Neural Development, 2007; 2: 2-2 (más artículos en esta revista)

Direct no de células autónomas Pax6 ojo regula la actividad de desarrollo en el pez cebra

BioMed Central
Brigitte Lesaffre (brigitte.lesaffre @ ens.fr) [1], Alain Joliot (alain.joliot @ ens.fr) [2], Alain Prochiantz (alain.prochiantz @ ens.fr) [1], Michel Volovitch (michel. volovitch@ens.fr) [1]
[1] Desarrollo y Neurofarmacología, CNRS UMR 8542 y la Ecole Normale Supérieure, rue d'Ulm, 75230 París Cedex 05, Francia
[2] Homeoprotein biología celular, CNRS UMR 8542 y la Ecole Normale Supérieure, rue d'Ulm, 75230 París Cedex 05, Francia

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Resumen
Fondo

Modificaciones en Pax6 homeogene expresión fuerte los ojos producir fenotipos. Esto nos sugiere que el desarrollo del ojo podría ser un modelo apropiado para verificar si homeoprotein intercelular paso tiene importantes funciones en el desarrollo temprano. Al igual que en otros homeoproteins, Pax6 tiene dos dominios que permiten la secreción y la internalización de células vivas y, por tanto, el paso intercelular. En principio, una simple manera de probar la hipótesis sería la de mutar una de las dos secuencias para producir una "célula autónoma solamente 'Pax6. Sin embargo, ello no fue posible debido a que estas secuencias están en el homeodominio y su modificación afectaría a las propiedades Pax6 transcripcional. Por lo tanto, hemos desarrollado un enfoque destinado a bloquear Pax6 sólo en el medio extracelular desarrollo de los embriones de pez cebra.

Resultados

Una primera estrategia consiste en inyectar una célula del embrión con un mRNA secretada una codificación única cadena de anti-anticuerpos Pax6. La segunda, complementaria, la estrategia fue inyectar un anticuerpo Pax6 en la blástula medio extracelular. En ambos casos, 'dissymmetric ojos',' un ojo sólo »y« no ojo "fenotipos se produjeron. En la mayoría de los casos, lente fenotipos paralelo retina malformaciones. Aunque ojo fenotipos se analizaron 30 horas después de la fecundación, existe una fuerte correlación entre los principios de asimetría ocular sobre el terreno, a principios de asimetría en Pax6 expresión-y más tarde se producen malformaciones del ojo. Varios controles fueron introducidos, lo que demuestra que el efecto es específico de Pax6 y no puede explicarse por las actividades de anticuerpos intracelulares.

Conclusión

Este estudio apoya la hipótesis de que el Pax6 factor de transcripción es también una molécula de señalización directa con la no actividad de células autónomas.

Fondo

Ojo formación es uno de los más populares modelos utilizados para estudiar el desarrollo y la evolución de los sistemas sensoriales [1]. Existen similitudes entre los aparatos de visión a través de las especies, dando lugar a las dos hipótesis de evolución convergente versus monofilético origen [2]. Este sistema también se usa ampliamente para la inducción estudios debido a las interacciones inductivos que tienen lugar entre neuronales y no-tejidos neuronales en el curso del desarrollo del ojo. Spemann fue el primero en proponer que la interacción entre el pliegue neural y el ectodermo superficial se encuentra en el origen de la inducción de la lente de formación [3 - 5]. Esta inducción entre los dos tejidos ha sido impugnada y se ha insinuado que todas las especies no podrán utilizar idénticas estrategias para desarrollar un aparato visual [6 - 8]. A pesar de que estos evolutivo y de desarrollo no están totalmente resueltos, ahora es ampliamente aceptado que comparte ciertas vías genéticos desempeñan importantes funciones en el desarrollo de la visión a través de especies.

El principal avance en la comprensión de cómo el ojo se ha desarrollado y desarrolla ha llegado de análisis genético, en particular la identificación de Pax6 como un factor de transcripción clave para la formación de los ojos [9]. De hecho, Pax6 pérdida de la función, total o parcial, conduce al desarrollo anormal del ojo en todas las especies, incluida la humana [2, 10 - 12]. Por el contrario, excesivamente alta expresión conduce a la malformación del ojo [13 - 16] o para la formación de espectaculares ojos ectópico [17, 18]. La expresión de Pax6 en el 'aparato de visión "de todas las especies, así como la posibilidad de inducir la formación de ojos en la mosca de expresión de Pax6 de vertebrados, también apoya firmemente la idea de que, a pesar de las múltiples variaciones sobre el tema, existe una vía genética común en el que Pax6 o Pax6-al igual que los genes desempeñan un papel importante [19, 20].

Curiosamente, Pax6 se expresa en tanto neural y epitelios de superficie que dan a luz a la retina y la retina adecuada epitelio pigmentario (RPE) para los primeros y al lente y la córnea para este último. Esto plantea dos cuestiones principales relativas, en primer lugar, la medida de la retina dentro del territorio neural veces y, en segundo lugar, los mecanismos de inducción entre el tejido neural y el epitelio de superficie (lente de inducción). En ambos casos, se ha comprobado que la genética vías de referirse a varios factores de transcripción y factores de crecimiento del factor de crecimiento Fibroblasto (FGF) y de proteína morfogenética ósea (BMP) las familias [5, 21 - 26].

En el presente estudio, hemos querido investigar la posibilidad de que Pax6 podría actuar como una célula autónoma factor de transcripción [5] y no de células autónomas de señalización factor [27, 28], capaz de inducir la expresión Pax6 intercelular tras el paso [29 - 32 ]. La posibilidad de que un factor de transcripción pueden tener células autónomas y no de células autónomas actividad se origina a partir de la presencia en el homeodominio de la mayoría de homeoprotein factores de transcripción, incluido el Pax6, de dos breves secuencias que permiten la secreción y la internalización y, por tanto, el paso intercelular [33 - 35]. Sobre la base de los fenotipos obtenidos a raíz de la expresión in vivo de anticuerpos Pax6 en el espacio intercelular, proponemos que, además de regular otros inductores y factores de crecimiento, Pax6 actúa como una molécula de señalización durante el desarrollo del ojo.

Resultados

La presencia en el Pax6 secuencia de los dos pequeños dominios que permite homeoprotein la internalización y la secreción (Figura 1a] [33] nos llevó a investigar Pax6 intercelular paso. Como se muestra en la Figura 1b-d, transferencia intercelular de Pax6-COS transfectadas las células hacia las células HeLa fueron verificados por la cuantificación de Pax6 de detección de receptores dentro de las células HeLa.

En principio, la más elegante manera de identificar homeoprotein no de células autónomas actividades en vivo sería sustituir el gen endógeno de una versión mutada de transferencia intercelular. Esto es, lamentablemente, imposible porque los dos tipos de transporte, las secuencias que deberían ser mutado están dentro de la ADN-vinculante de dominio (homeodominio), y, por tanto, también instrumental para las actividades de células autónomas. Es por ello que hemos desarrollado una estrategia basada en la posibilidad de utilizar específicas de lucha contra la Pax6 anticuerpos para atrapar este factor de transcripción, ya que viaja entre las células.

Se ha utilizado la inmunoglobulina ligeras y pesadas cadenas expresadas por los anti-Pax6 hibridoma para clonar un cDNA de codificación de un anti-Pax6 única cadena de anticuerpos. Dos versiones se hicieron, con diferencias por la ausencia (aP6) o presencia (spaP6) la secreción de un péptido señal. Como se muestra en la Figura 1f, spaP6 obtiene acceso a la Golgi y está presente dentro de vesículas, lo que muestra una distribución notablemente diferente del de su no-homólogo secretada, aP6, que se detecta en todo el citoplasma (Figura 1e]. Figura 1e, f también pone de manifiesto que, en contraste con aP6, spaP6 está ausente en el núcleo, lo que sugiere que muy pocas moléculas de anticuerpos, en su caso, escapar de la secreción de la vía. Para verificar la actividad de transferencia de bloqueo de los anticuerpos, lo primero que añade la monoclonales anti-Pax6 de anticuerpos, o de un anticuerpo monoclonal anti-myc anticuerpo como control, en el medio de co-cultivadas Pax6-expresando COS-7 y las células marcadas células HeLa ( véase Materiales y métodos). Figura 1g ilustra que Pax6 anti-anticuerpos en el medio de cultivo reducir significativamente la transferencia intercelular entre expresar y no expresar las células, en comparación con el control. Luego co-cultivos de células HeLa marcados con COS-7 células co-expresando Pax6 y secretada sola cadena anti-Pax6 (spaP6) o anti-Engrailed (spaEn) anticuerpos. Figura 1h ilustra que spaP6, y no spaEn, bloques Pax6 transferencia.

El anticuerpo monoclonal anti-anticuerpos Pax6 se habían producido contra el amino-terminal de Pax6 de dominio, el cual es altamente conservadas en todas las secuencias de Pax6. Habiendo verificado que este anticuerpo reconoce pez cebra Pax6 proteínas (no se muestra), un tope de codificación único mRNAs cadena de anticuerpos fueron inyectados en los embriones de pez cebra en la fase de una célula. Ojo morfologías observó 30 horas después de la fecundación (HPF) y inducida por el secretado de lucha contra la Pax6 única cadena de anticuerpos (spaP6) se ilustra en la Figura 2a-f. El principal fenotipo observado una disminución en el tamaño del ojo, ya sea simétrica (como en la figura 2b] o asimétrica (figura 2c]. En casos extremos, nos hemos percatado de la ausencia de un ojo (Figura 2d], o incluso de ambos ojos (Figura 2e]. Cyclops También se observó (Figura 2f], pero el porcentaje de animales con este fenotipo fue similar, con independencia de la naturaleza del ARNm se inyecta en el óvulo (Figura 2g]. En experimentos de control (spaEn), el 91% de los embriones habían simétrica ojos, el 3% mostró disimetría y el 6% se Cyclops (Figura 2g, izquierda). En fuerte contraste, la expresión in vivo de spaP6 dado lugar a una diez veces mayor (40% de los embriones) en el número de dissymmetric ojos o pequeños ojos, sin cambios significativos en el número de Cyclops (Figura 2g, a la derecha).

Debido a que el ojo este último podría dar lugar a fenotipos de la actividad de células autónomas de anticuerpos spaP6 escapar de la secreción de la vía, se compararon los efectos de la inyección de spaP6 y aP6 tope mRNAs. Figura 2 g (medio) demuestra que los anticuerpos privados de péptido señal también tienen un efecto sobre el desarrollo del ojo, pero que este efecto (15% de los embriones muestran disimetría ojo) es significativamente menor que el de secretada anti-Pax6. La diferencia significativa entre aP6 y spaP6 inducida por fenotipos no son consecuencia de las diferencias en la expresión como se ilustra en la Figura 2 horas, en el que las cantidades de anticuerpos expresadas en la gastrulación se comparan. Lo más probable es que la diferencia entre aP6 y spaP6 inducida por fenotipos se debe a la conocida inestabilidad de muchos intracelular de anticuerpos después de disulfuro de bonos se han reducido por el alto contenido de glutatión intracelular [36, 37]. Esta serie de experimentos por lo tanto, sugiere fuertemente que el ojo fenotipo observado después de la inyección de mRNA spaP6 refleja una disminución de Pax6 directa no-actividad de células autónomas.

A fin de verificar la última posibilidad, se inyecta el sobrenadante del hibridoma (HaP6) en el espacio intercelular a la blastulación. El uso de un isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anticuerpo, por primera vez comprobado que los anticuerpos inyectados en la blástula difusa entre las células y no son internalizados (Figura 3a-d]. La distribución de los anticuerpos, seguido una hora después de la inyección (Figura 3a, b] o en el escudo etapa (Figura 3c, d], fue predominantemente, aunque no exclusivamente, extracelular. A continuación, se inyecta HaP6 versus vehículo, HaP6 versus HaMyc (anti-myc sobrenadante) o HaP6 versus HaP6 pre-incubadas con el epítopo reconocido por el anticuerpo (amino-terminal de dominio de Pax6). Figura 3 ilustra la prototypic fenotipos que fueron obtenidos (análisis cuantitativo en la Figura 4] de tres embriones HaP6 cuando se inyectó a la blastulación. Los ojos son o bien muy reducido o dissymmetric. Las secciones horizontales (Figura 3g, j, m] confirman reducción de ojos y disimetría, pero también muestran que las lentes son o ausente (Figura 3g] o menor y / o desplazados (Figura 3 undecies, m]. Estas nunca fueron fenotipos observados en cualquiera de los controles y son similares a las observadas tras la inyección de un límite spaP6 mRNAs en el huevo.

El acumulado parcelas de tamaños ojos, sin considerar la asimetría (todos los ojos están incluidos, dos ojos por animal) se presentan en la Figura 4. Es evidente que, HaP6 extracelular anticuerpo tiene un fuerte efecto sobre el tamaño de los ojos (Figura 4 bis] que no pueden ser reproducidos con la anti-myc de anticuerpos (Figura 4b]. Para comprobar que este efecto diferencial no se debió a una diferencia en el calendario, en comparación garras en el que el primer lote de embriones se inyectó ya sea con el myc o con el anticuerpo Pax6, y no encontró diferencias (comparar Figura 4b y 4c]. También se verificó que pre-incubación con el anticuerpo el amino-terminal Pax6 epítopo abolido el efecto sobre la distribución del tamaño del ojo sólo cuando los embriones fueron inyectados con anti-anticuerpos Pax6 (planteadas en contra de este epítopo) (Figura 4d, e]. Esta serie de resultados confirman los obtenidos con la única cadena de codificación de mRNAs y sugieren fuertemente que el pleno desarrollo requiere ojo extracelular Pax6 expresión.

Figuras 2, 3 y 4 de ilustrar y cuantificar el efecto, a las 30 HPF, de las inyecciones hecho mucho antes, ya sea en la etapa de una célula (mRNA tope; Figura 2] o en la blástula (anticuerpos; Figuras 3 y 4]. Esto no permite verificar uno a la etapa en que los fenotipos primero aparecer. Para abordar este punto se analizaron diferentes hitos del ojo sobre el terreno entre 0 a 3 y 15 a 18 somite etapas. En la etapa más temprana (de cero a tres somites) ninguna diferencia en los patrones de expresión Pax6 se HaP6 visibles después de la inyección en la blástula (Figura 5a-c]. El mismo resultado se obtuvo con RX3, un marcador más amplio de los ojos muy temprano territorio (Figura 5d-f]. Por el contrario, antagonizar Pax6 paso dado lugar a una clara disimetría en Pax6 expresión en el ojo sobre el terreno a los 12 a 15 (no se muestra) y 15 a 18 somite etapas (Figura 5g-i, flechas azules), pero no es así, o no evidente, en los otros ámbitos donde Pax6 También se expresa, por ejemplo, la DIENCÉFALO y hindbrain (d h y en la figura 5g'-i »].

Por último, para verificar si los principios y fines de fenotipos fueron correlacionados, se observó el ojo de campo de 48 embriones que tengan entre 10 y 15 somites, cuando la asimetría es primero visible en el ojo sobre el terreno de embriones inyectados en la fase de blástula (Figura 5j-l] , Y siguió el desarrollo del ojo de cada embrión. Todos los embriones normales y simétricos ojo campos desarrollados con los ojos normales. Entre 15 pequeños embriones, pero con los ojos simétricos campos, 3 recuperado completamente, 3 madurado con ojos pequeños, de 5 años con dissymmetric ojos y 4 perdido los dos ojos completamente. De 15 embriones con ojos dissymmetric campos, uno desarrollado dos ojos pequeños, 2 madurado con dissymmetric ojos y 12 ojos no desarrollado en absoluto. Por último, de un total de 14 embriones no visible con los ojos sobre el terreno, uno desarrollado asimétrica ojos y los otros 13 nunca desarrolló ningún ojo. Por lo tanto, podemos concluir que el efecto de la presencia de anti-anticuerpos Pax6 en el espacio intercelular se lleva a cabo a principios de desarrollo, probablemente antes de los seis somite etapa, tan pronto como la vesícula óptica empieza a formarse. Además, parece que el tipo de fenotipo visto en una etapa temprana es, en general, confirmada por la anormalidad visto en etapas posteriores.

Discusión

En el presente estudio hemos comprobado que, como se espera de análisis de secuencias, Pax6 es capaz de transferencia intercelular in vitro (Figura 1] [34, 35]. Nuestra in vivo los resultados apoyan la idea de una relación directa-no la actividad de células autónomas de Pax6, pero no dicen nada acerca de la importancia de su captura por las células terrenos colindantes. A pesar de que favorecen la hipótesis de que la falta de actividad autónoma informó aquí Pax6 requiere la internalización, que no excluye la posibilidad de Pax6 también, o sólo tener una actividad extracelular que no requieren la internalización.

Como ya se ha mencionado, porque las secuencias necesarias para la transferencia homeoprotein están en el homeodominio [33], pero no hemos podido modificar para generar animales transgénicos que expresan "célula autónoma sólo" las proteínas. Esta es la razón por la que se aplica una estrategia de anticuerpos extracelular. Debido a su sensibilidad a la glutatión intracelular, única cadena de anticuerpos son a menudo inestables dentro de la celda y privados de actividades de fuerte intracelular [36, 37].

Intracelular de la inestabilidad de la cadena única de lucha contra el Pax6 de anticuerpos fue confirmado indirectamente por los datos actuales, donde la cadena de anticuerpos solo carece de péptido señal, y, por tanto, puramente intracelulares, son mucho menos activas que los secretada, aunque las dos construcciones de la misma codificación variable de secuencias de dominio y se expresaron al mismo nivel (Figura 2]. Este resultado hace que sea poco probable que los efectos biológicos de spaP6 (la forma secretada) puede explicarse por la fuga de los anticuerpos de la secreción de la vía. Este último punto fue confirmado por la ausencia de spaP6 en el núcleo de las células transfectadas (en oposición a aP6) y de experimentos en los cuales el pleno de anticuerpos (a partir de la hibridoma utilizados para clonar aP6 y spaP6) fue inyectado en la blástula (Figura 3 ). Las similitudes en los fenotipos obtenidos con ambos (expresión o de inyección) reforzar la interpretación de que la interferencia directa con la no-células autónomas Pax6 actividad anormal induce el desarrollo del ojo.

El ojo fenotipo es principalmente una reducción en el tamaño de los ojos, de parcial a total. Esta reducción es simétrica, pero a veces un ojo es a menudo más afectadas que los demás. Una probable explicación es que expresa o inyectado anticuerpos no están distribuidas de manera uniforme. De hecho, después de la inyección, los mRNAs puede acumular preferentemente en uno o en blastomere sólo uno de los dos primeros Blastómeros si se inyecta justo antes de la primera división. No es improbable, en el caso de la inyección de anticuerpos en la blástula, que la concentración de anticuerpos no es homogéneo o no seguir siéndolo. De hecho, una distribución desigual es visible en la Figura 3d, que fue adoptada en el escudo fase (sección confocal realizados en el 50% epibolia).

También es llamativo el hecho de que un defecto en la retina suele ir acompañada de una ausencia de lente o el desarrollo de un pequeño y / o ectópico lente. La lente y la retina fenotipos podría ser independiente desde Pax6 se expresa en ambas estructuras. Por otra parte, un defecto en la retina neural pueden tener consecuencias para el lente de inducción o de desarrollo. En el contexto de una función de la retina en el lente de inducción, no podemos Pax6 se oponen a que la secreción de entre el pliegue neural y el epitelio superficial participa en la inducción de lentes. Este hecho, no elimina la posibilidad de que los clásicos son inductores Pax6 en virtud de células autónomas de control transcripcional [5, 21 - 26, 38, 39].

El primer signo de actividad de anticuerpos anormales es el patrón de expresión de Pax6 en el ojo sobre el terreno (Figura 5 h, i]. En comparación con los controles, el dominio de Pax6 expresión es menor a uno o ambos lados. Varias explicaciones parecen plausibles que no son mutuamente excluyentes. Una de ellas es que Pax6 no es un regulador de células autónomas de la muerte celular y la supervivencia [40] y que el bloqueo de su paso reduce el tamaño del ojo a través de la muerte de las células locales. Una segunda es que Pax6 no es un regulador de células autónomas de la división celular y que el bloqueo de su paso bloques el número de progenitores en el ojo sobre el terreno o las fuerzas de su prematura diferenciación [16, 41, 42]. Una tercera es que secretada Pax6 activa su propia transcripción, ya sea indirectamente o después de la internalización y el transporte al núcleo, induciendo de este modo la extensión del ojo sobre el terreno [31]. La tercera posibilidad, que puede proporcionar un mecanismo molecular para el concepto de homeogenetic inducción [43, 44] es realmente compatible con las otras dos desde la inducida Pax6 podría actuar como una célula autónoma-regulador de la supervivencia celular, la división o compromiso. A pesar de que tenemos, en este momento, no hay motivo para excluir cualquier escenario, no autónomo auto-activación en la transcripción nivel es compatible con el hecho de que Pax6 activa su propia transcripción [29 - 32].

Curiosamente, muchos estudios sugieren que, a principios de desarrollo, varios homeoproteins actuar en parejas a la posición dentro de la fronteras neuroepithelium. Entre varios ejemplos, se demostró que un desequilibrio cuantitativo entre Emx2 y Pax6 da lugar a un cambio en el tamaño de las áreas sensoriales primarias, sin modificación de la superficie total del neuroepithelium [45 - 47]. La misma observación se hizo de la posición del istmo, que depende de los respectivos niveles de expresión de Otx2 y Gbx2 [48, 49]. Teniendo en cuenta que, dentro de un par, cada una de estas proteínas activa su propia transcripción y hacia abajo-que regula las de los demás, no la de células autónomas actividad descrita aquí podría proporcionar una parsimonious y simple mecanismo para el establecimiento de fronteras.

En el bajo nivel de precisión permitida por nuestro modelo biológico, parece que los anticuerpos sólo ojo afectado el desarrollo y no de otras estructuras donde el factor de transcripción También se expresa (Figura 5g-i]. Del mismo modo, los anti-Engrailed única cadena de anticuerpos, considerado como un control, no tuvo influencia visible en la morfología del cerebro (Figura 2 g], aunque Engrailed-1 y Engrailed-2 son dos secretada homeoproteins [35]. Una posible explicación es que los cambios son demasiado pequeños para ser realmente identificados en nuestro modelo experimental, posiblemente porque no ocurra más tarde, cuando los anticuerpos ya han sido degradados y diluido. Otra posibilidad es que los mecanismos de señalización redundantes han sido seleccionados que son capaces de buffering el fenotipo. Si es así, puede ser que Pax6 y los ojos son especialmente adecuados para investigar este novedoso mecanismo de señalización, no sólo porque los ojos son muy variables las estructuras, sino también porque Pax6 es un importante jugador en los ojos de inducción y desarrollo, como lo demuestra el desarrollo de los ojos a Pax6 en la expresión ectópica de localización, tanto en la marcha y en los vertebrados [17, 18].

Para continuar esta línea de pensamiento en un contexto evolutivo, homeoprotein transferencia puede haber sido una de las primeras modo de transducción de señales utilizados para el intercambio de información sobre la posición en la primera multi-organismos celulares. Un sistema de este tipo, en la que homeoproteins actuar como morphogens, que progresivamente han ganado en robustez a través de la contratación de nuevos modos de transducción de señales basadas en la interacción de factores de crecimiento y receptores, posiblemente con homeoprotein transcripcional y translacional. En apoyo de esta idea, se ha demostrado recientemente que homeoprotein Engrailed-2 pueden servir de guía para los axones de las células ganglionares de la retina después de su internalización en los conos, donde se regula la traducción local de mRNAs [50]. Engrailed puede, pues, se han utilizado como una molécula de señalización antes de la invención de los clásicos mecanismos de señalización, llevando a su actual capacidad de actuar como una molécula de orientación a través de la traducción y una regulación factor de transcripción para la expresión de los clásicos tacos de rectores [51 - 54] . Estamos especular que el mismo concepto podría aplicarse a otros mensajeros homeoproteins, incluidos Pax6, y que este imprevisto Pax6 propiedad podrá participar en la definición del ojo sobre el terreno y el intercambio de información entre la retina y el lente.

Conclusión

Expresando o abordar en vivo anticuerpos monoclonales contra Pax6 modifica el patrón de expresión de Pax6 en los países en desarrollo sobre el terreno los ojos y los ojos fuerte induce fenotipos que afectan a la retina y el lente. Basándose en el hecho de que la transferencia intercelular Pax6 se antagoniza por los anticuerpos, proponemos que Pax6 tiene dos actividades. Una primera actividad de células autónomas, clásicamente descrita por todos los factores de transcripción, es responsable para el control de los programas de diferenciación de la retina y el lente, incluyendo la síntesis de buena fe los factores de crecimiento y receptores. Una segunda actividad, lo que requiere la secreción de Pax6 es necesaria para el pleno desarrollo del ojo Anlage y apoya la idea de que varios homeoproteins son morphogens directa con la no actividad de células autónomas.

Materiales y métodos
Plásmidos y proteínas

Única cadena de anticuerpos recombinantes se preparan a partir de ARN total de la lucha contra el Pax6 y anti-Engrailed 4G11 hibridoma obtenido a partir de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma (DSHB, de la Universidad de Iowa y NICHD, Departamento de Ciencias Biológicas, Iowa City, IA, EE.UU.). La clonación se ha logrado como en [55]. La codificación de secuencias fueron insertados en un derivado de pSecTagHygroB (Invitrogen, Cergy, Francia) para dar psecaP6 y psec4G11, mientras que el péptido señal secuencia de codificación se ha retirado de pCBaP6 y pCB4G11; los marcos de lectura abierta también fueron transferidos abajo de la EF1a y promotor T7 (en un derivado de pEF1mycHis; Invitrogen) para dar pEFsaP6 y pEFs4G11 (con péptido señal) y pEFaP6 y pEF4G11 (sin péptido señal). El amino-terminal de dominio de Pax6 (codificación secuencia tomada de pmPax6, un regalo de T Czerny, Viena, Austria) ha sido producido por bacterias y se purifica mediante poli-histidina extensión. De larga duración proteína Pax6, con un Hemaglutinin (HA) en su etiqueta amino terminal, se expresó en COS-7 células de la pCHAPax6 plásmido, bajo el control del promotor CMV. Los ácidos nucleicos y proteínas manipulaciones se realizaron de acuerdo a procedimientos estándar. Los detalles de la construcción están disponibles bajo petición.

Intercelulares transferencia de Pax6

COS-7 células, cultivadas en DMEM/F12 incrementado en un 10% de suero de ternera fetal, fueron transfectadas con pCHAPax6 y bien pEFs4G11 o pEFsaP6, utilizando lipofectamin 2000 (Invitrogen). Seis horas después de transfección, las células fueron recogidas por la tripsina tratamiento y chapada en cubreobjetos de vidrio revestida (15 μ g / ml de poli-ornithin) a una concentración de 2,5 × 10 3 células / cm 2, junto con células HeLa (clon H2B, estable expresar una GFP histona-2b proteína de fusión; un regalo del Dr Valérie Doye, Institut Curie, París, Francia) en una concentración de 17 × 10 3 células / cm 2. En el caso de COS-7 transfectadas las células por separado de pCHAPax6, anti-myc (9E10) o anti-Pax6 (ambos de DSHB) anticuerpos monoclonales se han añadido (4 μ g / ml) en la co-medio de cultivo. Después de 24 horas, co-cultivos fueron procesados por inmunocitoquímica como sigue. Las células fueron lavadas y fijos (etanol: ácido acético 93:7, 5 minutos, -20 ° C) y Pax6 expresión se detectó con un anti-anticuerpo policlonal Pax6 [56] seguida de una Cy3 anti-conejo-anticuerpo (Jackson Laboratories, Newmarket, Reino Unido). GFP se detectó con un anti-GFP anticuerpo monoclonal (Santa Cruz, Heidelberg, Alemania), seguido por un 488 Alexa anti-ratón de anticuerpos (Molecular Probes, Cergy, Francia).

Transferencia fue cuantificado para cada condición que utilizan siete secciones confocal procesados con NIH Image J señal para el análisis. Pax6 tinción fue cuantificado sólo en las buenas prácticas agrarias células positivas (células HeLa) a fin de excluir la señal de COS transfectadas las células.

Peces manipulación de embriones

Pez cebra (Danio rerio) se plantearon y organizaron de acuerdo a [57]. ARN de una sola cadena de anticuerpos transcrita in vitro de linearized sus plantillas con la mMessage mMachine kit T7 (Ambion, Austin, EE.UU.)) se inyectaron en una concentración de 100 ng / ml. Análisis cuantitativo de la eficiencia del mRNA se realizó en 50 microinjected embriones, de forma manual dechorionated y liberado de vitellus al comienzo de la gastrulación, zadas en Laemmli de amortiguación y electophoresed en un 12% SDS-gel de poliacrilamida. Myc-etiquetados única cadena de anticuerpos fueron detectados en Western-Blots con el anticuerpo monoclonal 9E10 anti-myc anticuerpos (DSHB) y electrochimioluminescence (ECL, Amersham, Amersham Place, Reino Unido), y la señal de cuantificación se realizó usando el software Image J. Hibridoma sobrenadantes (anti-Pax6 y 9E10 anti-myc, DSHB) y FITC-anti-mouse IgG (Jackson ImmunoResearch, Nuevo Mercado, Reino Unido) se inyectaron a mediados de blástula escenario "con arreglo a Minchiotti y colegas [58] en una concentración de 40 μ g / ml.

Hibridación in situ, inmunohistoquímica y análisis morfométrico en pez cebra

Todo el montaje hibridación in situ e inmunohistoquímica se realizaron de acuerdo a protocolos estándar [59]. ARN sondas fueron elaborados a partir de Pax6a (No I, T7) y pCS2RX3 (Hin dIII, T7, un regalo del Dr Laure Bally-Cuif, GSF, Neuherberg, Alemania). Anti-myc anticuerpos fueron de DSHB (monoclonal 9E10) o Upstate Biotecnología (Charlottesville, EE.UU.) (policlonales) y todas las secundarias de anticuerpos Amersham. Los embriones fueron incorporados en el 7,5% de gelatina, el 15% de sacarosa, 20 mM tampón fosfato pH 7,4, y los artículos congelados (14 μ m) fueron montados en el 75% de glicerol. Análisis morfométrico se realizó a través Lucía G de procesamiento de imágenes y análisis de software (versión 4,61, Nikon, Kingston upon Thames, Reino Unido). Todos los ojos se midieron (unidades arbitrarias) y las medidas individuales se distribuyeron entre 12 clases de tamaño (8,3% de incremento pasos), clase 1 que corresponde a los más pequeños ojos (como en la Figura 3e].

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

BL realizó los experimentos en embriones de pez cebra, y escribió un primer borrador del manuscrito. AJ hizo los experimentos en Pax6 paso a la cultura. AP concibe el estudio y diseñado con BL y MV. MT y AP escribió la versión final del manuscrito, que fue aprobado por todos los autores.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a Eliane Ipendey (ENS) por su excelente asistencia técnica, Pr Sophie Vriz (Universidad de París 7) por su ayuda en la manipulación de los embriones y el Dr Frédéric Rosa (INSERM) por su valioso asesoramiento, así como de sus instalaciones de pescado disponible, Dr Valérie Doye (Institut Curie, París) por el don H2B clon de células HeLa, el Dr Thomas Czerny (Universität Wien) por el don de la secuencia de codificación de Pax6, y el Dr Laure Bally-Cuif (GSF, Neuherberg) por el don de la RX3 sonda. Expresamos nuestro agradecimiento a los Dres Paola Bovolenta (Instituto Cajal, CSIC) y Ariel Di Nardo (Institutos Canadienses de Investigación en Salud) por su cuidadosa lectura del manuscrito y consejos importantes. Este estudio fue apoyado por el Centre National de la Recherche Scientifique y Ecole Normale Supérieure. También reconocemos el apoyo financiero del Programa de Human Frontier (RGP0026/2002-C), la Comunidad Europea (HPRNT-CT-2001-00242) y el Programa Nacional de Recherche sur la Visión 2005.