en el número de neuronas TH se observó la dieta entre los grupos de tratamiento. Cuando los receptores de estrógenos (ER) alfa y beta fueron examinados por inmunohistoquímica, se observó una reducción del 22% de ERbeta-positivas en el número de células AVPV con el consumo de isoflavonas de soja, mientras que ningún cambio significativo en ERalpha-el número de células positivas fue detectado. Por otra parte, casi todas las células apoptóticas se ERbeta-inmunorreactiva (IR), pero no ERalpha-ir. Por último, inyecciones subcutáneas de equol (un metabolito principal isoflavone) que representa aproximadamente el 70-90% del total que circula en plasma isoflavone niveles no alterar el volumen de AVPV en ratas macho adultas.

Conclusión

En resumen, estos resultados proporcionan pruebas directas de que el consumo de isoflavonas de soja, pero no la exposición a equol, influye en la pérdida de ERbeta que contienen las neuronas en masculino AVPV.

Fondo

Son fitoestrógenos de origen natural, derivados de plantas, no esteroides moléculas que son estructuralmente similares a 17beta-estradiol [1]. De todos los fitoestrógenos, derivados de soja isoflavonas son las más abundantes y de roedores en la dieta humana, y el más estudiado en animales y la investigación clínica. Isoflavonas de soja dietética existir como biológicamente activo aglycones (daidzein y Genistein) y glucósidos biológicamente inactivos (principalmente daidzin y genistin). Cuando se consume, glucósidos son hidrolizado de glucosidases intestinal a daidzein y Genistein. Daidzein puede metaboliza a equol, un potente y abundante molécula en roedores [2, 3]. La semejanza estructural entre isoflavonas y 17beta-estradiol permite a estas moléculas a ejercer estrogénica moderada o antiestrogénico propiedades de mamíferos a través de los receptores estrogénicos (ER). Es bien sabido que el Genistein tiene una mayor afinidad por ERbeta que ERalpha [4]. Por otra parte, parece equol de obligar a ERbeta> ERalpha, de manera similar a la de Genistein [2, 5].

El anteroventrol núcleo periventricular (AVPV) se encuentra inmediatamente caudal al órgano vascular de la lamina terminalis y rostral a la suprachiasmatic núcleo [6]. Las células en AVPV proyecto directamente a la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) que contienen las neuronas e influyen en la secreción de hormona luteinizante (LH) en ratas [7]. El AVPV es sexualmente dimorfo, pero en contraste con otros núcleos sexualmente dimorfo, el volumen global [8], densidad de las células [9], y el número de neuronas dopaminérgicas [10] son mayores en mujeres que en hombres en edad adulta. Estas diferencias por sexo son reguladas por la testosterona secretada de la fetal / neonatal testículos. Hay dos oleadas de testosterona circulante durante las primeras etapas del desarrollo, uno alrededor del día 18 de gestación y el otro en aproximadamente 2 horas después del nacimiento [11, 12]. Dentro del hipotálamo, la testosterona puede convertirse a 17beta-estradiol por el citocromo P450 enzima aromatasa, y la 17beta-estradiol se piensa que es responsable de AVPV características más pequeñas en los hombres [13, 14]. Esta "masculinización estrogénicos" proceso puede ser manipulado por la inducción de hormonas esteroides durante el desarrollo. La administración de estradiol a ratas neonatales es tan efectivo como la testosterona para reducir el volumen de AVPV [13] de facilitar la apoptosis en los países en desarrollo AVPV [14]. La diferenciación sexual del AVPV se pensó que se limita a período postnatal temprano. Sin embargo, las características AVPV desarrollar lo más tarde 60-80 días después del nacimiento [15], y los datos más recientes sugieren que es más plástico que se pensaba anteriormente [2, 16].

A la luz de la naturaleza estrogénica de isoflavonas de soja y su capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica [17, 18], hemos estudiado los efectos de las isoflavonas de soja sobre las características de la AVPV. En dos estudios separados, se observó una disminución significativa en el volumen AVPV en ratas macho adulto consume un soja isoflavone dieta rica en comparación con los animales alimentados con soja isoflavone una dieta libre de [2, 16]. Sin embargo, no se sabe si isoflavonas de soja actuar de manera similar a la 17beta-estradiol para modificar el volumen de AVPV de influir en la apoptosis o si equol contribuye a la alteración del volumen AVPV. Por lo tanto, en este estudio se analizó la influencia de la dieta isoflavonas de soja sobre la apoptosis en las ratas macho adulto, de cuantificar su incidencia, la identificación de tipo de células involucradas, y el estudio de su correlación con los subtipos de receptores de estrógeno. Por último, el volumen de AVPV se cuantificó en ratas macho adultas después de la exposición a equol sólo, una importante biológicamente activos isoflavone metabolito.

Resultados
El consumo de isoflavonas de soja induce la apoptosis en AVPV

Los efectos de la dieta isoflavonas de soja sobre la apoptosis en AVPV fueron examinados por la tinción de TUNEL en las secciones coronal del cerebro, identificado como un grupo de células en el nivel rostral del tercer ventrículo (Figura 1]. El número total de células en AVPV no fue significativamente alterado en el Phyto-600 alimentado ratas macho (123,4 ± 3,3) en comparación con la Phyto libre de animales alimentados (116,0 ± 3,5; Tabla 1]. Sin embargo, el total de número de células apoptóticas en el Phyto-600 AVPV (38,4 ± 2,4) fue significativamente mayor que el de la libre Phyto-grupo (4,4 ± 1,2; Tabla 1, Figura 1]. Por otra parte, la incidencia de la apoptosis, calculada como un porcentaje de la población total de células, es unas 10 veces mayor en los Phyto-600 grupo que en la Phyto libre de grupo (Cuadro 1].

Cuando las densidades de células dentro del AVPV se calcularon, las ratas a las Phyto-600 dieta está representada significativamente mayor el número de células por unidad de superficie que los animales en la Phyto dieta libre de (Figura 2A]. Curiosamente, después de contabilidad para la incidencia de la apoptosis, las diferencias significativas entre la dieta de los grupos de tratamiento para las densidades de células desaparecido (Figura 2B].

La apoptosis inducida por isoflavonas de soja son las neuronas

Para determinar si las neuronas o neuroglia cuenta de la apoptosis en las células AVPV observó anteriormente, que hemos detectado los marcadores de astrocitos (GFAP) y neuronas (NeuN) en los sectores adyacentes de Phyto-600 alimentado ratas macho, que fueron 6 micrómetros aparte de la TUNEL manchadas secciones. Más del 90% de las células apoptóticas Estuvieron presentes en ambas secciones consecutivas. Por lo tanto, de localizar a las células apoptóticas (coloración marrón nuclear en TUNEL) a las fotomicrografías de doble GFAP / SI tinción NeuN (neuronas fueron teñidas en verde y que se astrocitos rojo), las células apoptóticas se identificaron como las neuronas (Figura 3].

El número de neuronas dopaminérgicas en AVPV no se ha alterado de isoflavonas de soja

Tirosina hidroxilasa ha demostrado ser un marcador fiable para las neuronas dopaminérgicas en AVPV aunque hay relativamente pocas células TH en este sexualmente dimorfo estructura. Neuronas dopaminérgicas en AVPV se detectaron con tinción inmunohistoquímica de TH en 10 días de edad, masculino y femenino y 150 días de edad ratas alimentadas con la fitosanitarias dieta libre y 150 días de edad los varones o bien se alimenta de Phyto-libre o Phyto-600 dieta. Independiente del tratamiento dietético, se observó un número significativamente mayor de neuronas TH en mujeres (aproximadamente 4 veces superior) que en los varones alimentados Phyto la dieta libre de tanto en las edades. Sin embargo, no hubo diferencia significativa en el escaso número de neuronas TH se observó en ratas macho con la exposición a largo plazo para la dieta isoflavonas de soja (Phyto-600) en comparación con el Phyto-libre alimentado los hombres (Figura 4].

Las neuronas apoptóticas expresar ERbeta, pero no ERalpha

La expresión de ERalpha y ERbeta se detectó en las secciones coronal del cerebro que contienen AVPV, que fueron 6 micrómetros aparte de las secciones teñidas TUNEL. ERalpha y ERbeta inmunoreactividad se expresa en núcleos celulares de la AVPV (coloración marrón nuclear; Figura 5 y 6]. En AVPV, el número de ERalpha-ir y ERbeta-ir núcleos counterstained total y número de células fueron contados. La proporción de ERbeta-ir en células AVPV, expresado como porcentaje del número total de células, fue del 52,8 ± 0,6% en el Phyto-600 animales alimentados. Esto representa una reducción del 22% si se compara con la Phyto libre de valores (67,5 ± 1,0%; datos no se muestran en el gráfico, muestra dos "t" de Student, p <0,001). No se observaron diferencias significativas en el número de ERalpha-ir en células AVPV se observaron entre los Phyto-600 grupo (64,1 ± 1,3%) y fitosanitarias libre de grupo (64,7 ± 1,2%). Por otra parte, de localizar a las células apoptóticas en las secciones de ERalpha y ERbeta tinción IHC, la mayoría de las células apoptóticas se ERbeta-ir, pero no ERalpha-ir (Figura 5 y 6]. En Phyto-600 ratas alimentadas, TUNEL-positivas las células representan aproximadamente el 84% de la ERbeta-ir dentro de las células AVPV. Un diagrama esquemático se muestra en la Figura 7 representa el número total de células en el AVPV en relación con el número total de ERbeta-ir y células TUNEL células teñidas. Por último, comparando ERalpha y ERbeta IHC secciones, hemos observado que algunas células únicamente expresar ERalpha o ERbeta. Sin embargo, algunas células expresan tanto ERalpha y ERbeta (Figura 8].

La exposición a equol (un metabolito principal isoflavone) no altera el volumen de AVPV

A fin de probar si equol es la molécula que causa los efectos observados anteriormente, o el control equol (DMSO) vehículo se inyectó por vía subcutánea en adultos del sexo masculino ratas alimentadas Phyto la dieta libre de. El equol inyección se le dio tratamiento durante 25 días consecutivos. El suero de los niveles circulantes equol fueron equivalentes a un consumo de fitoestrógenos de soja rica en la dieta (@ aproximadamente 1000 ng / ml) [2]. Curiosamente, no hubo alteraciones significativas en AVPV volumétrica parámetros morfométricos con la exposición a equol (Figura 9]. Así, la exposición únicamente a equol no es suficiente para alterar la hormona sensible a hipotalámico volumen (AVPV) en ratas macho durante la edad adulta que es contrario al consumo de soya (fitoestrógenos) a través de las rutas alimentarias por un equivalente de exposición intervalo observado previamente por nuestro laboratorio [ 2, 16].

Discusión

Este estudio demuestra directamente que a largo plazo la exposición a la dieta isoflavonas de soja induce la apoptosis neuronal en el AVPV de las ratas macho adultas. Además, los datos actuales sugieren que la influencia de isoflavonas de soja en la apoptosis neuronal no está correlacionada con ERalpha pero depende de ERbeta. Sin embargo, la exposición a equol no es suficiente para alterar el volumen de AVPV.

Las neuronas en el AVPV nacen entre la gestación y el día 13 de gestación día 18 [19]. Ni neurogénesis [20] ni la migración neuronal [21] Se ha informado que desempeñar un papel en el desarrollo de dimorfismo sexual en la zona preoptic. Sin embargo, se ha demostrado que la apoptosis es la principal forma en que alteran las hormonas esteroides neuronal en números sexualmente dimorfo regiones en los períodos críticos del desarrollo [14, 22]. Este período crítico para la diferenciación sexual fue revisado a ser más largo que el período y la primera semana postnatal ventana [15], y el volumen de los núcleos sexualmente dimorfo todavía puede ser modificado por la exposición a las moléculas estrogénicos en adultos [2, 16]. Por lo tanto, es novela, pero no sorprendente, para observar la incidencia significativamente mayor de la apoptosis en las AVPV de las ratas macho adultas que consumen isoflavonas de soja, a través de sus acciones estrogénica. En general, TUNEL es un bien aceptada técnica para la detección de células apoptóticas de visualización de la fragmentación del ADN [23]. Las células con daño en el DNA también pueden ser identificadas por tinción TUNEL. De este modo, el TUNEL-células positivas en este estudio incluyen en apoptosis y posiblemente células en el proceso de reparación del ADN [24]. Por otra parte, estos TUNEL-positivas las células fueron identificadas como las neuronas. Esta es la primera evidencia directa de isoflavonas de soja inducir la apoptosis neuronal en AVPV en vivo. Por otra parte, teniendo la mayor densidad celular y el similar número total de células en el Phyto-600 AVPV secciones en conjunto, estos datos implícita AVPV volúmenes más pequeños en el Phyto-600 vs el grupo Phyto libre de grupo, lo cual es coherente con nuestros hallazgos anteriores [ 2, 16]. Consecuencias para la salud humana y la reproducción son desconocidos, sobre todo teniendo en cuenta la capacidad reproductiva de las poblaciones de Asia parece ser no se ven afectados por el consumo de alimentos de soya [25].

Se sabe que el número de neuronas dopaminérgicas en AVPV es 3-4 veces mayor en las ratas hembras adultas que en hombres [26]. Aunque las neuronas TH sólo contribuyen aproximadamente el 1% del número total de células en el hombre AVPV (comunicación personal con EM Aguas de permiso), no hubo diferencia significativa en el número de neuronas TH se observó en ratas macho adulto entre los grupos de tratamiento. Hay pruebas de que circulan gonadal esteroides parecen downregulate TH expresión en hombres y mujeres AVPVs [27]. El desarrollo de TH sexualmente dimorfo neuronas no se ve afectada por la sobreexpresión de Bcl-2 [28] o la supresión de Bax [29], pero depende de ERalpha [30]. La falta de cambios en el número de neuronas TH en los varones (presente estudio) y mujeres (nuestros datos no publicados) con ratas a largo plazo la exposición a isoflavonas (Phyto-600) sugiere que la apoptosis neuronal puede ser independiente de ERalpha. Por otra parte, la incidencia de la apoptosis fue de aproximadamente el 33% y el ratio de ERalpha-ir células sobre el total de células en AVPV fue de aproximadamente el 64% en el Phyto-600. Por otra parte, en este caso, la apoptosis no se ERalpha-ir. Esto sugiere que ERalpha no participa en la apoptosis por el consumo de isoflavonas de soja.

La co-localización de ERbeta y la fragmentación del ADN implica ERbeta Mayo mediar la apoptosis neuronal inducida por isoflavonas de soja en masculino AVPV. Esto es coherente con varias líneas de evidencia. En primer lugar, tanto ERalpha y ERbeta se ha informado de que se expresen en el AVPV [31 - 33]. La expresión de ERbeta es sexualmente dimorfo en los roedores. En ratones, las hembras un número significativamente mayor de ERbeta de células positivas se coloca en la parte medial de la AVPV cerca de tercer ventrículo; en los hombres la distribución de ERbeta de células positivas fueron dispersados a lo largo del AVPV [32]. La apoptosis observada en el Phyto-600 AVPVs no muestran un patrón específico, en otras palabras, similar a la expresión de ERbeta en masculino AVPV. En segundo lugar, se ha informado de que el estrógeno reguladas desarrollo neuronal apoptosis está determinada por el subtipo ER: ERalpha tiene un efecto neuroprotector, ERbeta médica, mientras que la inducción de apoptosis en las células neuronales [34]. En tercer lugar, las neuronas dopaminérgicas expresar ERbeta en la femenina AVPV, pero no en los hombres [32]. Esto favorece que en parte ERbeta-expresando neuronas dopaminérgicas a través de la apoptosis en los hombres en presencia de testosterona / estrógenos, pero no en las hembras. Por el contrario, las mujeres en estas células se cree que sobreviven. En cuarto lugar, ERalpha y ERbeta son coexpressed en algunas células en AVPV [35]. Cuando coexpressed, ERalpha y ERbeta forma funcional heterodimers [36]. A pesar de que la función biológica de ERalpha / beta heterodimers a la presencia de cada uno de los respectivos homodimer se desconocen, ERbeta exhibe una acción inhibitoria sobre ERalpha mediada por la expresión de genes y en muchos casos se opone a las acciones de ERalpha [36]. Además, se observó más ERbeta-ir a más células en apoptosis en AVPV. Por lo tanto, las neuronas que especular coexpressed ERalpha y ERbeta pueden escapar la apoptosis, mientras que aquellos que expresan ERbeta sólo son sensibles a la señal estrogénica y la fragmentación del ADN puso de manifiesto. Por último, aunque isoflavonas son menos potente que la 17beta-estradiol, las concentraciones plasmáticas de Genistein (117 ± 5 ng / ml) y equol (1363 ± 59 ng / ml) en el Phyto-600 alimentado ratas macho son mucho mayor que la de 17beta - estradiol (1-5 pg / ml) [25]. El promedio total isoflavone contenido en el hipotálamo es más de 3 veces más altos que para Phyto-600 alimentado los hombres (134 ng / g) vs fitosanitarias libre alimentado hombres (40 ng / g) [17]. Por otra parte, isoflavonas poseen una mayor afinidad por ERbeta que ERalpha [4]. Por lo tanto, la influencia de isoflavonas es suficiente para causar una variedad de efectos biológicos a través de los receptores estrogénicos, especialmente ERbeta. Estamos especular que el Genistein u otros isoflavone molécula (s) pueden ser responsables del aumento de la apoptosis neuronal observada en este estudio.

Es intrigante considerar las siguientes hipótesis en cuanto a cómo la dieta de soja isoflavonas modulan AVPV celular características y volumen a través de ERbeta. En primer lugar, está bien establecido que los estrógenos disminución en los volúmenes AVPV pre y postnatal, desarrollo [37]. En segundo lugar, es también bien establecido que la aromatasa enzima citocromo P450 (que convierte los andrógenos a estrógenos) está presente en neuronal hipotalámico y regiones que la aromatasa expresión del mRNA y los niveles enzimáticos aromatasa descenso con el aumento de la edad postnatal, sobre todo después de la pubertad, en comparación con el desarrollo prenatal intervalo [38]. Por lo tanto, aunque hay abundantes esteroides sustrato de los testículos (es decir, la testosterona) durante la edad adulta, los niveles de aromatasa hipotalámico disminución de más de 50 veces en comparación con los niveles de atención prenatal. Esto reduce drásticamente la biosíntesis de estrógenos. De esta manera, el consumo de un isoflavone dieta rica (Phyto-600) aumenta la concentración de estrógenos-como las moléculas en la circulación y en el hipotálamo (véase más arriba). Por lo tanto, esto sugiere que hay muy bajos niveles de estrógenos endógenos están formando dentro de las regiones hipotalámico, aunque muy alto de estrógeno circulante-como isoflavone moléculas que tengan la capacidad de obligar a ERbeta cuenta para el aumento de la apoptosis en las AVPV de Phyto-600 machos alimentados , Muy poco frente a la apoptosis es como se ve en la AVPV de Phyto-alimentados hombres libres. En comparación con la "masculinización estrogénicos" durante el desarrollo masculino AVPV, la "dieta phytoestrogenic masculinización" es probable que sea un mecanismo subyacente a la pérdida de ERbeta que contienen las neuronas se observó en estas ratas macho adultas. Aunque no es seguro que el aumento de muerte celular en adultos del sexo masculino AVPV es beneficiosa, sino que podría ser especuló que no es perjudicial. La influencia de la dieta isoflavonas en la apoptosis fue estudiada en el presente estudio a 150 días de edad cuando las características de AVPV han sido plenamente desarrollado mientras que el volumen de AVPV se informó de que se verán afectados por el tratamiento dietético. Más investigación en las diferentes etapas de desarrollo es esencial para estudiar la forma en isoflavonas influencia neuronal apoptosis.

Por último, un montón de información en la literatura muestra que la investigación convencional y los enfoques de desarrollo no plenamente aislar o identificar los productos químicos de síntesis de análogos de bien conocidas plantas medicinales chinas [39]. No es de extrañar que la inyección de equol, con nivel equivalente de exposición y los intervalos para la dieta el consumo descrito anteriormente, no alteró la hormona sensible a los volúmenes hipotálamo en ratas durante la edad adulta. Esto indica que varios factores o una combinación con el Genistein puede ser obligado a alterar las estructuras cerebrales sensibles a la rata modelo.

Conclusión

El presente experimentos demuestran que el consumo de isoflavonas de soja 1) induce la apoptosis neuronal y / o fragmentación de ADN en el AVPV de las ratas macho adulto, 2) el número de ERalpha dependientes de las neuronas dopaminérgicas no es alterado por la dieta tratamientos, y 3) casi todas las células apoptóticas son ERbeta-ir, pero no ERalpha-ir. Sin embargo, la exposición a equol no altera AVPV volumen. En resumen, estos resultados proporcionan pruebas directas de que el consumo de isoflavonas de soja influye en la pérdida de ERbeta que contienen las neuronas en masculino AVPV.

Dado que la dieta de soja contenido no suele ser considerada como una variable experimental, los futuros diseños de investigación debería tener en cuenta este potencial importante y generalizada factor hormonal.

Métodos
Dietética tratamiento

Long-Evans ratas (12 varones y 16 mujeres) fueron adquiridos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, EE.UU.) a 50 días de edad de cría. Estos animales fueron enjaulados individualmente y alojados en la Universidad Brigham Young Bio-Ag vivero y mantenido en un 11 horas de oscuridad y 13 horas de luz calendario (se enciende en 0600-1900). El uso de los animales y los métodos de este estudio fueron aprobadas por el Instituto de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) en Brigham Young University (BYU).

A su llegada todos los animales se les permitió el acceso ad libitum al agua y una dieta comercialmente disponible con los niveles de alta fitoestrógenos (Harlan Teklad roedores Dieta 8604, Madison, WI, EE.UU.), que contiene aproximadamente 600 ppm de isoflavonas de soja (denominado en lo sucesivo Phyto-600 dieta), o una dieta personalizada (Ziegler Bros, Gardner, PA, EE.UU.), que contiene aproximadamente 10-15 ppm de isoflavonas de soja (denominado en lo sucesivo fitosanitarias dieta libre) [40]. El contenido y composición de nutrientes de estas dietas se describe en detalle en otra parte [40]. Las dietas son equilibradas y acompañado de porcentaje equivalente contenido de proteínas, hidratos de carbono, grasas, aminoácidos, vitaminas y minerales, etc [40]. Fitoestrógenos que circulan los niveles séricos de ratas mantenido en estas dietas se han reportado previamente por nuestro laboratorio con GC / MS análisis [2, 16, 18, 40]. Los animales fueron tiempo se aparearon en el marco de sus respectivas dietas a fin de que la descendencia de estas parejas estaría expuesta únicamente a cualquiera de los Phyto-600 o fitosanitarias dieta libre.

Brain preparación de la muestra

En aproximadamente 150 días de edad, los hijos varones (n = 5) de la dieta de tratamiento fueron profundamente anestesiados con una mezcla de ketamina / acepromazine (75/2.5 mg / kg IP) y transcardially perfundido con solución salina isotónica y, a continuación, el 10% formalina tamponada. El total del cerebro fue inmediatamente retirado del cráneo y se almacenan en un 10% formalina tamponada durante 14 días y 10% de sacarosa durante una semana antes de ser embebidos en parafina. Coronal secciones del cerebro estaban dispuestos a 6 micrómetros con un micrótomo. El AVPV se encuentra mediante el uso de hitos como la comisura anterior y el tercer ventrículo. A continuación, las secciones exactamente en el mismo plano de diferentes animales fueron procesados para su ulterior comparación entre los animales se describen a continuación.

Tinción TUNEL

Para detectar la apoptosis en AVPV, NeuroTACSTM II (un kit de reactivos para la detección in situ de apoptosis en el tejido neural; Cat # 4823-30-K) fue adquirido de Trevigen, Inc (Gaithersburg, MD, EE.UU.). NeuroTACS II utiliza Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TDT) para incorporar nucleótidos con biotina en los lugares de ADN pausas que son característicos de la apoptosis. El deparaffinized diapositivas fueron teñidos de acuerdo con la dirección del fabricante. En pocas palabras, el cerebro secciones se rehidratada en ethanols y permeablized. Peroxidasa endógena se inactiva por el 3% de peróxido de hidrógeno. Las secciones fueron incubadas en una cámara de humedad relativas al etiquetado de reacción a 37 ° C durante 1 h, luego con streptavidina HRP durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se desarrollaron con Diaminobencidina (DAB) y counterstained con hematoxilina. Después de la deshidratación, las diapositivas se coversliped con Permount (Cat # 26905, Richard Allan-científico, Kalamazoo, MI, EE.UU.).

Las muestras fueron vistos con un microscopio Olympus BX61 utilizando 40 × objetivos. TUNEL-positivas en apoptosis mostraron una coloración marrón nuclear. El número total de células counterstained en AVPV en una sola sección se había contado (n = 5). A continuación, el número total de células apoptóticas en AVPV en la misma sección se registró. Además, la incidencia acumulada total de la apoptosis se calcula como un porcentaje de la población total de células. Entonces la densidad celular del AVPV se calculó contando el número de células en 2 campos más condensada de 100 × 100 μ m AVPV dentro de cada sección y se expresan como el número de células por 10000 μ m 2. Para cada grupo, un total de 6 medidas sobre la densidad celular se realizaron.

Doble inmunofluorescencia (IF) tinción de GFAP y NeuN

Después de la tinción de TUNEL, el adyacentes fueron teñidos con la doble tinción de inmunofluorescencia GFAP y NeuN (los marcadores de astrocitos y neuronas, respectivamente). GFAP (glial fibrilar ácida de proteínas), el principal constituyente de filamentos intermedios de los astrocitos, se encuentra en el citoplasma y apéndices. NeuN (núcleos neuronales) se encuentra sólo en las neuronas. El deparaffinized rehidratada y secciones se microwaved en 10 mM buffer citrato de sodio (antígeno de recuperación) a plena potencia (900 W) por 1 min, seguido por 9 min a la mitad de potencia y 20 minutos para enfriar. Después de haber sido bloqueado en el 3% de suero de cabra en PBS durante 1 h, las secciones fueron incubadas en una cámara de humedad a 4 ° C la noche a la mañana con los anticuerpos primarios, un conejo anti-GFAP (1:1000, Cat # AB5804, Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.) y un ratón anti-NeuN (1:100, Cat # MAB377, Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.). Las secciones fueron luego enjuagar tres veces en tampón fosfato salino (PBS) por 5 minutos cada uno y se incubaron en una cámara de humedad durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundaria, una medida de color rojo fluorescente-Alexa Fluor 633 marcado tinte de cabra anti-IgG de conejo (1:200; Cat # A-21072, Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.) y un brillante verde fluorescente-Alexa Fluor 488 marcado tinte de cabra anti-ratón IgG (1:200; Cat # A-11070, sondas moleculares, Eugene, Oregón, EE.UU.). A continuación, las muestras fueron enjuagarse en PBS tres veces durante 5 minutos cada uno y montadas con Fluoromount-G (Cat # 0100-01, en el sur de Biotecnología Associates, Inc, Birmingham, AL, EE.UU.). Dual-inmunofluorescencia muestras se analizaron en alta potencia (60 × lente objetivo; petróleo), con una Olympus FluoView FV300 microscopio confocal (Minneapolis, MN, EE.UU.), utilizando argón azul (488 nm) y láser de Helio Neon rojo (633 nm) laser.

Inmunohistoquímica (IHC) tinción de tirosina hidroxilasa (TH)

Como se ha descrito anteriormente para la tinción de inmunofluorescencia, el antígeno fue recuperado por incubación a 10 mM citrato de sodio de amortiguación y peroxidasa endógena se inactiva por el 3% de peróxido de hidrógeno. A continuación, las muestras fueron bloqueadas en el 3% de suero de cabra en PBS e incubadas a 4 ° C la noche a la mañana en la enseñanza primaria de anticuerpos solución de cabra anti-TH (1:500, Cat # AB152, Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.), que fue localizada con biotina una cabra anti-conejo IgG (1:500, Cat # AP132P, Chemicon, Temecula, CA, EE.UU., 1 h a temperatura ambiente). Tinción (DAB), counterstaining (hematoxilina), montaje y visionado fue la misma que se describe para la tinción de TUNEL.

Inmunohistoquímica (IHC) de la tinción del receptor de estrógeno (ER) alfa y beta

Como se ha descrito anteriormente para TUNEL y TH IHC tinción, las secciones se deparaffinized, rehidratada y permeablized, seguida por la recuperación de antígenos en buffer citrato de sodio y la inactivación de peroxidasa endógena en el 3% de peróxido de hidrógeno. Después de haber sido bloqueado en el 3% de suero de cabra en PBS durante 1 h a temperatura ambiente, las secciones fueron incubadas en una cámara de humedad a 4 ° C la noche a la mañana con conejo anti-ERalpha (1:1000, Cat # 06-935, Upstate, Lake Placid , NY, EE.UU.) o al conejo anti-ERbeta (1:100, 10 μ g / ml, Cat # 06-629, Upstate, Lake Placid, NY, EE.UU.; estos anticuerpos han sido empleados anteriormente con métodos validados [41, 42]. Immunoparticipate fue visualizado por un Elite ABC kit y los métodos de DAB (Cat # PK-6101 y Cat # SK-4100, respectivamente, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Counterstaining (hematoxilina), montaje y visionado fue la misma que se describe para TUNEL tinción.

ER-positivo en apoptosis mostraron una coloración marrón nuclear. El número total de células counterstained en AVPV en una sola sección se había contado (n = 5). A continuación, el número total de ER-positivo en las células AVPV en la misma sección se registró. Por último, el porcentaje de ER-células positivas del total de células en AVPV se calculó para cada animal. Controles negativos para el etiquetado de todos los estudios fueron llevados a cabo por omitir TDT (TUNEL) o los anticuerpos primarios.

Equol inyección tratamiento

Hombre Long-Evans ratas a 50 días de edad fueron puestos en el fitosanitarias dieta libre. A 150 días de edad, las ratas fueron agrupados por el peso corporal y, a continuación, divididos en equol y control de los grupos de tratamiento (n = 4). En 190 días, las ratas recibieron diariamente sc (0,1 cc) inyecciones de control de vehículo (DMSO) o equol en aprox. 2,5 mg / Kg durante 25 días consecutivos. En 215 días de edad los animales fueron sacrificados, la sangre se recogió por equol los niveles; los cerebros procesan a través de la tinción estándar y se analizaron a través de Bioquant ® para AVPV parámetros morfométricos de los tratamientos [2, 16]. Los niveles séricos de equol fueron equivalentes a consumir Phyto-600 dieta.

El análisis estadístico

Todos los datos se expresaron como media ± SEM y se pusieron a prueba de 2-muestra "t" de Student en Minitab. Los valores se considera significativamente diferente si p <0,05.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

LB y EDL estuvieron involucrados en el diseño experimental, la realización del protocolo de investigación, el tejido y la recopilación de datos y redacción del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Philip Nibley Nance y Brand por su ayuda en el equol experimento. Esta labor fue apoyada, en parte, por donación de la USDA (2002-00798 y 2004-01800; EDL) y el Decano de la BYU de Becas de Postgrado en Neurociencias (LB).