Genetic Vaccines and Therapy, 2007; 5: 2-2 (más artículos en esta revista)

Comparación de los diferentes sistemas de entrega de vacunación de ADN para la inducción de protección contra la tuberculosis en ratones y cobayos

BioMed Central
Lúcia de Paula (lucinha@fcfrp.usp.br) [1], L Célio Silva (clsilva@cpt.fmrp.usp.br) [2], Daniela Carlos (danicar@rpm.fmrp.usp.br) [1] , Camila Matias-Peres (pcamila@med.umich.edu) [1], Carlos A Sorgi (sorgi@rbi.fmrp.usp.br) [1], Edson G Soares (egsoares@fmrp.usp.br) [3 ], Patrícia RM Souza (souzaprm@rpm.fmrp.usp.br) [2], Carlos RZ Bladés (rodrigoz@rpm.fmrp.usp.br) [2], Fábio CS Galleti (galetti@cpt.fmrp.usp. br) [4], Vânia LD Bonato (vlbonato@fmrp.usp.br) [2], DC Eduardo Gonçalves (eduardo@cpt.fmrp.usp.br) [4], Érika Silva VG (erika@fcfrp.usp. br) [1], Lúcia H Faccioli (faccioli@fcfrp.usp.br) [1]
[1] Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Facultad de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av. ¿Café s / n, 14040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil
[2] TNP - Núcleo de Pesquisas em Tuberculose - Departamento de Bioquímica e Imunologia, Facultad de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil
[3] Departamento de Patologia, Facultad de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil
[4] Farmacore Biotecnologia Ltda, Rua dos Técnicos s / n, Campus da USP - Ribeirão Preto, SP, Brasil

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Resumen

Los grandes desafíos para los investigadores que trabajan en el campo de la vacunología son la optimización de vacunas de ADN para su uso en seres humanos o animales grandes y eficaz la creación de una dosis única de vacunas utilizando consignó la entrega vigilada. La codificación del ADN plásmido el calor de proteínas de choque-65 (hsp65) (DNAhsp65) ha demostrado inducir la protección y la respuesta inmune terapéutica en un modelo murino de tuberculosis (TB). A pesar del éxito de desnudos DNAhsp65 basada en la vacuna para proteger a los ratones contra la tuberculosis, que requiere dosis múltiples de grandes cantidades de ADN para la eficacia de la inmunización. Con el fin de optimizar esta vacuna de ADN y simplificar el esquema de vacunación, coencapsulated DNAhsp65 y el adyuvante dimycolate trehalosa (TDM) en biodegradables poli (DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) microesferas de administración de una dosis única. Por otra parte, un solo disparo-principal-impulsar la formulación de la vacuna sobre la base de una mezcla de dos diferentes PLGA microesferas, presentando más rápido y más lento de liberación, respectivamente, DNAhsp65 y la proteína recombinante hsp65 también fue desarrollado. Estas formulaciones fueron probadas en ratones, así como en los cerdos de guinea comparación con la eficacia y la toxicidad inducida por la preparación de ADN desnudo o BCG. El único-shot prime-impulsar la formulación de presentar claramente la buena eficacia y la disminución de la patología pulmonar en los dos ratones y conejillos de indias.

Fondo

La tuberculosis (TB) sigue siendo un importante problema de salud que afectan a millones de personas en todo el mundo [1]. La única vacuna contra la tuberculosis es actualmente disponibles Mycobacterium bovis BCG. Sin embargo, la eficacia de la BCG sigue siendo polémica, especialmente contra la tuberculosis pulmonar en adultos jóvenes, y el desarrollo de una vacuna mejor se necesita con urgencia para contrarrestar la amenaza mundial de la TB [2 - 4]. En los últimos 20 años, la tecnología de desarrollo de una vacuna ha cambiado radicalmente. La estrategia de utilizar el agente patógeno se ha dado paso a la creación de formas alternas de antígenos (como genes que codifican antígenos específicos), los nuevos adyuvantes y nuevos sistemas de entrega, así como el empleo de la recientemente elaborado prime-impulsar concepto [5 - 8]. Así, varias estrategias han sido empleadas para la generación y evaluación de nuevas vacunas contra la tuberculosis. Cepas de BCG recombinante, ADN basada en vacunas, vivas atenuadas M. vacunas contra la tuberculosis y vacunas de subunidades formulado con nuevos adyuvantes han mostrado promesa preclínicos en modelos animales desafío. La capacidad de vacunas de ADN para obtener Th1 sesgado las respuestas CD4 + y CTL fuerte respuestas hacen especialmente atractivo arma contra M. infección tuberculosa [9, 10].

Los datos experimentales recogidos durante varios años por nuestro grupo demostró que la vacuna de ADN que codifica la 65 kDa proteína de choque térmico de M. leprae (DNAhsp65) presentó un profiláctico y terapéutico efecto en un modelo murino de tuberculosis [11 - 13]. A pesar de que el efecto profiláctico demostró inicialmente con esta vacuna es igual en vivo de la vacuna BCG en los ratones y la característica de esta protección se asociaron con la presencia de CD8 + / CD44 hi IFN-γ-productores o las células citotóxicas [14] hubo una necesidad de optimizar la formulación de la vacuna con el fin de mejorar la eficacia y disminuir la toxicidad posible. La literatura sobre el plásmido de ADN en la vacunación sugiere que cuatro dosis de ADN desnudo se inyecta por vía intramuscular podría no ser suficiente para la generación de protección humoral y celular la respuesta inmune contra las enfermedades infecciosas en animales grandes [15 - 18]. Uno de los farmacéuticos medidas para mejorar las vacunas de ADN ha sido la de mejorar la captación de ADN en profesionales antígeno-células presentadoras de ADN utilizando atrapados en las partículas poliméricas. Biodegradables poli (láctico-co-ácido glicólico) microesferas (PLGA) representan un atractivo candidato para la vacuna contra entrega [19]. Por lo tanto, como una estrategia alternativa para conferir protección duradera contra la tuberculosis en ratones y cobayas, evaluamos la encapsulación de la hsp65-ADN y rhsp65 en PLGA microesferas biodegradables que tienen el potencial de la liberación de antígenos de manera sostenida. Debido a su capacidad para inducir la secreción de citoquinas Th1 en un patrón de respuesta inmune [11], dimycolate trehalosa (TDM), un glycolipid Mycobacterium de la pared celular, se incluyó en las formulaciones como coadyuvante. Por otra parte, más recientemente, un instrumento concebido para generar una protección duradera y de la respuesta inmune implica la combinación de diferentes vehículos de transporte de la misma inmunógeno en prime-heteróloga impulsar protocolos [20]. Estos prime-impulsar estrategias de vacunación consistirá en utilizar dos vacunas diferentes, cada una codificación del mismo antígeno, administrados por algunas semanas de separación. En la prevención de la tuberculosis, la principal estrategia de impulsar la combinación de ADN y el incremento de cebado con BCG o proteínas recombinantes ha sido evaluado por diversos autores [21, 22]. Tales protocolos suelen requerir más de una gran cantidad de ADN dosis de cebado, seguido de un refuerzo en vivo con vectores, así que impliquen la utilización de grandes cantidades de ADN. Teniendo en cuenta estos factores también evaluados tanto en ratones y conejillos de la utilización de un nuevo concepto en la formulación de la vacuna sobre la base de una mezcla de dos diferentes PLGA microesferas, presentando más rápido y más lento de liberación, respectivamente, la codificación de ADN hsp65 y hsp65 la proteína recombinante [20]. Nuestro objetivo era lograr el cebado de ADN y proteínas impulsar después de una sola dosis de vacunación.

Materiales y métodos
Animales

Outbred Mujeres Hartley conejillos de 300-350 g de peso y los adultos jóvenes ratones BALB / c se obtuvieron a partir de las instalaciones de producción animal del campus de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, y se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio estándar. Los animales infectados se mantuvieron en las instalaciones de riesgo biológico, alojados en jaulas dentro de un flujo laminar de seguridad recinto. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de conformidad con las directrices del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad.

Plásmido derivación

La construcción de un plásmido pVAX (Invitrogen), que contiene el citomegalovirus (CMV) y un promotor de codificación de cDNA el gen HSP65 de M. leprae (pVAX-HSP65) se ha descrito previamente [23]. El vector sin el gen hsp65 se utilizó como control. DH5 α Escherichia coli transformado con el plásmido pVAX o el plásmido conteniendo el gen hsp65 (DNAhsp65) se cultivaron en medio líquido LB (Gibco-BRL) con kanamicina (100 μ g / ml). Plásmido de ADN se obtuvo tal y como se describe en el plásmido EndoFree depuración manual (Qiagen, Ltd, Crawley, Reino Unido). Espectrofotométrico análisis utilizando Gene Quant II aparato (Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido) ha puesto de manifiesto las relaciones de 260/280 nm a ser ≥ 1,80. La pureza de los preparativos de ADN fue confirmada por el 1% en gel de agarosa.

Hsp65 proteína recombinante

E. coli BL21 transformado con el plásmido conteniendo el gen hsp65 micobacteria se cultivaron en LB medio que contiene ampicilina (100 μ g / μ l). El crecimiento bacteriano fue supervisado por espectrofotometría en un Shimadzu UV-1650 Espectrofotómetro. Cuando el OD alcanzado el valor de 0,6, la cultura fue inducida con 0,1 M de IPTG (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) y se incuba a 30 ° C bajo agitación durante 4 h. Purificación de proteínas se realizó tal como está descrita anteriormente [24].

Microesferas de preparación

Microesferas se obtuvieron por el sistema de doble emulsión / evaporación de solventes técnica tal como está descrita anteriormente [25]. En resumen, 30 ml de diclorometano solución que contiene 400 mg de polímero PLGA 50:50 o PLGA 75:25 (Resomerfrom Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) y 0,5 mg de TDM (Sigma, St Louis, EE.UU.) fue emulsionar con 0,3 ml de una interna fase acuosa que contiene 5 mg de ADN (DNAhsp65 o DNAv) o 1 mg de proteína recombinante hsp65 utilizando un Ultraturrax homogeneizadora T25 (IKA - Labortechnik, Alemania) para producir una primaria de agua en aceite emulsión. Esta emulsión se mezclan con 100 ml de un control externo fase acuosa que contiene el 1-3% de alcohol poli vinilo (Mowiol 40-88, Aldrich productos químicos, Wankee, WI, EE.UU.) como surfactante, para formar una estable de agua en aceite en - emulsión de agua. La mezcla se agita durante 6 h con una RW20 IKA homogeneizadora de la evaporación de disolventes. Microesferas se han recogido y lavar tres veces con agua estéril, liofilizado y almacenado a 4 ° C.

Análisis de partículas de diámetro, la tasa de proteínas y ADN encapsulado, los niveles de endotoxina, y la cinética de ADN y las proteínas de liberación

Distribución de partículas de diámetro fue evaluada por láser diffractometry Shimadzu en un aparato Sald 2164 (Shimadzu, Japón). Los resultados se expresan como valor medio de diámetro de distribución. Plásmido encapsulado tasa se determinó la adaptación de Barman et al. [26]. En resumen, 10 mg de microesferas se ressuspended en 0,2 ml de buffer TE y 500 μ l de cloroformo se añadieron a la suspensión. La mezcla se mantuvo bajo agitación durante 60 min. La muestra fue centrifugada a 14000 rpm durante 5 min y el sobrenadante fue separado para su análisis. La cantidad de ADN se determinó como se describe antes de usar el gen Quant II. La tasa de encapsulación de proteínas fue determinada después de la adición de 0,2 ml de acetonitrilo. La muestra se incubó en un baño de ultrasonidos durante 15 minutos que permite la solubilización completa de las microesferas y es seguido por adición de agua (1:1). El contenido de proteínas fue ensayada mediante el reactivo Comassie (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). La concentración de proteínas fue determinada a 600 nm utilizando un lector de ELISA (960, Metertech). La proteína kinectics de microesferas de liberación fue evaluada por ressuspending 30 mg de proteína de microesferas cargadas a 3 ml de PBS que contienen azida sódica (0,05% w / v). La suspensión se mantuvo a 37 ° C bajo constante agitación a 200 rpm. En pre-establecido intervalos de tiempo, las muestras del sobrenadante (0,1 ml) fueron recogidos y sustituidos con un nuevo buffer. La concentración de proteínas en el sobrenadante se determinó utilizando el reactivo Comassie tal como está descrita anteriormente [19]. La detección de endotoxina en las formulaciones se hizo de lisado de amebocitos de Limulus test (prueba LAL, QCL-1000, Bio Whittaker, CAMBREX). Con este fin, las microesferas se ressuspended en PBS y la suspensión se mantuvo en agitar hasta la completa homogeneización.

Procedimientos de inmunización

La inmunización, ya sea en ratones o cobayos fue por uno de los siguientes tratamientos, y de cinco a diez animales se utilizaron en cada grupo. Para la vacunación de ADN desnudo, el plásmido DNAhsp65 fue administrada por inyección intramuscular de 100 μ g de ADN en solución salina en cada músculo cuadriceps en tres ocasiones a las 2 semanas (dosis total de 300 μ g de plásmido). Adicional animales recibieron salina o el control de vectores (DNAv) utilizando la misma cantidad y periodicidad de los tratamientos. BCG (cepa Pasteur) se dio como una sola inyección subcutánea de aproximadamente 10 5 bacterias vivas a 50 μ l de solución salina. Los animales recibieron una dosis única de una inyección intramuscular de 2,5 mg de microesferas a 50 μ l de solución salina en cada músculo cuadriceps. Dos formulaciones de microesferas se evaluaron: DNAhsp65/TDM-loaded PLGA 50:50 microesferas (Me-DNAhsp65/TDM) y una mezcla (1:1 w / w) de DNAhsp65/TDM-loaded PLGA 50:50 microesferas y hsp65 proteína recombinante / TDM-cargado PLGA 75:25 microesferas (Me-Prime/boost). Adicional animales recibieron DNAvector / TDM-cargado PLGA 50:50 microesferas (Me-control).

Desafío infección de animales vacunados

Guinea cerdos y ratones fueron retados por vía intratraqueal con 10 5 unidades formadoras de colonias (UFC), de M. tuberculosis H37Rv, 30 días después de la última inmunización. Los animales fueron muertos 30 días después de la infección y el número de bacterias vivas en los pulmones se determinó como UFC en placas de 10 veces diluciones seriadas de tejido homogeneizado en Middlebrook 7H11 agar (Difco), contando las colonias después de 21 días y los resultados se expresaron como log 10 UFC / g de tejido pulmonar.

Histología

El lóbulo superior izquierdo de cada animal se fijó en formalina al 10%, embebidos en bloques de parafina, preparados sistemáticamente, entonces seccionó para microscopía de luz. Secciones (5 μ m cada uno) fueron teñidas con hematoxilina bien y eosina método. Infiltrado celular en parenquima pulmonar se analizó por medidas morfométricas. Los resultados se expresaron como porcentaje de infiltrado celular en el parénquima pulmonar de los animales previamente vacunados con diferentes formulaciones y desafió con M. la tuberculosis.

El análisis estadístico

Los resultados se expresaron como media (±) SD. Importancia de la diferencia entre los grupos se calculó la t de Student pruebas.

Resultados
Encapsulación eficiencia y las características físicas de DNAhsp65/TDM-loaded microesferas

Plásmido de ADN, fue incorporado PLGA microesferas de la doble emulsión / método de la evaporación de disolventes. Encapsulación eficiencia varió de 30 a 50% de ADN y alrededor del 70% de proteína. El cuadro 1 muestra la cantidad de trampas a ADN y las proteínas en las diferentes formulaciones. En este trabajo, las partículas fueron diseñados para tener un diámetro inferior a 10 μ m. Encapsulación de partículas de ADN fueron mayores en el diámetro que resume las microesferas de proteínas (Cuadro 1]. La asociación de TDM con proteínas o ADN en microesferas no cambiar el diámetro o el ritmo de carga después de encapsulación. Microesferas de la población presenta características de distribución gaussiana de diámetro. Las formulaciones de microesferas También se analizaron para la detección de endotoxina actividad utilizando el ensayo de amebocitos de Limulus (LAL test). Nos mostró en el Cuadro 1 que la actividad de endotoxina en todas las formulaciones de microesferas fue inferior a 0,4 UE / mg. De acuerdo con la Farmacopea Europea, el nivel de seguridad para la administración endovenosa es de 5 UE / Kg / hora que corresponde al 0,1 ratón por la UE (20 g) por hora.

In vitro de la proteína hsp65, TDM y perfiles de ADN liberación de PLGA microesferas

La liberación in vitro perfiles de proteína recombinante hsp65 atrapadas en PLGA microesferas se evaluaron in vitro para más de 120 días. Los resultados mostraron que las microesferas en libertad a todos los encapsulados en una proteína de 90 días de intervalo. La mayoría de la proteína fue puesto en libertad después de 50 días (Figura 1]. La formulación Me-DNAhsp65/TDM puesto en libertad alrededor del 80% de su ADN o TDM (no se muestra) la carga después de 20 días.

Protección contra M. replicación de la tuberculosis en los pulmones de animales vacunados

Como se muestra en el Cuadro 2, una dosis única de Me-DNAhsp65/TDM formulación fue capaz de proteger a los ratones, así como conejillos de indias contra M. la tuberculosis con tanta eficacia como tres dosis de desnudos DNAhsp65. Hubo una reducción significativa del número de carga bacteriana en comparación con ratones control, que es similar a la reducción prevista de la BCG en los dos modelos animales, que, por tanto, puede considerarse como una buena protección. El mismo nivel de protección tal como se describe para Me-DNAhsp65/TDM se observó en ratones y cobayas vacunados con Me-Prime/boost en la formulación de una dosis única.

El análisis histológico de los pulmones de ratones y cobayos vacunados y desafió con la cepa virulenta de M. la tuberculosis

Treinta días después del desafío, los animales fueron sacrificados y los pulmones fueron procesados para su análisis histológico. No vacunados y animales impugnada se utilizaron como grupo control y los resultados se ilustran en el cuadro 3. Hemos observado que en los ratones del grupo control (no vacunados y M. tuberculosis-infectados) en torno al 70% del parénquima pulmonar estaba comprometida con formación de granulomas ampliamente distribuida, presentando infiltrado celular que contiene principalmente los linfocitos, macrófagos con pocos y sin neutrófilos. Los ratones o cobayos inyectados con DNAhsp65 (ADN desnudo) presentó una muy baja y similar en peligro de los pulmones. Sin embargo, había pocos y pequeños granulomas en este grupo con infiltrado de células compuesto por linfocitos, macrófagos, neutrófilos y plasmocitos sin áreas necróticas. El grupo vacunado con la formulación presentada Me-DNAhsp65/TDM inferior del pulmón comprometer con los macrófagos y los linfocitos de infiltración, así como algunas infiltraciones neutrofílica (Tabla 3]. Me-Prime/boost ratones vacunados presentó también inferior del pulmón comprometer con la infiltración celular caracterizada por gran cantidad de macrófagos. En algunas zonas de tejidos mostraron linfocitos concentran en los alrededores de los bronquios.

Discusión

La alta incidencia de TB en todo el mundo y la incapacidad de BCG para proteger a ciertos grupos de población indican claramente que una mejor vacuna contra la tuberculosis es necesario. Actualmente, muchas vacunas están en desarrollo y hay un deseo de simplificar los calendarios de vacunación al disminuir el número de dosis. Con este fin, diversas sustancias se han añadido a las vacunas y algunas formulaciones se han elaborado en un intento de hacer vacunas más eficaces [27]. A pesar del éxito de desnudos DNAhsp65 basada en la vacuna para proteger a los ratones contra la tuberculosis, que requiere dosis múltiples de gran cantidad de plásmido para la eficacia de la inmunización, lo que podría dar lugar a una exacerbada reacción inflamatoria en los pulmones de ratones o impugnado conejillos de indias. Para optimizar esta vacuna de ADN, hemos utilizado un enfoque que integre los adyuvantes con la orientación y immunostimulatory propiedades preparado por las técnicas de microencapsulación son administrados conjuntamente con la codificación de ADN de antígenos. BALB / c ratones inmunizados con una dosis única de Me-DNAhsp65/TDM-loaded microesferas producido altos niveles de anticuerpos contra el subtipo IgG2a y grandes cantidades de IFN-γ en ratones tal como está descrita anteriormente [20, 24]. Aquí mostramos que Me-DNAhsp65/TDM-loaded microesferas también fueron capaces de conferir protección tan eficaz como el que alcanzó después de tres dosis de ADN desnudo administración, ya sea en ratones o cobayos. Esta nueva formulación también de un diez veces en la reducción de dosis de ADN en comparación con el ADN desnudo, así como una reducción significativa en el infiltrado celular en el parénquima pulmonar de ratones y conejillos de indias. Por lo tanto, esta combinación de vacunas de ADN y adyuvantes con inmunomoduladores y la preselección del operador posee propiedades las posibilidades de una mejor vacuna contra la tuberculosis. PLGA microesferas biodegradables también tienen el potencial de actuar como mediadores de la transfección de ADN específicas para células fagocíticas, como los macrófagos o células dendríticas, y para proteger contra la degradación biológica de nucleasas [28, 29]. Anteriormente muestran que DNAhsp65-cargados de microesferas sin adyuvante fue incapaz de proteger a ratones contra el reto [23]. De este modo, el atrapamiento de ADN además de una immunostimulant compuesto en PLGA microesferas podría ser una estrategia interesante para la formulación de la vacuna. El efecto adyuvante de TDM purificada en respuesta inmune ha sido reconocido desde hace mucho tiempo [30]. El immunostimulatory las actividades de TDM un atractivo candidato para uso adyuvante en la formulación de la vacuna. Por otra parte, el polímero tiene un historial de seguridad clínica y su lenta degradación sostenida de entrega de permisos de antígeno [31]. Por lo tanto, si la calidad de la inmunidad depende de la persistencia de antígeno, o si el cumplimiento terapéutico se ve comprometida debido a la socio-económica o circunstancias demográficas, PLGA-como microesferas ofrecen una ventaja potencial para las vacunas.

Un poco más elaborado instrumento para generar una protección duradera y de la respuesta inmune implica la combinación de diferentes vehículos de transporte de la misma inmunógeno en prime-heteróloga impulsar protocolos [20]. Estos prime-impulsar estrategias de vacunación consistirá en utilizar dos vacunas diferentes, cada una codificación del mismo antígeno, administrados por algunas semanas de separación. La mayor parte primordial de impulsar protocolos actualmente en evaluación incluyen el cebado con el ADN e impulsar con vectores virales [32, 33]. Esta estrategia resucita las cuestiones relativas a la seguridad del uso de virus vivos atenuados que han sido sustituidos por las subunidades o vacunas de ADN por sí solo. En la prevención de la tuberculosis, la principal estrategia de impulsar la combinación de ADN y el incremento de cebado con BCG o proteínas recombinantes ha sido evaluado por diversos autores [17, 19]. Tales protocolos suelen requerir más de una dosis de ADN para el cebado, seguido de un refuerzo en vivo con vectores, así que impliquen la utilización de grandes cantidades de ADN. Como se ha indicado anteriormente, la encapsulación del antígeno en PLGA microesferas permite el desarrollo de liberación controlada de los sistemas de suministro, en la que la liberación perfil de los materiales encapsulados pueden adaptarse a propósitos específicos. Aprovechando este hecho, hemos evaluado el uso de una vacuna basada en la formulación de una mezcla de dos diferentes PLGA microesferas, presentando más rápido y más lento de liberación, respectivamente, ADN-hsp65 y la rhsp65 (Figura 1]. Nuestro objetivo era lograr el cebado de ADN y proteínas impulsar después de una sola dosis de vacunación. Hemos demostrado con anterioridad en ratones [20], que la formulación Me-Prime/boost inducida por altos niveles de anti-hsp65 anticuerpos e IFN-γ, que sigue siendo alta 90 días después de la vacunación, mientras que la formulación Me-DNAhsp65/TDM no pudo sostener niveles de anticuerpos de la misma manera. En este sentido, muestran que los ratones o cobayos desafiado con una cepa virulenta de M. tuberculosis, 30 días después de la vacunación, se observó significativamente menor número de CFUs en los pulmones de los vacunados con Me-Prime/boost formulación que en los pulmones de los controles. Por otra parte, nos mostró que la infección se mantuvo bajo control y el parénquima pulmonar no afectados solamente en el grupo vacunado con la formulación Me-Prime/boost. Estos datos sugieren que Me-Prime/boost es una fórmula capaz de sostener la respuesta protectora en ratones y conejillos de indias. Por lo tanto, utilizando microesferas biodegradables en una dosis única parece ser una estrategia prometedora para estimular a largo plazo la respuesta inmune en los animales grandes.

En este estudio, nos propusimos superar importantes obstáculos que enfrentan en la actualidad para la utilización del ADN en el desarrollo de una vacuna. Hemos descrito, por primera vez, el desarrollo de una dosis única o principal de impulsar la formulación de vacunas de ADN para la inmunización de ratones y conejillos de desafío contra la micobacteria. Esta nueva tecnología permite radicalmente diferentes enfoques para los problemas de la inmunización con vacunas de ADN. Por otra parte, utilizando combinaciones de vacunas y otros tipos de vías de administración permitirá a los investigadores a adaptar los programas de vacunación. Por otra parte, esta nueva técnica puede aumentar veterinario y aceptación de los pacientes de vacunación de reducir el número de inyecciones y evitar el uso de Impulsores contienen vectores vivos. Utilizando esta tecnología, vaccinologists podría desarrollar muchas vacunas de ADN que podría inducir formas específicas de la inmunidad, acceso a nuevas rutas de entrega, proporcionar una mayor seguridad en caso necesario, ser más estable y reducir los costes. Creemos que esta estrategia puede aplicarse a las vacunas para los seres humanos y para otras vacunas veterinarias, que tengan un tremendo impacto en el control de las enfermedades infecciosas en los seres humanos y en animales grandes.

Autores de las contribuciones

Trece investigadores participaron en este estudio. LP y CLS son los principales investigadores en este estudio. DC, CMP, CAS y EVGS participó en la accomphished experimentos con cobayas. BSA ayudó con el análisis histológico. Experimentos con ratones fueron realizadas por personas con movilidad reducida, FCSG, EDCG, VLDB y CRZB en el laboratorio de CLS y la Compañía Ltda Farmacore Biotecnología, que también comparte su experiencia en la vacuna de ADN. La mayoría de la investigación se realizó en el laboratorio de LHF que coordinó el proyecto y siempre crítico de entrada y asistencia.

Agradecimientos

Damos las gracias a Izaira T. Brandão y Ana S. Mason para la asistencia técnica. Fundação de Amparo un Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y el Instituto do Milênio REDE TB apoyado este estudio.