BMC Developmental Biology, 2007; 7: 7-7 (más artículos en esta revista)

Las bajas concentraciones de la transformación del factor de crecimiento-beta-1 induce tubulogenesis cultivadas en células epiteliales mamarias

BioMed Central
Roberto Montesano (Roberto.Montesano @ medecine.unige.ch) [1], Fabio Carrozzino (Fabio.Carrozzino @ medecine.unige.ch) [1], Priscilla SOULIÉ (Priscilla.Soulie @ medecine.unige.ch) [1]
[1] Departamento de Fisiología Celular y Metabolismo, Universidad de la Escuela de Medicina de Ginebra, CH-1211 Ginebra 4, Suiza

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Resumen
Fondo

La formación de tubos de ramificación es un paso fundamental en el desarrollo de los órganos glandulares. Para identificar las señales extracelulares que orquestar tubulogenesis epiteliales, que empleó un ensayo in vitro en los que EpH4-J3B1A células epiteliales mamarias forma esferoidal quistes cuando se crece en geles de colágeno en virtud de suero libre de condiciones, sino que forman túbulos ramificados en presencia de suero de ternera fetal (FCS ).

Resultados

Los primeros experimentos mostraron que la tubulogenesis de inducir la actividad de FCS fue notablemente aumentado por el calor (70 ° C) o transitoria a la acidificación pH3. Por lo tanto, la hipótesis de que el agente se tubulogenic transformación del factor de crecimiento-beta (TGF-beta), una citoquina que está presente en el suero en forma latente y puede ser activado por el calor o el tratamiento ácido. Hemos encontrado que de hecho la actividad de tubulogenic acidificadas FCS sea anulada por otra parte ya sea de SB-431542, un inhibidor selectivo de la TGF-beta del receptor de tipo I, o una anticuerpos neutralizantes a TGF-beta-1. Por otra parte, además de bajas concentraciones (20-100 pg / ml) de la exógena TGF-beta-1 recapitula el efecto de acidificadas FCS para inducir la morfogénesis de tubos huecos. En cambio, las mayores concentraciones de TGF-beta-1 inducida por la formación de finos cordones celulares carece de un nivel detectable lumen. Para obtener información sobre los mecanismos subyacentes a TGF-beta-1 inducida por formación de tubos, se evaluó el posible papel de metaloproteinasas de la matriz (MMPs). De Western blot y gelatina zymography, se observó un incremento dosis-dependiente de MMP-9 a TGF-beta-1 tratamiento. Formación de tubos fue suprimida por una sintética de amplio espectro metalloproteinase inhibidor recombinante de tejido inhibidor de metaloproteinasas-2 (TIMP-2) y de un inhibidor selectivo de MMP-9, lo que indica que este proceso requiere morfogénesis de la actividad de MMP-9.

Conclusión

En conjunto, nuestros resultados proporcionan pruebas de que, en bajas concentraciones, TGF-beta-1 promueve la MMP-dependiente tubulogenesis ramificación de las células epiteliales mamarias in vitro, y sugieren que desempeña un papel similar durante el desarrollo de la glándula mamaria en vivo.

Fondo

La formación de tubos ramificados desde un principio ramificados epiteliales yema es un proceso de morfogénesis fundamental en el desarrollo de muchos órganos, incluido el páncreas, glándula mamaria, pulmón, riñón y [1, 2]. Aunque los mecanismos celulares y moleculares de tubulogenesis se entiende todavía incompleta, un polipéptido número de factores de crecimiento han demostrado para estimular la formación y ramificación de tubos epiteliales [3]. El más caracterizado a fondo de estas citoquinas son tubulogenic hepatocitos factor de crecimiento / factor de dispersión (HGF / SF) [4 - 6], las células gliales derivadas de neurotrópica factor [7, 8], y varios miembros del factor de crecimiento de fibroblastos familia [9, 10].

Elucidación de los mecanismos responsables de tubulogenesis epiteliales se hace difícil por la multiplicidad y la complejidad de las interacciones se producen las células in vivo. Para superar este inconveniente, varios grupos, entre ellos nuestra propia han diseñado en tres dimensiones de cultivo celular con precisión que los sistemas de recapitular los principales acontecimientos del tubulogenesis, lo que facilita su análisis molecular [11]. El reciente desarrollo de un modelo experimental en el que EpH4-J3B1A células epiteliales mamarias forma esferoidal quistes cuando se crece en geles de colágeno en medio químicamente definido [12] ha aportado un nuevo ensayo tractable para descifrar el conjunto de señales que rigen ramificación tubulogenesis.

La transformación del factor de crecimiento-β (TGF-β) es la prototypic miembro de una superfamilia de citoquinas estructuralmente relacionadas que participan en la regulación de un amplio espectro de procesos biológicos, incluida la proliferación celular, diferenciación, apoptosis, la producción de matriz extracelular, y la reparación tisular. Tres TGF-β isoformas (denominado TGF-β1, TGF-β2 y TGF-β3) se han descrito en los mamíferos. TGF-β s son secretados inactivos como complejos, en la que el C-terminal madura homodimer no es unida covalentemente a un dímero de su N-terminal del polipéptido precursor, también conocido como péptido asociado de latencia (LAP). El PAL, a su vez, es el disulfuro de la servidumbre no vinculados a una proteína, lo que se conoce como latente TGF-β proteína de unión (LTBP). TGF-β activación, es decir, la liberación de TGF-β de LAP, puede ser mediado por mecanismos diferentes y representa un paso crítico en la regulación de TGF-β bioactividad [13]. TGF-β s pleiotrópicos alcanzar sus actividades a través de la activación de complejos heteroméricos de transmembrana serina / treonina quinasa de receptores designados como TGF-β tipo I (T β RI) y tipo II (T β RII) receptores. Unión a ligando T β RII induce a la contratación y transphosphorylation de T β RI. T activados β del receptor de GH phosphorylates asociada a Smads (Smad2 y Smad3), que luego se unen Smad4 y translocate al núcleo, donde regulan la transcripción de genes objetivo. Además de Smads, otras vías de señalización, incluida la mitogen-activated proteínas quinasas (MAPK), también pueden ser activadas por TGF-β s [14 - 18].

Aquí, nos informan de que concentraciones bajas (20-100 pg / ml) de TGF-β1 induce rápidamente formación de tubos en cultivos de células epiteliales mamarias, y que esta respuesta biológica requiere la actividad MMP.

Resultados
Una bomba de calor, y resistente al ácido factor de suero bovino estimula la ramificación tubulogenesis de EpH4-J3B1A células epiteliales mamarias

Este estudio fue llevado a la conclusión de que la adición de FCS para suero libre de gel de colágeno J3B1A culturas de células [12], un derivado clonal de la EpH4 murino de células epiteliales mamarias línea [19 - 21], estimula la formación de tubos ramificados. Cuando crecido en geles de colágeno en químicamente definidos por el medio suplementado con todo-trans-ácido retinoico, las células formadas J3B1A esferoidal quistes adjuntando una patente lumen [12]. Además del 10% FCS a preformados quistes inducida por la radial resultado de tubo-como estructuras de la pared del quiste. FCS-inducida por la formación del tubo fue más pronunciada en geles que habían sido puestos en libertad y permitir que flotan en el medio (R. Montesano, datos no publicados), posiblemente debido a la mayor cumplimiento irrestricto de las matrices de colágeno [22, 23]. Flotante geles se utilizaron para el resto de este estudio.

La capacidad del FCS para estimular la formación de ramificación tubos de gel de colágeno en los cultivos de células J3B1A sugirió la existencia de una supuesta tubulogenic factor (o factores) en el suero. Experimentos preliminares el objetivo de caracterizar las propiedades físico-químicas de los niveles séricos de factor (s) puso de manifiesto que la tubulogenesis de inducir la actividad de FCS no sólo es resistente al calor, pero en realidad fue reforzada por el calor (70 ° C, 10 min; datos no muestra). Tubulogenic La actividad fue también notablemente por el aumento transitorio de la acidificación de FCS a pH 3. Así, la adición de tan sólo el 1% acidificadas FCS J3B1A a las células cultivadas en geles de colágeno en medio definido suscitó una enérgica respuesta tubulogenic sólo dentro de 24-48 horas (Fig. 1a, b].

El componente en tubulogenic FCS es TGF-β1

Sobre la base de las conclusiones anteriores, hemos considerado la posibilidad de que el factor fue tubulogenic TGF-β, una citoquina que está presente en el suero en forma latente y puede ser activado por el calor o el tratamiento de ácido [24 - 26]. Para probar esta hipótesis, lo primero que evaluó si el tratamiento previo con SB-431542, un inhibidor selectivo de la TGF-β del receptor de tipo I [27, 28], impediría el efecto de tubulogenic acidificadas FCS. Se encontró que el ramificación tubulogenesis fue suprimida por el SB-431542 en un dependiente de la dosis de forma (Fig. 1C, G]. A fin de validar la hipótesis de que el agente en tubulogenic FCS es TGF-β, y para determinar el potencial de TGF-β isoforma responsable de la inducción de la ramificación tubulogenesis, tratada con ácido FCS se pre-incubaron con isoforma específica de anticuerpos neutralizantes a cualquiera de TGF - β1 o TGF-β2 antes de ser añadido a las células J3B1A en geles de colágeno. Anti-TGF-β1 anticuerpos derogó el efecto de tubulogenic acidificadas FCS en una dosis-dependiente manera, una inhibición significativa (p <0,025) que se observó con las concentraciones de anticuerpos, precios tan bajos como 50 ng / ml (Fig. 1D, H]. En contraste, ni una función de bloqueo anti-TGF-β2 de anticuerpos (Fig. 1E], ni un control de anticuerpos que no reacciona con el TGF-β s (Fig. 1F] inhibe la actividad de tubulogenic acidificadas FCS. Estos resultados claramente identificados TGF-β1 como la tubulogenic agente presente en FCS.

Las bajas concentraciones de exógeno TGF-β1 recapitular el efecto de tubulogenic acidificadas FCS

A continuación pregunta si exógenos TGF-β1 pueden ser capaces de recapitular la actividad de tubulogenic tratada con ácido FCS. Como TGF-β1 se conoce para obtener diferentes respuestas celulares en el mismo tipo de células dependiendo de su concentración, se examinaron los efectos de una amplia gama de concentraciones de TGF-β1. Además de baja concentración (20 a 100 pg / ml) de recombinación del TGF-β1 estimula la rápida formación de ramificación tubular outgrowths de la pared de los quistes original (Fig. 2B]. En un aumento mayor, la outgrowths se observaron a adjuntar una patente lumen, que a menudo se continua con la cavidad quística (Fig. 2D]. El examen de semi-delgadas secciones tubulares confirmado la naturaleza de TGF-β1 inducida centrífugas outgrowths (Fig. 2E]. El tubulogenic efecto de TGF-β1 ya era evidente después de 24 horas y el aumento de forma progresiva durante los próximos 2-3 días de tratamiento. En ligeramente mayores concentraciones (200-500 pg / ml), TGF-β1 inducida por la ampliación del señalado outgrowths carece de una luz visible (no se muestra). Por último, la incubación con TGF-β1 en concentraciones superiores a 500 pg / ml dio como resultado la conversión de los quistes en desorganizado, lumen de menos agregados celulares, a partir de la cual numerosos celulares delgados cordones extendido radialmente en torno a la matriz (Fig. 2C]. Similares se observaron efectos siguientes recombinante Además de TGF-β2 o TGF-β3 (datos no presentados). Estos resultados indican que, cuando se añade a las culturas de gel de colágeno de J3B1A células en el intervalo de concentración de 20-100 pg / ml, exógenos TGF-β s inducir la morfogénesis de estructuras tubulares huecas que recuerdan de la glándula mamaria conductos. Sobre la base de las conclusiones anteriores, posteriores experimentos fueron diseñados para caracterizar con mayor detalle la actividad de tubulogenic bajas concentraciones de TGF-β1. Un análisis cuantitativo demuestra que TGF-β1 provoca la formación de outgrowths tubular en una dosis-y tiempo-dependiente manera, una parte significativa (p <0.0005) se observó efecto después de 48 horas de tratamiento con TGF-β1 concentraciones tan bajas como 20 pg / ml (Fig. 2F].

Para determinar si el TGF-β1 inducida tubulogenesis depende de la interacción de células con fibrillas de colágeno o podría ocurrir también en otros tipos de tridimensional matrices, el próximo examinado el TGF-β1 respuesta J3B1A de células en suspensión en geles de fibrina. Cuando crecido en geles de fibrina en medio definido, J3B1A células esféricas formado quistes (Fig. 3A]. En fuerte contraste, en presencia de 20-100 pg / ml TGF-β1, las células formadas túbulos ramificados (Fig. 3B, C]. Además de TGF-β1 a concentraciones superiores a 200 pg / ml inducida por el desarrollo de complejos y muy arborized redes de ramificación y anastomosing cordones de células (Fig. 3D], que sin embargo se carece de una luz visible, de manera similar a lo que había observado en geles de colágeno (ver arriba).

Un análisis cuantitativo demuestra que TGF-β1 tubo provoca la formación de fibrina en geles en una dosis-y tiempo-dependiente de forma muy significativa (p <0.0005) se observó efecto después de 48 horas de tratamiento con TGF-β1 concentraciones tan bajas como 20 pg / ml (Fig. 3E]. Por último, se evaluó el efecto de TGF-β1 en las células cultivadas J3B1A en Matrigel, laminina ricos matriz extracelular [29]. Contrariamente a lo que hemos observado en colágeno o fibrina geles, tanto control y TGF-β1 tratados con células esferoidal formado colonias en Matrigel. La falta de formación de tubos experimental en este escenario es poco probable debido a un efecto inhibitorio de un componente Matrigel, porque J3B1A células mostraron una sólida tubulogenic respuesta a TGF-β1 (50 pg / ml) cuando se crecen en una mezcla de 1:1 y Matrigel colágeno tipo I (datos no presentados). Estamos especular que las células suspendidas en Matrigel puro, que es un muy conformes no fibrilar sustrato [30], no son capaces de generar las fuerzas de tracción necesarios para centrífugas fruto en torno a la matriz.

Inhibidores de la p38 MAPKs derogar TGF-β1 inducida tubulogenesis

Además de la Smad mediada por la vía de señalización, montaje de pruebas indica que TGF-β también activa varios mitogen-activated proteínas quinasas (MAPKs), incluida la señal extracelular-quinasas reguladas (ERKs), c-Jun N-terminal quinasas (JNKs) y quinasas p38 [31 - 34]. Para empezar a evaluar la contribución de MAPKs a TGF-β-inducida ramificación tubulogenesis, hemos utilizado varios pequeña molécula de inhibidores que bloquean selectivamente las ERK, JNK o p38. Pretratamiento de gel de colágeno con culturas U0126, un inhibidor selectivo de la MEK1 activadores de ERK y MEK2 [35], atenuada TGF-β1 inducida por ramificación tubulogenesis en un dependiente de la dosis de forma, un 63% de inhibición se observó a 20 μ M (Fig. 4B , D]. Del mismo modo, además de SP600125, un inhibidor de JNK [36], se tradujo en un 65% de inhibición de tubulogenesis a 20 μ M (Fig. 4D]. Sorprendentemente, el p38 inhibidor PD169316 [37], fue comparativamente mucho más eficaz en la represión de TGF-β1 inducida por la formación de túbulos, con un 88% de inhibición se observó con una concentración tan bajos como 5 μ M y una inhibición casi total a 20 μ M (Fig. 4C, D]. Estos hallazgos sugieren que MAPK (y, en particular, p38) de señalización es necesaria para TGF-β1 inducida tubulogenesis. La validación de esta hipótesis se esperan nuevos estudios con desmontables de MAPKs de siRNA tecnología.

TGF-β1 inducida por ramificación tubulogenesis requiere MMP actividad

Formación del epitelio de los tubos de colágeno en geles ha sido demostrado que requieren la actividad de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [38 - 41]. Para evaluar el papel potencial de MMPs en TGF-β1 inducida tubulogenesis, hemos examinado el efecto de TGF-β1 en la producción de MMPs implicados en la matriz extracelular (ECM) la degradación, incluidos los de tipo membrana-MMP-1 (MT1-MMP o MMP-14), 72 kDa gelatinasa (MMP-2), 92 kDa gelatinasa (MMP-9), y la colagenasa-3 (MMP-13) [42]. En el norte de mancha, MT1-MMP (MMP-14) mRNA es constitutivamente expresadas por las células J3B1A pero aparentemente no moduladas por TGF-β1, mientras que MMP-2 mRNA no fue detectado. En contraste, los niveles de MMP-9 se incrementaron mRNA de TGF-β1 en un dependiente de la dosis manera (datos no presentados). Western blot confirmó la falta de modulación de MT1-MMP (MMP-14) y el dependiente de la dosis de inducción de MMP-9 (Fig. 5A]. Western-Blots también puso de manifiesto que MMP-13 es constitutivamente J3B1A expresadas por las células, y que esta expresión no es ostensiblemente modulada por TGF-β1 (Fig. 5A]. Por zymographic análisis [43], acondicionado de los medios de comunicación sin tratar J3B1A células producen una banda de gelatina lisis correspondientes a la presunta peso molecular (102-105 kDa), de la forma latente de ratón MMP-9. El tratamiento con TGF-β1 dado lugar a un marcado incremento dosis-dependiente de esta actividad. En contraste, en consonancia con la falta de detección de MMP-2 mRNA, no proteolíticas actividad que corresponde al peso molecular de MMP-2 se detectó en el control o TGF-β1-células tratadas (Fig. 5B].

Para determinar si la actividad MMP es necesaria para TGF-β1 inducida tubulogenesis, lo primero que evaluó el efecto de TGF-β1 (50 pg / ml) en presencia de la Hidroxamato basada en metalloproteinase inhibidor BB94 [44]. Formación de túbulos ramificados se derogó en forma dosis-dependiente de manera BB94, pero no por los relacionados con el isómero inactivo BB1268 (Fig. 6A-C]. Desde Hidroxamato basados en inhibidores de inactivar también miembros de la familia de adamalysin metaloproteinasas [45, 46], el próximo utilizados recombinante de tejido inhibidor de metaloproteinasas-2 (TIMP-2), más que suprime selectivamente la actividad de MMPs [47]. TIMP-2 (2 μ g / ml) inhibió TGF-β1 inducida tubulogenesis (Fig. 6D] de 84,6% (p <0.0005; n = 30 colonias a partir de tres experimentos independientes), confirmando así la participación de la familia de MMP metaloproteinasas . Por último, se analizó el potencial efecto de la CL-82198 y MMP-9 Inhibidor I, dos compuestos sintéticos que selectivamente objetivo MMP-13 y MMP-9, respectivamente [48, 49]. Además de CL-82198 en concentraciones que van desde 10 a 100 μ M no tenían claro actividad inhibitoria sobre TGF-β1 inducida tubulogenesis (Fig. 6E], mientras que la MMP-9 Inhibidor I suprimido esta respuesta biológica en un dependiente de la dosis de forma (Fig. 6F, G]. Estos resultados respaldan el papel de MMP-9 por TGF-β1 inducida por ramificación tubulogenesis.

Discusión

Para identificar la señales moleculares que orquestar tubulogenesis epiteliales, que tomó ventaja de un sistema in vitro en los que J3B1A células epiteliales mamarias crecido en geles de colágeno en medio químicamente definido forma esférica quistes. Además de acidificadas FCS a los definidos a medio inducido la formación de tubos ramificados. El uso de un inhibidor farmacológico de TGF-β receptor de señalización y anticuerpos neutralizantes a TGF-β1, se identificaron el componente activo en acidificadas FCS como TGF-β1. Es importante destacar que el efecto de acidificadas FCS se ha recapitulado exógenos de TGF-β1 en el intervalo de concentración de 20-100 pg / ml. Estos resultados demuestran que, en bajas concentraciones, TGF-β1 pueden activar una morfogénesis que culminó en la formación de tubos epiteliales.

TGF-β1 es una citoquina multifuncional que provoca diferentes ya veces opuestas respuestas celulares en el mismo tipo de células dependiendo de su concentración [50 - 54]. De acuerdo con esta noción, los efectos del TGF-β1 en nuestro sistema son claramente dependiente de la concentración. Así, en el rango de 20-100 pg / ml, TGF-β1 estimula la rápida extensión de tubos ramificados hueco de la pared de los quistes. En cambio, en concentraciones superiores a 200 pg / ml, TGF-β1 induce la formación de outgrowths celulares delgadas, similares a las descritas en las culturas de la vesícula biliar [55] y de la tiroides [56] las células epiteliales.

Los resultados presentados aquí se complementan los obtenidos previamente mediante TAC-2 células, una murino de células epiteliales mamarias línea [57]. En este último estudio, se informó de que bajas concentraciones de TGF-β1 promover la elongación y ramificación de los cordones epiteliales. Sin embargo, la ausencia de un lumen central dentro de TAC-2 cordones de células apoyó la interpretación que el TGF-β1 fue suficiente para mediar en sólo un subconjunto de morfogénesis hechos relacionados con la formación de conductos-como las estructuras [57]. El uso de J3B1A células epiteliales mamarias crecido en medio químicamente definido, ofrecemos ahora pruebas de que, a concentraciones de 20-100 pg / ml, TGF-β1 es capaz de inducir la formación de tubos huecos que imitan la organización de los conductos de la glándula mamaria.

Varios grupos han informado de que TGF-β1, a concentraciones relativamente altas, estimula un proceso de epitelio-mesenquimal transición (EMT) se caracteriza por la adquisición de huso-como la morfología celular, reorganización cortical de actina en fibras de estrés, downregulation y / o de relocalization junctional proteínas (por ejemplo, E-cadherina, β-catenina y ZO-1) y la ganancia de marcadores mesenquimales [33, 58, 59]. Esta conversión fenotípica ha sido descrita principalmente en NMuMG células epiteliales mamarias, pero es mucho menos pronunciada, o no ocurre en absoluto, en otras líneas celulares. Así, en MCF-10A células epiteliales mamarias, TGF-β1 insoluble disminuye la piscina de E-cadherina, sin inducir a la conversión a un fenotipo husillo [60]. Por otra parte, en una proyección de 18 establecido líneas de células epiteliales, sólo dos cepas se informó a someterse a EMT en respuesta a TGF-β1 [61]. De particular importancia para el presente estudio, se ha demostrado [20] que el TGF-β1 induce plena EMT en Ras-EpH4 transformado células, pero no en el medio silvestre EpH4 tipo de células (es decir, los padres línea celular a partir de la cual hemos aislado la J3B1A clon). En nuestros propios estudios, los efectos del TGF-β1 en J3B1A las células cultivadas en un substrato planar (por ejemplo, en los pozos convencionales o de plástico encima de un gel de colágeno) dependiente de la concentración. Tras la incubación con concentraciones relativamente altas (200 pg / ml a 1 ng / ml) de TGF β1 durante 3 días, las células J3B1A adquirido una forma irregular y se sometió a un grado moderado de dispersión. En contraste, durante el tratamiento con tubulogenic concentraciones (por ejemplo, 50 pg / ml) de TGF-β1, J3B1A células forman colonias multicelulares que fueron algo menos compacto que en el control de culturas, pero, no obstante, mantenerse cerca de células-células y los contactos típica morfología del epitelio (RM, datos no publicados). Del mismo modo, encontramos que 1 ng / ml TGF-β1 induce la expresión de marcadores mesenquimales (por ejemplo, la fibronectina y α-SM-actina) y disminuye ligeramente la expresión de marcadores epiteliales (por ejemplo, E-cadherina y apretado nudo de proteínas asociadas a ) En las células J3B1A. En contraste, 50 pg / ml TGF-β1 no han suscitado cambios ostensibles en los marcadores epiteliales examinados, mientras que la inducción de una upregulation marginal de α-SM-actina (FC, datos no publicados).

La concentración que dependen de los efectos de TGF-β se informa en este estudio pueden interpretarse como un reflejo clasificado cambios en la plasticidad del epitelio. Es bien sabido ahora que el fenotipo epitelial es muy dinámico y bien modulada por señales microambientales. Epitelial plasticidad abarca toda una gama de cambios, que van desde la plena EMT a alteraciones más sutiles que no están asociados con la conversión abierta mesenquimales [62, 63]. Así, durante los procesos biológicos que implican coordinar reposicionamiento de células, como la morfogénesis de ramificación [64, 65], las células epiteliales transitoriamente downregulate o relocalize adhesión, mientras que las proteínas restantes conectados por uniones intercelulares [11, 41, 66 - 68]. A la luz de estos conceptos, se propone que las bajas concentraciones de TGF-β induce un aumento moderado en la plasticidad del epitelio, lo que facilita la morfogénesis de células reordenamientos requeridos para tubulogenesis. En cambio, las mayores concentraciones de TGF-β provocaría alteraciones más pronunciadas del fenotipo epitelial, lo que resulta en alteraciones de la polaridad celular y parcial EMT. Esta hipótesis está apoyada por la conclusión de que, en nuestro sistema, bajas concentraciones de TGF-β1 promover el desarrollo de bien organizado de estructuras tubulares, mientras que concentraciones más elevadas causan la formación de lumen de la célula menos cables.

La formación y elongación de tubo-como las estructuras epiteliales en geles de colágeno implicar un proceso de crecimiento invasivo [6, 39], que depende de la actividad de MMPs, una familia de zinc-dependientes endopeptidases que desempeñan un papel clave en la degradación de ECM [ 42]. Como un primer paso para elucidar los mecanismos responsables de TGF-β1 inducida tubulogenesis, que evaluó el efecto de TGF-β1 en la producción de MMPs que participan en colágeno el volumen de negocios, incluida la MT1-MMP (MMP-14), la colagenasa-3 (MMP -13), 72 kDa gelatinasa (MMP-2) y 92 kDa gelatinasa (MMP-9) [42]. MMP-13 y MMP-14 se constitutivamente expresadas por las células J3B1A, pero obviamente no se modulada por TGF-β1. Curiosamente, sin embargo, de acuerdo con estudios anteriores en los queratinocitos [69], las células epiteliales de la córnea [70] y MCF-10 células epiteliales mamarias [71], TGF-β1 mejorado notablemente la expresión de 92 kDa gelatinasa (MMP-9) en la nivel de mRNA, proteína y actividad enzimática. Aunque gelatinases no están en condiciones de cleave intacta colágeno fibrilar, que, no obstante, juegan un papel importante en la degradación de colágeno que actúa secuencialmente después de la primera división de la triple hélice por cualquiera de MT1-MMP o intersticial collagenases [72]. En particular, MMP-9 está particularmente bien adaptado a efecto pericellular proteólisis debido a su capacidad de obligar a las moléculas de superficie celular [73, 74]. Para determinar si la actividad MMP es necesaria para la formación epiteliales del tubo, se utilizó el inhibidor sintético metalloproteinase el BB94 y fisiológicas TIMP inhibidor de MMP-2, y encontró que ambos derogar TGF-β1 inducida tubulogenesis. En particular, es relativamente selectivo inhibidor de MMP-9 (MMP-9 Inhibidor I) [49] significativamente atenuada TGF-β1 inducida por la formación de tubo, pero fue menos eficaz en este sentido que el inhibidor de amplio espectro BB94. Estos hallazgos sugieren que la MMP-9 participa en TGF-β1 inducida tubulogenesis en nuestro sistema, posiblemente actuando en concierto con otras MMPs, y fortalecer la idea de que la formación de tubos en geles de colágeno depende de la actividad de MMP [38 - 41]. Los mecanismos moleculares que subyacen MMP requisito de TGF-β1 inducida formación de tubos no se conocen. Un simple posibilidad es que la expresión de MMPs en la promoción de la punta del celular outgrowths crea una ruta en torno a la matriz, lo que facilita la elongación del tubo de dirección. Sin embargo, MMPs también podría participar en epiteliales tubulogenesis de mecanismos más complejos, por ejemplo, al exponer en sitios crípticos moléculas de colágeno, poniendo en libertad a proteolíticas fragmentos de proteínas de la matriz de células que estimulan la motilidad, o la transformación de la superficie celular de receptores de ECM [42]. En general, nuestro estudio da un importante apoyo a la idea [75 - 80] que el saldo de MMP / inhibidores de MMP tiene un papel clave en la morfogénesis de ramificación. Es probable, sin embargo, que este proceso de morfogénesis implica mecanismos adicionales, incluidos los depósitos de componentes de ECM endógeno y una alteración de la expresión de la integrina o no receptores de la integrina matriz. Más estudios serán necesarios para abordar estas cuestiones.

Una cuestión importante que plantea este estudio es si la actividad morfogenética de TGF-β1 observado en nuestro modelo in vitro es relevante para el proceso de ramificación tubulogenesis que ocurre in vivo. A primera vista, la conclusión de que TGF-β1 induce la formación de túbulos parece difícil de conciliar con las anteriores in vitro y los estudios in vivo, sugiriendo un papel regulador negativo de TGF-β s ramificación en la morfogénesis. Es de notar, sin embargo, que si bien la mayoría de evidencia experimental apunta a una actividad inhibidora de TGF-β s [81 - 86], los estudios en embriones de pulmón han demostrado que bajas concentraciones de TGF-β2 promover la morfogénesis de ramificación, mientras que concentraciones más altas se inhibitoria [87 ]. La idea de que la prevalencia de TGF-β s son negativos moduladores de la morfogénesis de ramificación se basa en tres grandes conjuntos de datos experimentales. En primer lugar, la entrega del TGF-β1 a ratón glándulas mamarias de liberación lenta mediante implantes de plástico se ha demostrado que inhiben la elongación del conducto [88]. Es posible, sin embargo, que relativamente altas concentraciones de TGF-β1 fueron liberados localmente por los implantes, lo que resulta en la represión del crecimiento epitelial. En un segundo enfoque experimental, además de exógeno TGF-β a la yema de pulmón órgano culturas se informó a inhibir la morfogénesis de ramificación [82, 85]. En esos estudios, sin embargo, las altas concentraciones (1-100 ng / ml) de TGF-β se utilizaron. En un tercer enfoque, la perturbación de TGF-β receptor de señalización in vitro [83] o in vivo [86] se asoció con un aumento de ramificación epiteliales, lo que implica un papel inhibitorio de TGF-β s ramificación en la morfogénesis. En esos parámetros experimentales, sin embargo, el TGF-β-dependiente de transducción de señales podría haber sido atenuado en lugar de totalmente derogada, con lo que desenmascarar una posible actividad morfogénica de bajo nivel de TGF-β señalización. Por lo tanto, mientras precaución debe ser ejercido en la extrapolación de información obtenida de nuestro sistema in vitro para todo el organismo, los resultados aquí presentados ponen de relieve la necesidad de re-evaluar el efecto in vivo del TGF-β en la morfogénesis de ramificación utilizando una gran variedad de citoquinas concentraciones.

Parénquima órganos contienen cantidades significativas latente de TGF-β almacenados en el ECM. Como consecuencia de ello, TGF-β biodisponibilidad es regulado principalmente por la conversión latente de TGF-β a su forma activa. Curiosamente, se ha demostrado que el TGF-β en la activación de la glándula mamaria está controlada por las hormonas ováricas [89]. Por lo tanto, es tentador especular que espacial y temporalmente limitado de activación de una pequeña fracción de la matriz determinada latente TGF-β contribuye a la morfogénesis de la glándula mamaria conductos.

En un intento por conciliar las dispares y aparentemente paradójico efectos de TGF-β1 en la literatura, proponemos que el TGF-β1 tiene múltiples, el contexto-y dependiente de la concentración a efectos glándula mamaria las células epiteliales. Las bajas concentraciones de las citocinas pueden aumentar la plasticidad del epitelio y promover la morfogénesis de células reordenamientos que culminará en la elaboración de conductos de ramificación. En concentraciones más altas, crecimiento de la actividad inhibidora de TGF-β1 es probable que anular su capacidad para aumentar la plasticidad del epitelio, por lo que se promulga la ley de formación de conductos. Por último, sostenido de alto nivel de expresión de TGF-β1 en la fijación de un epitelio alterado genéticamente podría llevar a EMT, fomentando así la progresión tumoral.

Conclusión

Aunque el papel exacto de TGF-β1 en la regulación de la morfogénesis de ramificación en vivo lo que queda por evaluarse, nuestro estudio demuestra claramente que las bajas concentraciones de TGF-β1 pueden modificar profundamente la organización espacial de las células epiteliales, lo que resulta en la formación de estructuras tubulares ramificadas . Debido a la rapidez y robustez de la morfogénesis respuesta inducida por TGF-β1, el sistema experimental que hemos desarrollado ofrece una oportunidad única para disecar los mecanismos moleculares y celulares responsables de tubulogenesis epiteliales. Este sistema también proporciona una conveniente bioensayo con los que identificar otras moléculas morphoregulatory.

Métodos
Reactivos

Humanos plaquetas TGF-β1, TGF-β2 y TGF-β3 se compraron de R & D Systems Ltd (Minneapolis, MN). Recombinante humano del factor de crecimiento epidérmico (EGF) fue de PeproTech (Londres, Reino Unido). SU + Premezcla fue de BD Bioscences (Bedford, MA). Todo-trans-ácido retinoico (RA) fue adquirido de Sigma Chemical Co (St. Louis, MO), disuelto en DMSO, almacenados a -20 ° C y protegidos de la exposición a la luz. SB-431542 se obtuvo de Tocris Cookson Ltd (Bristol, Reino Unido). SP600125 (inhibidor de JNK-II), UO126, y PD169316 fueron adquiridos, ya sea de Calbiochem-Merck (Darmstadt, Alemania) o bioquímicos Alexis (Carlsbad, CA). El sintético de amplio espectro BB94 inhibidor de MMP y los relacionados con el isómero inactivo BB1268 fueron amablemente proporcionados por el doctor P. Brown (British Biotech Pharmaceuticals Ltd, Oxford, Reino Unido). MMP-9 Inhibidor I (Cat. N º 44278), el selectivo MMP-13 inhibidor CL-82198 (Cat. N º 233105) recombinante y tejido inhibidor de metaloproteinasas-2 (TIMP-2, cat. N º PF021) fueron de Calbiochem-Merck. Pollo anticuerpos neutralizantes (IgY) para TGF-β1 (Cat. AB-101-NA), el control IgY de pollo que no reaccionen con TGF β1 (Cat. AB-101-C), de cabra y anticuerpos neutralizantes a TGF-β2 (Cat. AB-112-NA) fueron adquiridos de R & D Systems.

Células

J3B1A células [12], un derivado clonal de la EpH4 murino de células epiteliales mamarias línea [19 - 21], se cultivaron en Dulbecco modificada a medio Eagle (DMEM, Gibco Invitrogen Ltd, Berna, Suiza), complementado con un 10% de donantes de suero de ternera (DCS , Gibco) y 2 mM L-glutamina.

Los ensayos de ramificación tubulogenesis

J3B1A células fueron cosechadas con tripsina / EDTA confluente de las culturas, centrifugada, y lavarse en suero libre de DMEM/F12 medio (1:1). Las células fueron centrifugadas, una vez más, y resuspendido en un suero libre, medio químicamente definido que consta de DMEM/F12, SU + Premezcla (6,25 μ g / ml de insulina, 6,25 μ g / ml, transferrina, 6,25 ng / ml de ácido selenious, 1,25 mg / ml bovina albúmina y 5,35 μ g / ml de ácido linoleico), 2 ng / ml EGF y 5 nM todo-trans-ácido retinoico (este medio va a ser en lo sucesivo denominado "se define de mediano"). Las células se mezclan con un tipo I colágeno solución preparada como se describe [39] para obtener una concentración de 1 × 10 4 células / ml y 1 ml alícuotas de la suspensión celular fueron dispensadas en 22 mm de pozos de 12 y placas ( Falcón, Becton Dickinson and Co, Franklin Lakes, NJ). Después de 10 min de incubación a 37 ° C para permitir el colágeno gelación, 1 ml de medio definido se añadió por encima de los geles. Gel de colágeno culturas fueron incubadas en medio definido por 6 días para permitir la formación de estructuras quística [12]. Posteriormente, se define un nuevo medio se añadió con o sin los tratamientos indicados y los geles fueron suavemente aflojado de los pozos con la superación de una curva de punta espátula metálica alrededor de su circunferencia y se permitió que flotan en el medio [90]. Después de 48 horas, mediano y tratamientos fueron renovados y los cultivos fueron incubados por un período adicional de 48 horas.

Para su incorporación en geles de fibrina, las células fueron suspendidas en una solución polymerizing fibrinógeno, preparados básicamente como se describe [91]. En pocas palabras, fibrinógeno bovina (Cat. F-4753, Sigma) se disolvió a 37 ° C en calcio libre de DMEM para obtener una concentración final de proteínas de 2,5 mg / ml. J3B1A células fueron suspendidas en la solución de fibrinógeno en una concentración de 1 × 10 4 células / ml, y la coagulación se inició mediante la adición de 1 / 10 v / v de CaCl 2 (2 mg / ml) y 25 U / ml de trombina (Sigma , Cat. T4684). La mezcla fue trasladado de inmediato en 16 mm pozos (400 μ l) y que se les permita gel por lo menos 2 minutos a temperatura ambiente antes de ser superpuesta con medio definido. Aprotinina (Trasylol, Bayer Pharma, Zurich, Suiza) se añadió al medio a una concentración de 200 kallikrein inhibitoria unidades / ml para evitar la lisis de fibrina sustrato [91]. J3B1A células fueron cultivadas por 4-6 días para permitir la formación de pequeños quistes y posteriormente fueron incubados por un período adicional de 7 días de la presencia o ausencia de diferentes concentraciones de TGF-β1. Para su incorporación en laminina ricos en geles, J3B1A células fueron suspendidas en el factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Bioscences) o en una mezcla 1:1 de factor de crecimiento reducido Matrigel y colágeno de tipo I. 20 μ l gotas se colocaron en 16 mm de pozos y que se les permita solidificar durante 90 min a 37 ° C antes de ser superpuesta con 400 μ l definido a medio [92]. Después de un entrenamiento de 6 días de incubación para permitir la formación de quistes, los cultivos fueron tratados con TGF-β1.

La cuantificación de ramificación morfogénesis

En el tiempo indicado puntos, 10 colonias seleccionadas al azar por condición experimental en cada uno de al menos tres experimentos independientes (es decir, al menos 30 colonias por condición experimental) fueron fotografiados en virtud de la iluminación brillante sobre el terreno usando las 10 × objetivo de una Nikon Diaphot TMD invertido photomicroscope . La cuantificación de la morfogénesis de ramificación se llevó a cabo contando el número de outgrowths radial de más de 40 μ m por colonia. Los datos se expresaron como media de outgrowths por colonia ± sem, y la significación estadística se determinó a través de la unpaired Student's t-test.

El calor y el tratamiento de ácido FCS

Calefacción de FCS (Gibco Invitrogen Ltd) se realizó mediante la dilución de suero al 10% en DMEM/F12 y calefacción a 70 ° C durante 10 min. La acidificación se llevó a cabo mediante la FCS a pH 3,0 con 0,5 M de HCl. Después de 3 h de incubación a temperatura ambiente, el pH se ajustó a 7,4 mediante la adición de 0,1 M de hidróxido de sodio.

Integración de plástico y semi-sección delgada

Gel de colágeno culturas preparado como se ha descrito anteriormente y se incubaron durante 4 días en la presencia o ausencia de 50 pg / ml TGF-β1 se fijaron in situ la noche a la mañana con el 2,5% de glutaraldehído en 100 mM de sodio cacodylate buffer (pH 7.4). Después de un prolongado enjuague en el mismo buffer, los geles fueron suavemente eliminado de los pozos y cortado en 2 mm × 2 mm fragmentos. Estos fueron ampliamente enjuagarse en cacodylate buffer, después de la fijada en el 1% de tetróxido de osmio en Veronal tampón de acetato de 45 minutos, teñidas en bloque con el 2,5% de acetato de uranilo en el 50% de etanol, deshidratados en ethanols clasificado y embebidos en Epon 812, tal como se describe [4 ]. Semi-fino (1 μ m de espesor) se cortaron secciones con un LKB Ultramicrotome (LKB Instruments, Gaithersburg, MD), teñidas con el 1% de azul de metileno y fotografiados bajo luz transmitida mediante un Axiophot photomicroscope (Carl Zeiss, Oberkaden, Alemania).

Blot hibridación del Norte

Confluentes J3B1A monocapas de células en determinadas medianas fueron incubadas con o sin diferentes concentraciones de TGF-β1. Después de 24 o 48 horas, los platos se lavan con helado de PBS y ARN celular total fue extraído con el reactivo Trizol (Life Technologies, Paisley, Escocia), con arreglo a las instrucciones del fabricante. ARN fue desnaturalizado con glyoxal, electrophoresed en un 1% en gel de agarosa (15 μ g de ARN por carril), y trasladado la noche a la mañana en las membranas de nylon (Hybond-N, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). RNAs se crosslinked de bicarbonato de los filtros a 80 ° C durante 2 h y teñidas con azul de metileno para evaluar 18S y 28S del RNA ribosomal integridad. Los filtros se hibridó durante 16 horas a 65 ° C con 1,5 × 10 6 cpm / ml de 32 P-etiquetados cRNA sondas generados a partir de ratón MMP-9, ratón MMP-2, o humanos MT1-MMP cDNAs (amablemente proporcionados por el doctor M . Pepper, Ginebra, Suiza). Como control interno para determinar la cantidad de ARN cargado, los filtros simultáneamente se hibridó con un 32 P-P0 etiquetados ribosomal phosphoprotein cRNA sonda. Post-hibridación lavados se realizaron tal como está descrita anteriormente [93]. Los filtros están expuestos a Kodak XAR-5 películas a -70 ° C entre la intensificación de las pantallas.

Western blot

J3B1A células fueron chapados a 100 mm en los platos se define medio en el 2 × 10 6 células / plato y crecido hasta su confluencia. Se les deja sin tratamiento o tratadas con 50 pg / ml, 200 pg / ml o 1 ng / ml TGF-β1. Después de 3 días, los medios de comunicación acondicionado (para MMP-9 y MMP-13 análisis) o extractos de proteínas totales (por MT1-MMP análisis) han sido recogidos. Los medios de comunicación acondicionado fueron complementados con 0,5 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) y 15 mM HEPES, y se centrifuga a 340 g durante 5 minutos. Los sobrenadantes resultantes se concentran 3 veces por filtración centrífuga utilizando un Centricon YM-10 cartucho (Amicon-Millipore, Volketsvil, Suiza). Para los extractos de proteínas, las células fueron lavadas en PBS e incubadas en buffer de lisis (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, 1% Tritón X-100 y el 1% NP-40) que contenía 1 mM PMSF, 200 KUI Trasylol, 2 μ g / ml leupeptina y 1 μ g / ml pepstatin A durante 1 h en hielo. El lisado se centrifugó a 12'000 g durante 15 minutos a 4 ° C, y el sobrenadante se recogió. Igual cantidad de concentración de los medios de comunicación acondicionado (15 μ l) o extractos de proteínas (10 μ g) fueron separados en un 10% SDS-PAGE antes de ser trasladados en las membranas difluoride polivinilideno (PVDF, Bio-Rad, Reinach, Suiza). Uniforme de carga de carriles se verificó la tinción de plata de las proteínas. Sitios de unión inespecíficos fueron bloqueados por las membranas incubando 90 min a temperatura ambiente en PBS que contenía 0,4% (vol / vol) de Tween 20 (PBS-Tween) y el 5% (peso / vol) sin grasa leche en polvo. Las membranas fueron incubadas durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo policlonal de conejo para MMP-9 (ab38898, Inc Abcam, Cambridge, MA; dilución 1:5000), anticuerpo monoclonal de ratón para MMP-13 (Clon LIPCO IID1, Lab Vision Corporation , Fremont, CA; dilución 1:200), o anticuerpo monoclonal de ratón a MT1-MMP (Ab-4, Oncogene, San Diego, CA; dilución 1:2000). Después de un prolongado lavado en PBS-Tween, las membranas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con rábano picante-peroxydase secundario conjugado con anticuerpos (Amersham Biosciences, Otelfingen, Suiza), diluido 1:3000. Membranas fueron lavadas ampliamente en el amortiguador de bloqueo y los complejos antígeno-anticuerpo detectado por un aumento de quimioluminiscencia, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Amersham). Acondicionado medios de comunicación de la PMA-U937 tratadas las células que producen MMP-9 [94], y de SVEC4-10 células, que expresan MMP-13 y MMP-14 [95], se utilizaron como controles positivos.

Gelatina zymography

J3B1A células fueron chapados en 60 mm platos en medio definido a 2 × 10 6 células / plato y crecido durante 24 horas. Se les deja sin tratamiento o tratadas con 50 pg / ml, 200 pg / ml o 1 ng / ml TGF-β1. Después de 3 días, los medios de comunicación acondicionado han sido recogidos, complementado con 0,5 mM PMSF y 15 mM HEPES, y se centrifuga a 340 g durante 5 minutos. Los sobrenadantes resultantes se almacenaron a -20 ° C hasta su uso, mezclado con un volumen igual de 2 × Novex SDS muestra buffer (Invitrogen, Berna, Suiza) sin agentes reductores y la mezcla se cargó (10 μ l por carril) en un prefabricado 0,1% de gelatina-10% de acrilamida zymography gel (Invitrogen). Después de la electroforesis a 4 ° C, los geles se sumergen en un 2,5% Tritón X-100 durante 20 minutos para eliminar las existencias, se incubaron durante la noche a 37 ° C en buffer de reacción (50 mM Tris-HCl pH 7,4, con 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2), y luego teñidas con metanol: ácido acético: agua (30:10:60) que contenga 0,25% Coomassie Blue R250 durante 4 horas. Gelatinolytic actividad se detectó como una banda clara sobre un fondo uniforme azul de la tinción. Masas moleculares de gelatinolytic bandas se estimaron con pre-teñidos marcadores de masa molecular (Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Suiza). Medio condicionado de la PMA-U937 tratadas las células humanas, lo que se sabe que producen MMP-2 y MMP-9 [94], se utilizó como control positivo.

Autores de las contribuciones

RM fue responsable de la concepción y el diseño del estudio, para la supervisión de los experimentos realizados por un técnico, para el análisis, cuantificación e interpretación de datos, preparación de la figura, y para la redacción de manuscrito. FC contribuido a la adquisición de datos (análisis de inmunofluorescencia epiteliales y mesenquimales marcadores) y su interpretación. PS contribuido a la adquisición de datos (Northern blot, Western blot y análisis de zymographic MMPs) y de su interpretación. FC y PS leer críticamente el manuscrito y todos los autores aprobó la versión final.

Agradecimientos

Damos las gracias a J. Robert-Rial, M. Eissler, y P. Couleru hábil para la asistencia técnica. También damos las gracias al Dr P. Brown para proporcionar BB94. Esta labor fue apoyada por las subvenciones no. 3100A0-101734 / 1 y 3100A0-113832 / 1 de la Swiss National Science Foundation para RM.