PLoS ONE, 2007; 2(2): (más artículos en esta revista)

Imágenes de la dinámica de la enfermedad durante la sepsis meningocócica

Biblioteca Pública de la Ciencia
Hong Sjölinder, Beth Ann-Jonsson
Resumen

Neisseria meningitidis es un patógeno humano que causa la meningitis y la septicemia con alta mortalidad. La progresión de la enfermedad es mucho más rápido y sigue siendo desconocido sobre el proceso de la enfermedad. La comprensión de la enfermedad de desarrollo es crucial para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y vacunas contra la enfermedad meningocócica. El uso de bioluminiscente de imágenes combinadas con un ratón modelo de enfermedad nos ha permitido investigar la progresión de sepsis meningocócica en el tiempo. La inyección de bacterias en la sangre demostrado olas de aclaramiento de bacterias y el crecimiento, que han elegido para expresar Opa-bacterias, lo que indica la importancia de esta proteína bacteriana. Por otra parte, N. meningitidis acumulado en la glándula tiroides, mientras que la hormona tiroidea T4 disminuido los niveles. Las bacterias llegado a la superficie mucosa del tracto respiratorio superior, lo que exige la expresión de la meningitis PilC1 adhesina. Sorprendentemente, PilC1 era prescindible para el crecimiento meningocócica en la sangre y para el cruce de la barrera hemato-encefálica, lo que indica que la función principal de PilC1 es interactuar con las mucosas. Este estudio in vivo revela la dinámica de enfermedad y de órganos de orientación durante la enfermedad meningocócica y presenta una potente herramienta para futuras investigaciones de meningitis patogénesis y vacunas en vivo. Esto podría llevar al desarrollo de nuevas estrategias para mejorar los resultados de la enfermedad meningocócica en pacientes humanos.

Introducción

Neisseria meningitidis es un patógeno humano y una de las principales causas en todo el mundo fatal de la sepsis y la meningitis, por lo general en otros individuos sanos [1]. El principal reservorio de meningitis transporte es la nasofaringe humana, donde de vez en cuando esta colonización asintomática es seguido por enfermedad invasiva. La progresión de la enfermedad es mucho más rápido y sigue siendo desconocido sobre el proceso de la enfermedad. Muchos meningocócica superficie asociada a factores de virulencia se han caracterizado, entre estos se pili, PILC, Opa, lipooligosaccharide (LOS) y la cápsula. Meningocócica pili mediar en apego a las células huésped, y cada pilus se compone de miles de subunidades montón interactivo, un pilus asociada a adhesina PILC y, posiblemente, otros aún no identificados componentes. Opa son proteínas integrales de membrana externa proteínas que median la invasión de células humanas [2]. Muchos superficie expuesta factores de virulencia de Neisseria someterse fase y la variación antigénica, es decir, la alteración de la expresión génica de compensación a cambio de un determinado producto génico o de reordenación del ADN, lo que puede aumentar la capacidad de adaptación bacteriana y la virulencia [3], [4]. Opa expresión sufre fase variación debido a los frecuentes cambios en el número de pentameric secuencia se repite en el péptido señal de codificación región, que alteran el libre marco de lectura. Los estudios de factores de virulencia bacteriana y la célula hospedadora receptores han puesto de manifiesto complejo y multifuncional puntos de contacto y los patrones de transducción de señales durante la interacción entre las bacterias y las células objetivo de acogida [5] - [9]. Desde N. meningitidis normalmente sólo causa enfermedad en los seres humanos, la mayoría de los estudios de bacterias-célula hospedadora interacciones se han llevado a cabo in vitro, es evidente que la limitación de la comprensión de la progresión de la enfermedad.

Varios sistemas modelo experimental utilizando ratones, ratas y conejos, se han evaluado en los últimos decenios [10]. Hierro-ip mayor infección del ratón utilizando un espectro de fuentes de hierro con claridad los resultados en las bacteriemias [11], mientras que en la infección por la presencia de hierro dextrano también conduce a la colonización de los tejidos nasales [12]. Sin embargo, la principal desventaja de estos modelos es el efecto desconocido de hierro en la respuesta inmune del hospedero y, sobre todo en los mecanismos de defensa innata. En la infección en modelos de ratones lactantes pueden ser usados para el estudio de principios de los acontecimientos en la patogénesis de la infección meningocócica, sin embargo estos modelos no son ideales ya que la bacteriemia niveles son bajos (un máximo de 58%), mientras que rara vez se desarrolla la meningitis [13], [14]. Infantil modelos de rata con ip bacteriana reto se traduce en alta carga bacteriana en la sangre y la peste porcina clásica y altas tasas de mortalidad [15], [16], pero todavía requiere el prematuro del sistema inmunológico de los animales lactantes.

CD46 es una célula humana complemento regulador de superficie que interactúa con Neisseria y varios otros microbios [17]. CD46 ratones transgénicos infectados por vía intraperitoneal (ip) con N. meningitidis son susceptibles a la enfermedad meningocócica en contraste con los ratones que nontransgenic eliminar la infección y sobrevivir [18]. Es importante destacar que el CD46 en ratones transgénicos modelo, la infección conduce a la sepsis y la meningitis en adultos sin preinjection ratones de potenciadores, como los compuestos de hierro. Replicación bacteriana en la sangre y el paso por la barrera hematoencefálica (BBB) se producen CD46 en ratones transgénicos, pero no en ratones nontransgenic. Por otra parte, la inducción de respuesta inmune temprana después de ip reto de los ratones transgénicos se asemejan a las manifestaciones de la enfermedad meningocócica en los seres humanos [19]. Por lo tanto, CD46 ratones transgénicos representan un modelo adecuado sistema para estudiar la enfermedad meningocócica y probar las vacunas en vivo en ratones adultos.

En este estudio, que se utilizó en vivo de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para controlar la sepsis meningocócica CD46 en ratones transgénicos. Imaging lo largo del tiempo ha demostrado olas de crecimiento bacteriano y la limpieza, donde las señales de disminución de bacterias y luego reapareció en nuevos lugares. Reaparición de bacterias se asoció con una inflexión en Opa de expresión. Por otra parte, N. meningitidis acumulado en la glándula tiroides y la cavidad nasal. Es interesante señalar que la meningitis adhesina PilC1 fue prescindible para el desarrollo de bacteriemia y de la translocación bacteriana al líquido cefalorraquídeo (LCR), pero mucho mayor translocación bacteriana de la sangre a las mucosas del tracto respiratorio superior.

Resultados
In vivo de imágenes de bioluminiscente N. meningitidis

Con el fin de imagen de la progresión de la enfermedad meningocócica en vivo, construido bioluminescently etiquetados N. meningitidis. El luxCDABE genes, que son necesarios para la producción de luz bioluminiscente, se expresaron bajo el control de la meningitis Pora promotor y se incluirán en un no codificante región cromosómica de la cepa meningocócica FAM20 (Figura 1A]. Como se muestra en la Figura 1B, la inserción de PORA promotor aumentó significativamente la señal bioluminiscente. La cepa bioluminiscente FAM20 LU mantenido expresión de pili, PILC, LOS y la cápsula, y no mostró cambios en el montón de secuencias de genes o la tasa de crecimiento en comparación con la cepa padre (datos no presentados). Para evaluar la virulencia de FAM20 LU, se utilizó una ya se ha informado modelo murino [18] y desafió CD46 ratones transgénicos con ip 10 8 FAM20 LU. Después de 24 h, fuertes bioluminiscente se detectaron señales en el cuerpo del ratón y en el cerebro de ratones transgénicos CD46, pero no se observaron señales en nontransgenic ratones (Figura 1C]. A medida que la cepa original FAM20, FAM20 LU enfermedad mortal causada dentro de 2 días después de la infección. Además, la intensidad de las señales emitidas fue proporcional a la carga bacteriana en la sangre y los tejidos (datos no presentados), lo que permite tanto temporal y espacial de análisis en relación con la progresión de la enfermedad meningocócica. Construcción de FAM20 LU resultado en ambos Opa Opa ON y OFF clones, que no mostró diferencias en el crecimiento, en la adhesión y la invasión de acogida faríngea células epiteliales, o en la virulencia CD46 utilizando el ratón transgénico modelo (Figura S1 y datos no presentados). En resumen, los datos de tanto in vivo como in vitro experimentos demuestran que la novela bioluminiscente cepas son estables y dispongan de una virulencia en comparación con la cepa parental.

Tres diferentes patrones patológicos de la enfermedad meningocócica en ratones transgénicos CD46

La enfermedad meningocócica se inicia cuando las bacterias con éxito entrar en el torrente sanguíneo y sobrevivir las defensas del huésped. Para estudiar la sepsis meningocócica, hemos creado una vía intravenosa (iv) la infección modelo CD46 en ratones transgénicos. Se encontró que el 1 × 10 9 bacterias son una dosis óptima para inducir la sepsis meningocócica grave con resultados mortales. La infección con un menor número de bacterias, es decir, 5 × 10 8 / ratón, dio lugar a la liquidación y el 100% de supervivencia (datos no presentados). La dosis óptima de infección era alta, sin embargo, informes recientes han demostrado que los pacientes con la enfermedad meningocócica bacteriana puede tener cargas de hasta 6 × 10 8 bacterias / ml de sangre [20], [21]. La infección con 10 9 UFC / ratón corresponde a 5 × 10 8 bacterias / ml en sangre, que se encuentra dentro de la gama de carga bacteriana se encuentran en los seres humanos. De este modo, los ratones fueron retados con el 10 9 bacterias / ratón y analizados por bioluminiscente de imágenes en diferentes puntos temporales. Como se muestra en la Figura 2A, nontransgenic ratones infectados con N. meningitidis liquidó las bacterias dentro de las 24 h, mientras que la infección de ratones transgénicos CD46 dio lugar a tres diferentes patrones de enfermedad. Muchos de los ratones transgénicos CD46, es decir, 43% (20/46), demostró una "sepsis-como" modelo resultante en un resultado letal dentro de 2 días después de la infección. En el 35% (16/46) de los ratones, una "meningitis-como" enfermedad patrón se observó con las señales se encuentran principalmente en el cerebro y la columna vertebral región. La punción de la cisterna magna de los ratones de este grupo reveló alto número de bacterias en LCR 24 h post-infección (datos no presentados) y estos ratones murieron 2 ó 3 días post desafío. Curiosamente, una "enfermedad leve-como" patrón apareció en un número menor de ratones (10/46), que muestra relativamente bajos niveles de bacteriemia menos de 10 6 UFC / ml (Figura 2B]. Por lo tanto, la infección de CD46 ratones transgénicos da lugar a tres diferentes patrones de enfermedad.

Selecciona la progresión de la enfermedad de Opa expresión

Nos interesa analizar más leve la enfermedad meningocócica. Para estudiar la dinámica de una enfermedad más sensible de detección de escala se utiliza para controlar la carga bacteriana a las 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días y 4 días después de la infección iv (Figura 3A]. Inesperadamente, las señales desaparecieron después de 2 días y los ratones parece haber recuperado. Sin embargo, las señales reaparecieron día 3. Cinco de cada diez ratones mostraron la acumulación de bacterias en el cerebro (Figure. 3A, panel superior], mientras que la carga bacteriana en el LCR fueron casi 1000 veces superior al de la sangre. El resto de ratones muestran señales fuertes en todo el cuerpo (Figura 3A, panel inferior), con un alto bacteriana sanguíneos, lo que indica bacteriemia fulminante. Bacteriana reaparición después de la aparente recuperación siempre dio lugar a un resultado letal. Estos datos implican que la meningitis difusión en vivo es más complicado de lo que previamente han entendido. Reaparición de bacterias en el día 3 y 4 sugiere la supervivencia de una pequeña población de bacterias. En un intento por identificar posibles fase y variación antigénica de meningitis factores de virulencia, las bacterias se recuperaron de la glándula tiroides, timo, pulmón, hígado, riñón, bazo, intestino, lavado nasal, MCA, y la sangre, al día 1, 3 y 4 después la infección con el FAM20 LU Opa OFF. Todas las cepas bacterianas recuperadas mantenerse expresión de PILC, pili, LOS, y la cápsula (Figura 3B y datos no presentados). Además, la secuencia de variación del montón de genes no se detectó (datos no presentados). Es interesante señalar que en el 67% (4 / 6) de los ratones de todos los aislamientos recuperados en 3 días o más tarde expresó Opa, mientras que en las primeras etapas de la infección Opa-expresión fue negativa (Figura 3B, paneles superiores). El análisis por inmunotransferencia demostrado expresión de OpaA y OpaB en todos los aislamientos, mientras que OpaD permanecido indetectable como en el inóculo inicial (Figura 3B y datos no presentados). El patrón de expresión de proteínas Opa es compatible subcultivo después de bacterias in vitro, lo que indica que Opa expresión fue seleccionado en ratones. Con el fin de analizar el impacto de la enfermedad Opa en desarrollo, CD46 ratones transgénicos fueron impugnadas iv con una Opa SOBRE aislar recuperado de sangre. El bacteriana sanguíneos fueron significativamente mayores (5,6 × 10 8 ± 5 × 10 8 UFC / ml) a las 24 h después de la infección en comparación con el inóculo inicial (2 × 10 7 ± 1 × 10 7 UFC / ml, Figura 2B]. Por lo tanto, estos datos implican que la Opa proteínas juegan un papel importante durante la progresión de la enfermedad.

Meningococo se acumulan en la glándula tiroides por vía intravenosa después de la infección de ratones transgénicos CD46

Además de las señales de bacterias en el cuerpo del ratón y el cerebro, in vivo de imágenes de bioluminiscencia (BLI) reveló también fuertes señales de que persisten a lo largo del tiempo la glándula tiroides y la región nasal de ratones transgénicos CD46 (Figura 4A]. Un análisis más detallado de la glándula tiroides demostrado fuerte bioluminiscencia en un disecados tiroides (Figura 4B], y alta carga bacteriana en homogeneizado de tejidos (Figura 4C]. Es interesante señalar que la carga bacteriana fue más alta en la tiroides que en la sangre. Examen inmunohistoquímico de tejido tiroideo secciones reveló que las bacterias se encuentra principalmente en las capas celulares, y no en el lumen de los folículos tiroides (Figura 4D]. Casi no se detectaron bacterias en las glándulas tiroides de nontransgenic ratones. Con el fin de investigar la función tiroidea durante la enfermedad meningocócica, el nivel sanguíneo de la hormona tiroidea, tiroxina (T4), se midió. Inesperadamente, no infectada CD46 ratones transgénicos exhiben los niveles de T4 más bajos que los ratones nontransgenic (P & lt; 0,05). En respuesta a la infección, los niveles de T4 se redujo en ambos CD46 ratones transgénicos y ratones nontransgenic. Después de 3 días de infección, los niveles de T4 aumentó en ratones nontransgenic como los ratones se recuperaron, mientras que los niveles de T4 fueron indetectables CD46 en ratones transgénicos después de 2 días, que luego tuvo un resultado letal (Figura 4E].

N. meningitidis translocates de sangre a la mucosa respiratoria

En vivo BLI también reveló una fuerte señal focal en la fase oral-nasofaríngeo región infectada de ratones transgénicos CD46 (Figura 4A]. Esta señal se detectó durante varios días, a veces con intensidad creciente. Para analizar la presencia de bacterias en la nasofaringe, recogidos lavados nasales y mide la carga bacteriana. A las 24 h post-infección, un número elevado de bacterias (7 × 10 4 UFC / ml) se obtuvieron de lavados nasales de CD46 ratones transgénicos, con más del 95% de las bacterias que se recuperó bioluminiscente meningococo (Figura 5A]. No se encontraron meningococo en lavados nasales de los ratones infectados nontransgenic o no infectada ratones mantienen en la misma jaula, como la impugnada ratones (Figura 5A y datos no presentados), lo que indica que la meningitis la colonización de la mucosa respiratoria no es una consecuencia de la transferencia de aerosol de bacterias otros ratones infectados. Bacteriana transmigración a la mucosa respiratoria fue verificado por inmunohistoquímica examen. Un gran número de meningococo se identificaron en la mucosa y submucosa de la cavidad nasal de ratones transgénicos CD46 desafiado con FAM20 LU (Figura 5B, panel superior]. Por otra parte, los grupos de meningococo se encontraron en las fosas nasales y traqueales lumen, en ocasiones asociados a la superficie mucosa (datos no presentados). Estos datos sugieren la idea de que la novela de N. meningitidis puede translocate de sangre a la mucosa respiratoria superficie CD46 en ratones transgénicos.

Translocación bacteriana de la sangre a la mucosa respiratoria es PilC1 dependientes

El pilus asociada a adhesina PilC1 desempeña un papel fundamental en la mediación de acogida apego a las células epiteliales objetivo [22], [23]. Con el fin de estudiar la función de PilC1 a la enfermedad meningocócica bacteriana y orientación a la superficie mucosa respiratoria, que generó un bioluminescently etiquetados PilC1 mutante. La cepa resultante designado FAM20 Δ pilC1 LU muestra equivalente tasas de crecimiento in vitro en comparación con FAM20 LU (datos no presentados). Iv infección de ratones con la bioluminiscente PilC1 mutante, dio lugar a fuertes bacteriemia, sin embargo, la señal bioluminiscente en la región nasal es débil (Figura 5A]. Lavados nasales confirmó meningococo en un menor número de ratones infectados con el PilC1 mutante (2 × 10 2 UFC / ml) que con la PilC1-expresando FAM20 LU (7 × 10 4 UFC / ml) (Figura 5A]. Además, no inmunohistoquímica examen para detectar el PILC mutantes en la capa de células epiteliales, aunque pequeñas cantidades se detectaron en la submucosa (Figura 5B, panel inferior). Sorprendentemente, los mutantes inducidos PilC1 bacteriemia, desencadenó IL-6, cruzó la BBB, y causó la enfermedad letal a tasas similares como las de tipo salvaje (Figura 6]. Tomados en conjunto, las investigaciones in vivo sugieren que PilC1 es prescindible para bacteriemia y seguir el paso de bacterias a través de la barrera hematoencefálica, sino que desempeña un papel crucial en la orientación N. meningitidis a la mucosa del tracto respiratorio superior.

Discusión

Neisseria meningitidis es un estricto humanos de patógenos específicos que causa meningitis y sepsis. La enfermedad meningocócica tiene un rápido inicio a una elevada mortalidad. La comprensión de la enfermedad de desarrollo es crucial para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y vacunas contra la enfermedad meningocócica. En este estudio, hemos utilizado bioluminiscente meningococo a la imagen de la progresión de la enfermedad en ratones transgénicos CD46 y demostró nuevos aspectos de la dinámica de la enfermedad meningocócica. Análisis de imágenes de sepsis meningocócica reveló por primera vez, tres patrones de la enfermedad, los dos más comunes están la sepsis y la meningitis. El tercer grupo de ratones desarrollado un patrón de enfermedad leve durante los primeros 2 días de la infección. En los seres humanos, N. meningitidis está más comúnmente asociada con un rápido inicio de la meningitis y la sepsis grave, pero también pueden causar meningitis leve enfermedad sistémica. Por lo tanto, iv reto de ratones transgénicos con N. meningitidis humanos se asemeja a la enfermedad meningocócica características, apoyando el sistema como una herramienta útil para el estudio de la patogénesis meningocócica en vivo.

Imágenes in vivo e inmunohistoquímica demostró la acumulación de bacterias en la glándula tiroides de ratones transgénicos CD46 (Figura 4]. Este hallazgo nos animó a analizar la función de la tiroides de la medición de la hormona tiroidea T4 del nivel sérico. T4 es indetectable CD46 en ratones transgénicos después de 2 días, mientras que en ratones nontransgenic los niveles de T4 vuelto a la normalidad como las bacterias fueron absueltos. Estos datos indican que una alteración en la función tiroidea se asocia con enfermedad más grave. Liberación incontrolada de citoquinas proinflamatorias se produce después de la meningitis reto de CD46 ratones transgénicos [19]. La competencia por una cantidad limitada de factores de transcripción que participan en la síntesis de citoquinas, tanto la hormona tiroidea y el metabolismo podría explicar la consiguiente reducción de T4. Además, también es posible que disminuyeron los niveles de T4 inhibe la capacidad bactericida de los leucocitos polimorfonucleares (PMNLs), ya que las hormonas tiroideas puede ser una importante fuente de yodo para el myeloperoxidase-H 2 O 2-haluro antimicrobiana y citotóxica sistema PMNLs en humanos [24] . Curiosamente, en un modelo de rata sépticos hormona tiroidea la suplementación mostró un efecto beneficioso sobre la supervivencia de ambos y la gravedad de la sepsis [25]. Como se muestra en la Figura 4E, CD46 ratones transgénicos han constitutivamente niveles más bajos de T4 que los ratones control nontransgenic. Otros estudios se ocupará de CD46 cómo influye en la función tiroidea y si baja los niveles constitutivos T4 aumenta la susceptibilidad a la enfermedad meningocócica. Se ha informado de que T4 se reduce al principio de bacterianas y virales de meningitis infantil en pacientes humanos [26]. Sin embargo, no hay datos disponibles acerca de la frecuencia de trastornos de tiroides en curso en pacientes con la enfermedad meningocócica.

N. meningitidis puede adaptarse a la acogida del medio ambiente y el escape a través de las defensas inmunitarias y la fase de variación antigénica de superficie componentes. Algunos estudios experimentales de uretritis gonocócica en voluntarios humanos han demostrado que las proteínas Opa no son necesarios para la colonización inicial de N. gonorrhoeae a epitelio de acogida, en lugar Opa expresión proteica se ha seleccionado durante el curso de la infección [27]. En este estudio, N. meningitidis que reapareció en ratones en etapas posteriores de la infección, invariablemente, expresó Opa, independiente de los lugares de aislamiento. El inóculo no expresó Opa proteína detectables. Sin embargo, las bacterias que trasladadas a la PPC y la mucosa respiratoria en el día 1 después de la infección también carecían de Opa, lo que indica que estos pasos son independientes de Opa expresión. Nuestros datos sugieren que convertir en Opa expresión probablemente aumenta la etapa tardía meningocócica adaptación y supervivencia. Además, la reaparición de la bacteria meningococo muestra que son capaces de rápido crecimiento CD46 en ratones transgénicos.

Un interesante y novedoso encontrar en este estudio es la translocación de N. meningitidis a la mucosa respiratoria de CD46 ratones transgénicos iv después de la infección. El PilC1 mutante no llegó a la mucosa del tracto respiratorio superior, lo que indica que la interacción de bacterias con epitelio respiratorio es PilC1 dependientes y, probablemente, no a consecuencia de fugas vascular en la cavidad nasal. De este modo, los datos in vivo en este estudio apoyan anteriores hallazgos in vitro PilC1 que medie una interacción directa con las células epiteliales [22]. Ambos PilC1-expresando N. meningitidis y el PilC1 mutante inducida por bacteriemia, meningitis y liberación incontrolada de citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, PilC1 más probable es prescindible para la meningitis interacciones con las defensas del huésped inmune en la sangre y el paso a través del BBB. Dado que tanto la PilC1 mutantes y los de tipo salvaje tensión inducida similares respuestas proinflamatorias (Figura 6B], todavía es posible que la entrada de la PilC1 mutante en el LCR puede ser el resultado de la sepsis inducida por daño celular del BBB.

N. meningitidis llegado a la CSF y la mucosa respiratoria CD46 en ratones transgénicos, pero no en nontransgenic ratones, lo que sugiere que CD46 es un componente crítico de la enfermedad, ya sea por la interacción con las bacterias en el lugar de la translocación o de protección de bacterias en las primeras etapas que permite bacteriana supervivencia. Desde el PilC1 mutante no se encuentra en la mucosa respiratoria, pero cruzó la BBB, es probable que los mecanismos mediante los cuales N. meningitidis interactúa con estas dos barreras celulares son diferentes. En los seres humanos, CD46 se expresa en cuatro grandes isoformas, BC1, BC2, C1 y C2, en función de splicing alternativo de un extracelular serina / treonina y prolina rico dominio y la posibilidad de elegir entre una de las dos colas citoplasmáticas, Cyt-1 y Cyt-2 [28]. Se ha informado de que CD46 ratones transgénicos expresar distintas isoformas CD46 en la garganta y el epitelio BBB [18]. Por lo tanto, diferentes mecanismos para la adhesión bacteriana y la invasión podrían ser necesarias. Sin embargo, nuestros datos no puede excluir que un factor desconocido puede interaccionar con PilC1 en el epitelio respiratorio [29].

En conclusión, este estudio demuestra que bioluminiscente N. meningitidis cepas junto con el CD46 ratón transgénico modelo de proporcionar una potente herramienta para las investigaciones in vivo de la enfermedad meningocócica. Enfermedades de la dinámica y la orientación de tiroides durante la sepsis meningocócica puesto de manifiesto en este estudio podría conducir a nuevas estrategias para mejorar el resultado clínico en pacientes humanos.

Materiales y Métodos
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Escherichia coli DH5 α se utilizó para la clonación. N. FAM20 pertenece meningitidis del serogrupo C, MLST secuencia de tipo 11. El FAM20 PilC1 cepa mutante, FAM20 Δ pilC1, se ha descrito anteriormente [30]. Neisseria cepas se cultivaron a 37 ° C en el 5% de CO 2 en atmósfera GC agar (Difco) suplementado con Kelloggs, o en la GC-medio líquido, tal como se describe [19]. Para la selección de bioluminiscente N. meningitidis transformantes, kanamicina se añadió a concentraciones de 50 μ g / ml.

Generación de bioluminiscente N. meningitidis cepas

Plásmido pXen-13 que contiene el operón luxCDABE fue modificado para pLKMp de inserción de un promotor específico Neisseria secuencia, una secuencia de terminación, kanamicina gen de resistencia, absorción de secuencias de ADN y dos fragmentos de ADN homóloga a una no codificante región del genoma FAM20 (Figura 1A y Cuadro 1]. La resistencia a kanamicina gen fue amplificado de PCR pZErO-2.1 (Invitrogen) y clonado en un Sal I / Bam HI sitio del plásmido pXen-13. A 10-bp absorción secuencia de ADN necesarias para la transformación eficiente de ADN de Neisseria [31] se introdujo en el 5 'final de la kanamicina cassette. Porin proteínas son los componentes de mayor prevalencia de Neisseria la membrana externa y son esenciales para la supervivencia bacteriana [32]. Con el fin de aumentar el nivel de expresión del operón en luxCDABE N. meningitidis, un 390 bp secuencia promotora del gen de PORA cepa FAM20 PCR fue amplificado y clonado en un sitio Bam HI aguas arriba de la luxCDABE operón. Por otra parte, a 200 bp terminador de transcripción de la región gapdh gen de la cepa FAM20 fue amplificado y clonado en un sitio no me río abajo de la luxCDABE operón. El plásmido contiene el promotor Pora aguas arriba de la expresión luxCDABE casete fue nombrado pLKp. Además, un promotor sin plásmido se utilizó como control.

Para la integración cromosómica de plásmido pLKp por recombinación homóloga, dos fragmentos de ADN (CHU y DHS) de una región entre orf73 y orf74 de la FAM20 genoma, que no contiene secuencias de repetición invertida, fueron amplificados y clonados en el plásmido pLKp aguas arriba del gen kanamicina y después de la terminación, respectivamente. La expresión luxCDABE cassette se integró en el N. FAM20 meningitidis tensión y la correspondiente PilC1-mutantes deficientes. El método de transformación que se ha descrito anteriormente [33]. Ejemplar plásmido integración en el genoma bacteriano fue confirmado por análisis Southern blot (datos no presentados).

Mouse cepas

El hCD46Ge línea de ratones transgénicos fue creado usando B6C3F1 híbridos. Se alberga la totalidad de genes humanos CD46 y CD46 se expresa en un ser humano como patrón [34]. La F1 generación de C57BL / 6 y C3H/Hen ratones, es decir, B6C3F1, por lo tanto, fue utilizado como control nontransgenic en este trabajo. Todos los animales fueron criados en las instalaciones de animales de la microbiología y la biología del tumor Center, Karolinska Institutet, y en los animales de las instalaciones del Centro Biomédico, Universidad de Uppsala. Los experimentos se realizaron con 6-10 semanas de edad, la edad y el sexo con ajuste ratones y se repitieron durante cinco veces con resultados similares. El cuidado de los animales y los experimentos eran conformes a las directrices institucionales y que hayan sido aprobados por comités de ética nacionales.

Animal procedimientos

N. meningitidis fue suspendido en GC medio adecuado para las concentraciones de bacterias. Los ratones fueron infectados por ip o iv en la vena de cola. MCA fue retirado de la cisterna magna y la MCA muestras fueron controlados por la ausencia de glóbulos rojos antes de la difusión en agar la GC. Lavados nasales fueron recogidos como hemos descrito anteriormente [35]. Los órganos fueron extirpados de sacrificar ratones, pesadas y homogeneizada en PBS. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena de cola. Bacteriana se determinó en placas de diluciones seriadas de las muestras en placas GC.

Bioluminiscencia de imágenes

Para imágenes in vivo, los ratones fueron anaesthetized imágenes y por un máximo de 2 minutos utilizando un sistema de procesamiento de imágenes IVIS (Xenogen Corporation / Caliper Ciencias de la Vida), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Total de emisión de bioluminiscencia todo el ratón o zonas determinadas dentro de las imágenes de cada ratón fue cuantificado (en unidades de fotones) a través de la Vida paquete de software Image (Xenogen Corporation / Caliper Ciencias de la Vida). La oscura piel de los ratones se le rasuró lejos con el fin de aumentar la sensibilidad de detección de señales. Para los estudios in vitro, las imágenes de las placas bacterianas o disecados órganos fueron adquiridas con una exposición de 1 min. La bioluminiscencia señales se mantuvo estable en el tiempo ya que las bacterias recuperadas de los ratones produce señales similares en comparación con el inóculo. Por otra parte, la cuenta de bacterias en sangre en ratones fueron sépticos proporcional a la intensidad de las señales bioluminiscente lo largo del tiempo.

Inmunotransferencia, LOS preparación, la cápsula de medición, y la secuenciación del ADN

Expresión de meningitis opacidad (Opa) proteínas, pilus proteínas asociadas (PILC), y el tipo IV pili proteínas fue detectado por el análisis de inmunoblot. Preparación de la muestra y las condiciones de inmunoblot se han descrito anteriormente [36]. Opa-específica de anticuerpos monoclonales de ratón (H22.1, H21.1, 4B12/C11, y 7-24-D9) fueron tipo de regalos Dr Achtman M. (Max Planck Institut fuer Molekular Genetik, Berlín, Alemania) y el doctor J. Cannon (Universidad de Carolina del Norte, Estados Unidos). 4B12/C11 reconoce todas las proteínas Opa, H21.1 reconoce OpaB, H22.1 reconoce OpaA y OpaD, y 7-24-D9 reconoce OpaD [37]. PILC antisuero se generó en conejos contra la larga duración de PilC1 N. FAM20 meningitidis. Pili antisuero se produjo en conejos contra altamente purificada pili de N. meningitidis FAM20 [30]. LOS fue aislado, separado por tricine SDS-PAGE y visualizado por tinción de plata [33]. Cápsula de expresión está determinada por co-aglutinación análisis. El montón de genes independientes, de 5 de aislamientos de sangre, LCR y lavados nasales en diferentes puntos de tiempo después de la infección fue amplificado por PCR y secuenciado usando primers 5'-GATGCCGCAAATTTCCAATC-3 'y 5'-TCACGACCGGGTCAAACC-3'.

Histología e inmunohistoquímica

Los ratones fueron anestesiados y transcardially perfundidos con PBS. Los órganos fueron removidos, fijado en el 4% de paraformaldehído y embebidos en parafina. Para la detección de meningococo los cortes de tejido fueron incubadas con anticuerpos de conejo contra N. meningitidis (diluida 1:50; USBiological) durante 60 min, peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado de cabra anti-conejo IgG (diluida 1:50; BioRad) durante 60 min, utilizando tiñen y ImmunoPure metal reforzada sustrato DAB (Pierce). Por inmunohistoquímica fluorescentes, conjugado con FITC cabra anti-conejo IgG (diluido 1:100; Santa Cruz) se aplicó a un segundo anticuerpo. Las secciones se visualiza con Carl Zeiss Vision 2,05 axiológica de procesamiento de imágenes y análisis de sistema (Zeiss).

Determinación de IL-6 y tiroxina (T4) en suero

Las concentraciones de murino IL-6 y T4 en el suero del ratón se determinó por duplicado utilizando ELISA (Diaclone) y un Opticoat ® tiroxina (T4) inmunoensayo enzimático (EIA) kit (Biotecx Labs), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

El análisis estadístico

Las diferencias en las tasas de supervivencia fueron evaluados utilizando una prueba exacta de Fisher. Bacteriana en la sangre y los órganos fueron analizadas por no paramétrico de Mann-Whitney test. A dos caras de la t de Student prueba se utilizó para evaluar la importancia de citoquinas y ensayos de tiroxina. Los valores de P & lt; 0,05 se consideró significativo.

Apoyo a la Información

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