Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2007; 5: 2-2 (más artículos en esta revista)

Mejora de la generación de anti-tumor inmunidad de limitación de dosis de antígenos

BioMed Central
Joshua D Shofner (joshua.shofner @ yale.edu) [1], Juan Vásquez G (Gabriel.vasquez @ yale.eu) [1], Carole L Berger (carole.berger @ yale.edu) [1], Richard L Edelson (redelson@yale.edu) [1]
[1] Departamento de Dermatología, la Universidad de Yale, 333 Cedar Street, New Haven, CT EE.UU.
[2] Yale Comprehensive Cancer Center, Universidad de Yale, 333 Cedar Street, New Haven, CT EE.UU.

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Resumen
Fondo

El maligno cutáneo de células de linfoma de células T (LTC) mostrar péptidos inmunogénicos derivados de la clonal del receptor de células T (TCR) que proporciona un atractivo modelo para el perfeccionamiento de la lucha contra el tumor de inmunización metodología. Para producir un cuadro clínico significativo de lucha contra la respuesta tumoral, inducción de citotóxica contra las células-LTC debe ser aprovechado al máximo mientras supresores de células T reguladoras (TREG) deberían reducirse al mínimo. Hemos demostrado que engulfment de LTC células apoptóticas por células dendríticas (DC) puede dar lugar a cualquiera de anti-CD8 LTC respuestas o inmunosupresores TREG inducción. TREG generación se favorece cuando el número de células apoptóticas disponibles para la ingestión es elevada.

Métodos

En este estudio, hemos tratado de determinar si el equilibrio entre la inmunidad y la inmunosupresión podría ser desplazado hacia un anti-CD8 LTC respuesta de la reducción de la proporción de células apoptóticas LTC disponibles para DC ingestión. LTC apoptosis de las células fue producido por el compromiso de la TCR de anti-anticuerpos CD3, colocada en bolas magneticas.

Resultados

La perturbación física inherente a paso a través de una columna de separación inducida por los monocitos a diferenciar en DC, demostrado por el aumento de expresión de clase II y CD86 y disminución de expresión de los monocitos marcador CD14. El inmaduro DC internalizado y procesado LTC células apoptóticas y podría llegar a presentar el tumor derivado de péptidos en el contexto de MHC clase I y II. A medida que el número de células apoptóticas aumentado, se produjo un incremento dosis-dependiente de la expresión de marcadores TREG CTLA-4, CD25, y FoxP3, con una proporción de células apoptóticas / DC de carga de> 10:1 correspondiente a la mayor TREG inducción. Estos inducible fenotípica TREG también funcionalmente inhibió CD8-mediada perforin expresión in vitro. En niveles más bajos de células apoptóticas / DC de carga <5:1, hubo una expansión de las células T CD8 compartimiento con un aumento de perforin expresión y el aumento de LTC muerte celular, lo que indica anti-tumor actividad.

Conclusión

Estos resultados demuestran que la proporción de células apoptóticas suministrados a DC es un importante factor determinante de si CD8 anti-tumor inmunidad o inmunosupresión se genera.

Fondo

Cutánea linfoma de células T (LTC) es una denominación general que unifica un grupo diverso de presentaciones clínicas sobre la base de histopatológico e inmunológicas criterios. La malignidad es una proliferación clonal de las células T epidermotropic [1 - 3], que llevan un uniforme común del receptor de células T (TCR) y también mostrar la superficie celular expresión de una memoria (CD45RO +), inductor (CD4 +), cutáneo y la vivienda antígeno leucocitario (CLA +) fenotipo. Al principio las células del tumor localizar en la piel de los pacientes afectados, en torno a las células de Langerhans que contribuyen al crecimiento de las células LTC [4]. A medida que la enfermedad progresa, las células malignas se vuelven más pobremente diferenciado y, a menudo, hematogenously propagación por todo el cuerpo, como la leucemia pronóstico mucho peor pronóstico. Es la primera epidérmica foco de células T malignas en torno a una central de células de Langerhans [5], un inmaduro miembro de la célula dendrítica (DC) serie [6], que es el sello distintivo de diagnóstico de la enfermedad, la Pautrier microabscess [2]. LTC células tumorales carecen de la co-estimuladoras moléculas necesarias para desencadenar una respuesta inmune que contribuye a su capacidad para evadir la inducción de la lucha contra el tumor y, por tanto, la inmunidad, persisten y difundir. A pesar del papel de la DC en la prestación de proliferación apoyo a la malignidad, DC inmunoterapia ha demostrado el beneficio clínico de esta enfermedad [7, 8].

Recientemente hemos descubierto que el paso de células de pacientes LTC a través de un anti-CD3 bolas magnéticas columna puede alcanzar los simultánea inducción de apoptosis en las células T malignas población y la diferenciación de los monocitos a la población la creación, después de un día para la cultura, una población de tumor-cargado DC capaz de iniciar una respuesta inmune in vitro [9]. Esta columna basada en el método de generación de tumor-cargado DC utiliza el mecánico descubrió a principios extracorpórea photopheresis (ECP), la primera la FDA aprobó la inmunoterapia para el cáncer [10]. Los ensayos clínicos de ECP han mostrado tasas de respuesta de 73% en etapa avanzada LTC pacientes con un muy seguro perfil de efectos secundarios [11]. ECP ha sido recientemente modificado por la adición de un paso de incubación de la noche a la mañana. El nuevo procedimiento que se ha denominado "Transimmunization", en el que las células T malignas fueron prestados por apoptosis ultravioleta A (UVA) de luz activado foto-8-methoxypsoralen (8-MOP) y se tragó ávidamente por inmaduros DC, cuya transición de monocitos se inició por la perturbación física produce cuando las células se pasaron por la exposición a los rayos UVA placa de la ECP aparato. En Transimmunization, la transición y la DC apoptosing leucocitos son co-cultiva la noche a la mañana para permitir engulfment de la apoptosis y la posterior procesamiento y presentación del tumor derivado de péptidos antes de volver a la infusión en la acogida [12].

Hemos demostrado previamente que cuando LTC células autólogas DC encuentro cargado con un alto número de células apoptóticas, adoptan el fenotipo y la función de T reguladoras (TREG) las células, expresando altos niveles de los marcadores TREG CTLA-4, CD25, y FoxP3, como así como de secretar interleucina-10 (IL-10) y la transformación del factor de crecimiento-β (TBF-β) y la represión normal de células T antígeno impulsado por la secreción de interleucina-2 (IL-2) e interferón-γ (IFN-γ) [4 ]. La inducción de la respuesta de TREG LTC células pueden estar obstaculizando la eficacia de las inmunoterapias para LTC, y la comprensión de su mecanismo de inducción es muy importante para la generación de más eficaz la inmunoterapia.

En estos experimentos, se trató de determinar si el nivel de apoptosis de células de carga controlada por el equilibrio entre el desarrollo de un anti-tumor y la respuesta inmune celular inmunosupresores TREG generación. Hemos encontrado que cuando menor número de células apoptóticas fueron procesados por la DC, las células T CD8 respuesta podría ser estimulada, mientras que en los niveles superiores de células apoptóticas la utilización de DC que podría inducir a las células LTC TREG inhibir la conversión y la de células T CD8 respuesta.

Métodos
Población de pacientes

Las muestras se obtuvieron a partir de una cosecha de leukapheresis LTC pacientes (de acuerdo con las directrices de la Yale humanos comité de investigación) que reciben tratamiento estándar con ECP. Todos los pacientes con enfermedad avanzada clonal T CD4 + en las poblaciones de células presentes en la circulación periférica como es determinada por immunophenotyping con anticuerpos frente a la variable región clonotypic de la familia o TCR específicos reacción de polimerasa en cadena para detectar reordenamientos de la beta o gamma cadena de la TCR como así como las células T CD8 compartimentos> 10% de la población de linfocitos circulantes.

De aislamiento de células

El Día 0, sangre periférica de células mononucleares (MNL) fueron aisladas de la cosecha leukapheresis mediante centrifugación en un ficoll-hypaque gradiente seguido de dos lavados en RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD), que contiene 10% de suero AB y 2 mM EDTA. Una alícuota del MNL fue aislado, purificado, y cultivadas para su posterior re-Además en el Día 1. Dentro de esta alícuota, CD4 + y CD8 + son células de la columna purificado utilizando 40 μ l Mac-α humano CD4 y CD8 microbolas (Miltenyi Bioteck, Auburn CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La enriquecido CD4 + y CD8 + células T (> 97% ± 0,5% y CD4 +> 98% ± 0,5% CD8 +, respectivamente) se suspendieron en RPMI 1640 con un 15% de suero autólogo y IL-2/IL-7 cultivadas individualmente y por separado en los pozos de un 12 y placa de cultivo de tejidos (Falcon). Otra alícuota del Día 0 aislados MNL estaba reservado para construir la apoptosis de células DC y las curvas de dosis-respuesta, y los controles. MNL (2 × 10 7) de la cosecha leukapheresis fueron incubadas con 40 μ l Macs α-CD3 microbolas humanos a raíz de la instrucciones del fabricante. Como anteriormente se ha descrito [9], LTC células CD3 vinculante para el dictado de anticuerpos células T malignas apoptosis. Como control, otra parte de MNL (2 × 10 7) se incubó con 40 μ l Macs α-CD4 microbolas humanos. Tras los veinte minutos de incubación, las células se pasa a través de la columna de bolas magnéticas, permitiendo la separación de la MNL, ya sea en CD3 + y-CD3 o fracción CD4 + y CD4-fracciones. El-CD3 y CD4 tratados tratados con células fueron cultivadas en 3 ml RPMI 1640 que contiene 15% de suero AB. En algunos experimentos, el aumento de dosis de CD3 de células tratadas han sido agregadas a 10 5 DC autólogas obtenidas de la columna eluido a crear las curvas de dosis-respuesta. Los controles consistieron en dosis crecientes de CD4 de las células tratadas LTC añadido a 10 5 autólogo DC.

El Día 1, la columna cultivadas individualmente purificado-CD4 y CD8 células (10 6) se han añadido a la CD3 tratada con apoptosis de células de carga DC, así como los CD4 tratados de control de población. Después de una segunda noche a la mañana la cultura, las células han sido recolectados, contados, y immunophenotyped de marcadores de células T, DC, Tregs, y apoptosis.

Immunophenotyping

Con el fin de supervisar el enriquecimiento de la purificado CD4 + y CD8 + y las poblaciones de células a medir el efecto de carga DC con diferentes número de apoptosis de células T malignas, las células fueron teñidas por dos colores de inmunofluorescencia con un panel de anticuerpos frente a los monocitos, DC , Tregs, y las células T citotóxicas. Las células (1 × 10 6) fueron incubadas con 10-20 μ l de fluorocromo anticuerpo monoclonal conjugado durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Los anticuerpos fueron directamente conjugado con fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) e incluye a: CD3-FITC (pan de células T); CD4-FITC (inductor de células T); CD8-FITC (células T citotóxicas); CD25-FITC (IL2 receptor); CD14-FITC (monocitos); HLA-DR-FITC (anti-clase II molécula MHC) y CD86-PE (B7.2 co-estimuladoras molécula) y sus controles de isotipo. Las células fueron lavadas una vez y suspendida en PBS y leer en un citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter) dentro de las 24 horas.

Combinada y la membrana citoplasmática de tinción se realizó tras las instrucciones del fabricante para la fijación de células y permeabilización (Intraprep kit, Beckman Coulter). Antibody combinaciones incluyen: membrana CD4-FITC/cytoplasmic CTLA4-PE (inhibidor miembro de la co-estimuladoras familia); membrana CD3-FITC/cytoplasmic CTLA4-PE; membrana CD4-FITC/cytoplasmic FoxP3 (inhibidor factor de transcripción); membrana-CD3 FITC / citoplásmica Apo2.7-PE (apoptosis); membrana CD8-FITC/cytoplasmic perforin-PE (citotóxicos gránulo); isotipo y controles (Beckman Coulter). Los datos fueron analizados utilizando el software CXP (Beckman Coulter).

Evaluación Estadística

La expresión de marcadores de DC y la inducción de un TREG o células T citotóxicas respuesta fueron evaluados estadísticamente en 3 a 5 replicar las culturas de la t de Student o prueba de si los datos se distribuyen normalmente no la de Mann-Whitney Rank Sum Ensayo con el análisis Sigma Stat programa.

Resultados
LTC células apoptóticas prestados por unión de los anticuerpos CD3

MNL como monocitos y LTC células obtenidas de una cosecha de leukapheresis LTC pacientes fueron pasados a través de un anti-CD3 bolas magnéticas columna para inducir apoptosis en los antígenos de células experimentado LTC y fueron co-cultivadas con la columna-passaged monocitos. Como control, una parte alícuota de los leucocitos fue aprobada a través de un anti-CD4 magnética columna de bolas, y estas células viables LTC se cultivaron con autólogo DC de la misma manera que la apoptosis de células T. En la Figura 1, la apoptosis se determinó mediante la medición de la co-expresión de la membrana de células T CD3 marcador y frente al citoplasma de la expresión de marcadores de apoptosis temprana APO2.7. El primer Día 0 aislada, el porcentaje de CD3 + células que expresan el marcador de apoptosis APO2.7 fue 0,646%. Después de un día para la cultura, el 6,96% de la población de células T obligado a anti-CD4-anticuerpo conjugado con las bolas fue apoptosis. Cuando los linfocitos fueron tratados con anticuerpos CD3-conjugado con bolas, un 2,96 veces mayor (P ≤ 0.001) en el porcentaje de apoptosis de las células T se encontró (20,576%). Por lo tanto, LTC células tratadas con anti-CD3 de anticuerpos fueron prestados apoptosis en un porcentaje significativamente mayor y se denominan células apoptóticas LTC para todos los futuros experimentos. Los LTC células tratadas con anti-CD4 anticuerpos existe un porcentaje significativamente mayor de células viables y se indican como viable para el resto de los experimentos.

El paso de los monocitos a través de la columna magnético induce la diferenciación DC

LTC células apoptóticas fueron co-cultivadas con la columna-passaged monocitos y de los marcadores que se sabe que hasta reguladas DC durante la diferenciación [12] fueron analizados después de un día para la cultura a fin de determinar la capacidad de paso por la columna de bolas magnéticas para conducir la evolución de la población en los monocitos DC. En la diferenciación de los monocitos inmaduros DC se midió mediante el control de cambios en la expresión de los monocitos marcador, CD14, y marcadores DC, clase II y CD86. La pérdida de expresión de CD14 fue revelada por una disminución en la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la CD14 fluorocromo de primaria aislamiento en Día 0 seguido por co-cultivo con células viables LTC. La reducción máxima de CD14 IFM se encontró cuando la columna-passaged monocitos fueron co-cultivadas con LTC células apoptóticas prestados por anticuerpos CD3 (Figura 2A]. Un 43% de reducción de expresión de los monocitos marcador CD14 se encontró en comparación con el nivel expresado en monocitos aislados en el día 0 (P ≤ 0,005). No hubo diferencias significativas en la reducción de la expresión CD14 diferenciar entre DC cultivadas con células viables o LTC LTC células apoptóticas. Sin embargo, la adición de tumor de células apoptóticas una mayor disminución en la expresión CD14, mientras que la presencia de células viables LTC no era tan eficaz en la estabilización de los monocitos a la conversión DC.

Además, la expresión de clase II y CD86 aumentó significativamente (P ≤ 0.017-P ≤ 0,029, respectivamente) a co-cultura con la columna disociados DC alimentados LTC células apoptóticas en comparación con los controles Día 0. Clase II expresión aumento del nivel encontrado en Día 0 monocitos a un aumento intermedio se encuentran en la transición DC inmadura que había sido co-cultivadas con células viables LTC (P ≤ 0,011) para la máxima visto aumentar cuando las células apoptóticas LTC (Fig. 2B ) Fueron co-cultivadas con los inmaduros DC. A 5,5 veces mayor en la clase II se encontró expresión cuando la DC fueron alimentados LTC células apoptóticas y en comparación con los monocitos aislados en el Día 0. Expresión de la co-estimuladoras molécula CD86 también aumentó desde el día 0 para el aumento intermedio se encuentran en transición DC inmadura que había sido co-cultivadas con células viables LTC (P ≤ 0.029) para el máximo aumento de la DC alimentados LTC células apoptóticas (Fig. 2C]. Un 25,8 veces mayor en la expresión CD86 se encontró cuando DC que ha sumido en apoptosis se compararon con los monocitos a prueba el aislamiento de los productos básicos. Por lo tanto, la aprobación de LTC células a través de un anti-CD3 bolas magnéticas columna y posterior co-cultura de las nuevas células apoptóticas LTC con la columna monocitos activados generados DC significativamente mayor diferenciación. Co-cultura de la columna de monocitos activados con células viables LTC también fue eficaz en la generación de inmaduros DC, pero la adición de células apoptóticas LTC mejorar la adopción y la estabilización de este fenotipo.

La inducción de un fenotipo TREG

Recién purificado LTC células fueron incubadas con DC la noche a la mañana que había ingerido un gran número de células apoptóticas LTC utilizando una célula apoptótica LTC a DC ≥ ratio de 10:1. Una parte de la respuesta celular LTC población aprobó el fenotipo de células T reguladoras, expresando el marcador de superficie celular CD25 y los marcadores frente al citoplasma de CTLA-4 y FoxP3. CTLA-4 fue hasta regulada en el citoplasma de las células LTC expuestos a las autotransfusiones DC que habían sumido un gran número de células apoptóticas (Fig. 3C], en comparación con el grupo control (Fig. 3B] y el principal aislar el día 0 (Fig 3A ). LTC membrana celular expresión de CD25 a una mayor cooperación con la cultura autólogo DC que habían sumido un gran número de células apoptóticas LTC (Fig. 3E], en comparación con los controles (Fig. 3D]. El LTC células viables fueron también parte activa para expresar el aumento de membrana CD25 (Fig. 3D], pero no otros marcadores de conversión TREG (Fig 3B & 3F]. Citoplásmica expresión de FoxP3 aumento de 13,9 veces tras incubación con autólogo DC que habían sumido un gran número de células apoptóticas (Fig. 3G] en comparación con la población control (Fig. 3F]. Así, por co-cultivo recién purificado LTC con células autólogas DC que han sumido un gran número de células apoptóticas LTC, las células responder LTC adoptar un fenotipo específico para TREG células.

Se realizó una curva dosis-respuesta mediante la adición de un número cada vez mayor de LTC células que habían sido prestados por apoptosis de incubación con anticuerpos CD3-conjugado con bolas magnéticas a las culturas de la noche a la mañana la columna generada por la transición DC. Se encontró que en presencia de la columna generados DC que habían ingerido células apoptóticas LTC, el porcentaje de respuesta LTC células que expresaron CTLA-4 como un aumento del número de células apoptóticas disponibles para DC ingestión en la co-aumento de la cultura (Fig 4A] . Una dosis de 0,3 × 10 6 células apoptóticas alimentados a 10 5 DC inducida por sólo 4,88% de los recién añadido LTC células para expresar frente al citoplasma de CTLA-4. A medida que la dosis de células apoptóticas LTC se elevó a 1,5 × 10 6 y 3,0 × 10 6, el porcentaje de recién añadido LTC células que expresan CTLA-4 aumentó a 12,83% y 18,6% respectivamente. Por el contrario, como un control, además de un creciente número de células viables LTC a la constante serie de DC hicieron muy poco para mejorar el porcentaje de células que expresan LTC CTLA-4. Además, como la dosis de células apoptóticas alimentado a un número constante de aumento de DC, el porcentaje de CD4 + T células que expresan FoxP3, la característica fenotípica de Tregs, así como un aumento (Fig. 4B]. En 0,1 × 10 6 células apoptóticas alimentado a un número constante de DC, el porcentaje de células que expresan LTC FoxP3 fue de 1,45%, mientras que un 10 veces mayor en la apoptosis de células de dosis a 1,0 × 10 6 dado lugar a un 5.8 veces mayor a 8,41% de T CD4 + células que expresan FoxP3. Este incremento dosis-dependiente de FoxP3 expresión no se observó en el grupo control, donde un número cada vez mayor de CD4 tratados con células viables LTC se han añadido a un número constante de DC. Por lo tanto, la generación de CTLA4 + / + FoxP3 TREG células pueden ser controlados, hasta cierto punto, por el nivel de células apoptóticas alimentados a la DC.

TREG LTC suprimir las células CD8 mediada perforin expresión

Como el porcentaje de LTC células que fueron estimulados a adoptar un fenotipo TREG aumentado, el porcentaje de linfocitos T CD8 + en co-expresión de la cultura perforin, un gránulo que medie CD8 + T efectoras de citotoxicidad celular [13], inversamente disminuyó (Fig. 5] . El porcentaje de CD3 + / + CTLA4 células se incrementó de 4,88% a 18,6% (Fig. 5A] en presencia de DC cargado con un creciente número de células apoptóticas. Al mismo tiempo, hubo una reducción en el porcentaje de células que expresan co-CD8/perforin, de 19,68% a 9,87% en la dosis más alta de células apoptóticas se utiliza para cargar la DC. Del mismo modo, como el porcentaje de células que expresan CD4 + / + FoxP3 aumentó de 1,45% a 8,41% (impulsados por una alta dosis de apoptosis de células de carga DC), el porcentaje de linfocitos T CD8 + que expresan perforin se redujo drásticamente a partir de 36,69% a 5,58% (Fig. 5B], la identificación de un posible umbral de 1-1.5 × 10 6 apoptosis cells/10 5 DC necesaria para la inducción de un fenotipo TREG autólogo de la DC. Por lo tanto, cuando LTC células son inducidos a adoptar un fenotipo TREG de co-cultivo con autólogo DC que han ingerido un gran número de células apoptóticas LTC, que mostrará las características fenotípicas de TREG, una conversión que pueda mediar en la reducción del porcentaje de CD8 Las células T que perforin expresar.

La expansión de las células T CD8 compartimiento siguientes co-autólogo con la cultura DC que han ingerido bajo número de células apoptóticas

A continuación trató de determinar si controlar los niveles de apoptosis de células T añadido a DC podría cambiar el equilibrio de represión hacia la generación de anti-tumor inmunidad de carga DC autólogo con escaso número de células apoptóticas. Para ello, DC autólogo fueron alimentados con un alto número de células apoptóticas LTC (por encima del nivel demostrado TREG de inducción) y un bajo número de células apoptóticas LTC, y la expansión de las células T CD8 población se vigila. El porcentaje de células T CD8 aumentaron en un 83% en el grupo de CC alimentado bajo número de células apoptóticas T (p ≤ 0,042), en comparación con el Día 0 muestras (Fig. 6A]. Además, el número absoluto de células T CD8 recuperado de la noche a la mañana la cultura de la columna-passaged DC cargadas con células apoptóticas LTC también aumentó en un 20% en comparación con el primer Día 0 nivel de células T CD8 (Fig. 6B]. Ampliación de la células T CD8 compartimiento fue mayor cuando DC fueron co-cultivadas con un menor número de células apoptóticas T, por debajo del umbral de TREG inducción, y esta ampliación de las células T CD8 población podía tener el potencial de generar anti-tumor inmunidad.

Perforin aumento de la actividad y el aumento de células T después de la muerte de carga de la autotransfusión DC con un escaso número de células apoptóticas

El aumento de células T CD8 compartimiento encontró cuando recién purificado linfocitos T CD8 + fueron co-cultivadas con autólogo DC que se había cargado con un bajo número de células apoptóticas también demostraron una mayor actividad perforin. El porcentaje de linfocitos T CD8 + que expresan perforin, los principales citotóxica gránulo de que las células efectoras CD8 mediar en su lucha contra el tumor efectos, pasó de 8,4% (Fig 7A] a 13,8% (Fig. 7B] cuando se redujo la dosis de células apoptóticas alimentados a la DC. Este aumento de actividad perforin no se observó en el control de la población, donde las células viables fueron co-incubadas con autólogo DC. Además, el aumento de la actividad perforin traducido en aumento de manera significativa la muerte de las células T (p ≤ 0.038) en el agregado CD3 + LTC población de células T cuando las células T CD8 fueron co-cultivadas con escaso número de células apoptóticas y DC (Fig. 7E]. En estas condiciones, hemos encontrado que el 57% más LTC células fueron asesinados en comparación con el nivel de la muerte de las células obtenidas DC cuando fueron cargados con un alto número de células apoptóticas y principal utilizado para las células T CD8. Ningún cambio significativo en LTC muerte celular se observó cuando LTC células viables se han añadido a la DC. Estos resultados indican que la expansión de células T CD8 población no sólo demuestra el aumento de perforin expresión fenotípica, sino que también es funcionalmente competente para mediar en el aumento de la apoptosis en el recién añadido LTC células.

Discusión

El desarrollo de la DC más eficaz basada en la inmunoterapia se ha visto obstaculizada por una serie de factores, que van desde la duración de la cultura DC necesarias para el desarrollo in vitro, así como una falta de conocimiento de la mayoría de las fases de maduración DC necesario para una eficaz lucha contra - tumor de vacunación [14]. Además, el modo más adecuado para la fuente de antígenos de carga DC aún no se ha determinado, con una variedad de estrategias existentes, incluyendo: purificado péptidos [15]; tumor orientada por vectores virales [16]; tumor / DC híbridos; toda la apoptosis de células tumorales, y tumor lisados de haber sido intentado y ha dado lugar a sustanciales en la variabilidad a largo plazo las respuestas clínicas [17].

Utilizando una columna de bolas magnéticas, hemos sido capaces de generar potencialmente inmunogénica DC en un desfile de moda que ofrece varias ventajas con respecto a las metodologías existentes: 1) DC generado de esta forma se puede obtener después de una sola noche a la mañana la cultura, mucho más rápido que los actuales métodos de cultivo que puede tomar hasta 7 días, 2) células apoptóticas en su conjunto se utilizan como una fuente de antígenos de tumor, asegurando que el espectro de LTC antigenicidad se incorpora a la DC en lugar de singular antígenos conocidos que no podrá ser óptima o se puede perder como el tumor de - la diferencia; 3) El paso de los monocitos a través de la columna matriz induce la diferenciación sincronizada de una gran población de monocitos en DC, lo que permite la generación de una más sólida fuente de APC se muestra un espectro de antígenos a re-inyección, 4) La rapidez y la facilidad de manipular las subpoblaciones celulares de células apoptóticas LTC y de antígenos de células presentadoras permite la posibilidad de optimizar la facilidad las poblaciones de células y factores añadido con la esperanza de crear más eficaz la inmunoterapia clínica.

En estos experimentos, tratamos de seguir nuestro entendimiento de las condiciones que favorecen la inducción de células TREG tras la exposición a las autotransfusiones DC co-cultivados con un gran número de células apoptóticas LTC. El uso de las bolas magnéticas columna ofrece una nueva vía para la rápida generación de tumor de carga DC debido a que la variedad de componentes celulares inherentes a la diferenciación de DC puede ser valorados para optimizar la dosificación con este método.

En nuestros estudios, LTC células fueron incubadas con anticuerpos anti-CD3 de anticuerpos antes de que el paso por la columna de bolas magnéticas, que hacen que el antígeno previamente las células T malignas apoptosis, como se ha demostrado anteriormente. Además, el uso de anti-CD4 de anticuerpos para la separación de CD4 + LTC células para ser utilizado como control de población, al mismo tiempo, no alterar las células LTC. La membrana perturbación inherentes a los monocitos paso por la columna matriz física estimula su transición en DC [18]. DC diferenciación se midió por la reducción de expresión de los monocitos marcador CD14 y el incremento en la expresión de clase II y CD86. En todos los casos, cambios significativos en la expresión de estos marcadores celulares se encontraron, lo que indica que la columna passaged monocitos fueron diferenciando en DC y que co-cultura de la DC con la maduración de apoptosis de células T malignas más estimulado su entrada en la vía de DC. La diferenciación de los monocitos utilizando membrana de estimulación, como en el paso por la columna matriz, es ventajoso, en particular en el establecimiento de la inmunoterapia del cáncer, puesto que se ha demostrado que la perturbación física es uno de los medios más eficaces de la cooperación transfronteriza, cebado phagocytosed péptidos en el MHC clase Yo camino, que es crucial en la generación de un anti-CD8 respuesta tumoral [18].

Tras la generación de potencialmente inmunogénica DC a través de la columna de bolas magnéticas, tratamos de determinar si TREG conversión podría ser inducido. La carga de células dendríticas con un gran número de células apoptóticas, en una proporción de> 10 en apoptosis a 1 DC, hemos podido demostrar que las células LTC puede ser inducida a asumir algunas de las fenotípicas y características funcionales de las células TREG. Estos hallazgos se correlacionan con el trabajo de Berger et al, que ha demostrado que la co-cultura de recién purificado LTC con células autólogas DC cargado con un gran número de células apoptóticas LTC puedan inducir a un perfil TREG en la respuesta LTC población celular, uno que ha fenotípica y características funcionales asociados a las células TREG [4]. TREG son un subconjunto de células T que componen el 5-10% de las células T periféricas población, y están implicados en el mantenimiento de la tolerancia periférica y la prevención de la enfermedad autoinmune, que regula la respuesta a agentes infecciosos, los tejidos trasplantados, y la libre antígenos [19 -- 21]. TREG se caracterizan por su capacidad para suprimir la respuesta inmune principalmente mediante la inhibición normal de células T antígeno impulsado por la proliferación [22, 23]. TREG se han encontrado en mayor número en los tumores sólidos, y se considera actualmente como uno de los principales obstáculos a los beneficiarios respuestas clínicas en las inmunoterapias [24]. La eliminación de la supresión TREG población ha demostrado mejorar los resultados de la inmunoterapia del cáncer en ambos modelos de ratones y los ensayos clínicos en una serie de neoplasias [24].

A medida que la dosis de células apoptóticas LTC alimentado a un número constante de aumento de DC, expresión de la TREG asociada a los marcadores CTLA-4, CD25, y también aumentó FoxP3 concomitantemente. Además, parece que hay un umbral de proporción de células apoptóticas: DC que correspondía con la inducción de la TREG fenotipo. A medida que la apoptosis de células: DC proporción aumentó de 5:1 a 10:1, expresión de la característica de las células TREG, FoxP3, un aumento de casi cuatro veces, lo que indica que quizá puede haber algún puesto de control interno DC relacionado con el número de procesados en apoptosis que regula la generación de una respuesta inmune frente a una represivas. Aunque los mecanismos concretos de este proceso siguen sin estar claros, podemos especular que tal vez las células T CD8 respuesta se favorece cuando baja el número de péptidos se presentan mientras que la inducción de una respuesta inmunosupresora requiere una mayor carga de antígenos y la presentación de niveles elevados de péptidos en MHC clase II . En nuestros experimentos, inducida por la fenotípica Tregs también muestra algunas capacidades funcionales, ya que fueron capaces de suprimir CD8 mediada perforin expresión en co-cultura; una observación, que si se tienen en cuenta en vivo, puede explicar algunas de las fallas en la generación de anti - tumor de inmunidad con los actuales inmunoterapias. Estos resultados están en concierto con nuestros estudios anteriores que demostraron que las células cultivadas LTC puede ser estimulada a asumir un TREG fenotipo y la supresión de la función normal de células T impulsado por la respuesta inmune cuando son expuestos a la DC que han ingerido en apoptosis [4]. En nuestros estudios actuales, que demuestran que, además, recién aisladas células LTC puede ser impulsado a adoptar una TREG fenotipo de la noche a la mañana la exposición a la DC cargado con un gran número de células apoptóticas.

Al establecer que TREG células podrían ser rápidamente generados utilizando este método, que luego trató de determinar si ese delicado equilibrio entre la DC y sus alrededores el número de células apoptóticas se podrá pasar en la otra dirección, hacia el fomento de una más vigorosa respuesta inmune. Al reducir la dosis de células apoptóticas procesados por una constante serie de DC, fuimos capaces de inducir la expansión significativa de las células T CD8 compartimiento. Esta ampliación de las células T CD8 compartimento no sólo contiene un mayor porcentaje de células que expresan perforin sino también mediada por el aumento de la muerte de las células T en el agregado de células LTC población. En términos de las inmunoterapias, estos resultados tienen importantes pistas sobre los posibles mecanismos de supervivencia del tumor tras el tratamiento. Si demasiado agresivo se intenta matar a las células tumorales con la esperanza de carga DC con gran número de antígenos tumorales, puede conducir a la generación de TREG y represión de la deseada respuesta inmunitaria. Un conjunto considerable de literatura existe apoyo a la idea de que la diferencia entre la DC la capacidad de inducir tolerancia o mediar la inmunidad puede estar determinado por su persistente exposición al antígeno. [25, 26] En nuestros experimentos, los DC que fueron expuestos a un mayor número de células apoptóticas y, por consiguiente, había más persistentes inducidos por la exposición de antígenos de la supresión de células T CD8 población. Estos resultados respaldan la labor anterior y contribuir a reforzar el papel de la apoptosis en la inducción de la inmunosupresión. [27, 28]

A better understanding of the role of Treg cells in immunotherapy is crucial because while they hamper the effectiveness of cancer immunotherapy [ 24 ], Treg may be of great value for the therapy of autoimmune disease and transplantation tolerance. [ 21 , 29 ] The ability to use rapid methods such as the magnetic bead column allows for optimization of existing methodologies so that we can improve our understanding of apoptotic T cell and DC interactions, with the goal of creating more effective cancer immunotherapy.

Conflicto de intereses

Drs. Berger, Edelson, and Yale University hold patents pertaining to the Transimmunization procedure.

Autores de las contribuciones

JDS and JGV carried out the experiments presented in this manuscript. CLB and RLE have defined the preliminary observations upon which this manuscript is based and provided intellectual guidance and supervision for the reported work and manuscript.

Agradecimientos

The authors wish the acknowledge research support from the Doris Duke Clinical Research Foundation, JDS, CLB and RLE.