Journal of Inflammation (London, England), 2007; 4: 4-4 (más artículos en esta revista)

Un modelo dinámico de la expresión génica en monocitos revela diferencias de inmediato y pronta respuesta genes entre adultos y neonatal células

BioMed Central
Shelley Lawrence (lawrence@pediatrix.com) [1], Yuhong Tang (yuhong-tang@omrf.ouhsc.edu) [2], M Frank Barton (Bart-Frank@omrf.ouhsc.edu) [2], Igor Dozmorov (igor-dozmorov@omrf.ouhsc.edu) [2], Kaiyu Jiang (kaiyu-jiang@ouhsc.edu) [1], Yanmin Chen (yanmin-Chen@ouhsc.edu) [1], Craig Cadwell (craig - cadwell@omrf.ouhsc.edu) [2], Sean Turner (sean-turner@omrf.ouhsc.edu) [2], Michael Centola (michael-centola@omrf.ouhsc.edu) [2], James N Jarvis ( james-jarvis@ouhsc.edu) [1]
[1] Departamento de Pediatría, Sección de Neonatología, Universidad de Oklahoma College of Medicine, Oklahoma City, OK, EE.UU.
[2] Arthritis & Immunology Programa de Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, 73104, EE.UU.

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Resumen

Neonatal monocitos mostrar inmadurez de numerosas funciones en comparación con células adultas. Arrays de expresión génica proporcionar una herramienta promisoria para elucidar los mecanismos subyacentes neonatal la función inmunológica. Se utilizó un bien establecido microarray para analizar las diferencias entre LPS-estimulado la sangre del cordón umbilical humano adulto y monocitos para crear modelos dinámicos de interacción para aclarar las deficiencias observadas en la respuesta inmune neonatal.

Se identificaron 168 genes que son expresados diferencialmente entre los adultos y del cordón monocitos después de 45 min de incubación con LPS. De estos genes, 95% (159 de 167) fueron más-expresó en adultos en relación con cable de monocitos. Genes expresados diferencialmente podría ser objeto de una selección en nueve grupos de acuerdo a su cinética de activación. Funcional de modelos sugiere diferencias entre los adultos y la sangre del cordón umbilical en la regulación de la apoptosis, un hallazgo confirmado mediante pruebas annexin vinculante. Llegamos a la conclusión de que estudios cinéticos de la expresión de genes potencialmente ponen de manifiesto diferencias importantes en la dinámica de la expresión génica que pueden dar una idea neonatal en la inmunidad innata.

Fondo

Los defectos en la inmunidad de adaptación neonatal son relativamente fáciles de entender a priori. A pesar de que hay complejidades para ser considerado [1, 2], evidencia experimental demuestra que los recién nacidos, que carecen de antígeno antes de la exposición, debe desarrollar la memoria inmunológica postnatal, sobre la base de la experiencia con phogens inmunógenos y el medio ambiente [3 - 5].

Es menos claro por qué debe haber defectos en los recién nacidos "inmunidad innata, a pesar de estos defectos están bien documentadas. Por ejemplo, los recién nacidos desde hace tiempo se sabe que presentan defectos en la fagocitosis [6], quimiotaxis [7, 8], y la adhesión [9], esta última posiblemente debido a la regulación aberrante de células de crítica-proteínas de superficie de leucocitos que median las interacciones del endotelio [ 10]. Los recién monocitos también muestran disminución de la secreción de citocinas numerosas en ambos estimulados y condiciones basales [11 - 13].

Esclarecer las causas de estos defectos es una cuestión crucial en la medicina neonatal, ya que la infección sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el período de recién nacido. Sin embargo, desentrañar los complejos acontecimientos en los monocitos y / o la activación de neutrófilos, ligando de unión a la activación del efector respuestas, es claramente un reto enorme. Cualquiera de las numerosas vías a partir de la primera célula de eventos de señalización para la síntesis de proteínas o la secreción puede ser relevante, y se centra en cualquier persona puede pasar por alto los aspectos críticos de regulación celular. En este contexto, genómica y proteómica o enfoques pueden ofrecer algunas ventajas importantes, al menos en las fases iniciales de investigación, permitiendo a los investigadores a estudiar el abanico de procesos biológicos que puedan ser pertinentes para la identificación de las distinciones biológicas críticas.

Recientemente ha publicado el trabajo documentado diferencias en la expresión génica entre los adultos y la sangre del cordón umbilical monocitos [14], aunque estos estudios no dilucidar la fundamental, las diferencias funcionales entre la sangre del cordón umbilical y células adultas. El informe que los estudios demuestran cómo aquí computacionales de análisis, aplicado a los datos de microarrays, puede dilucidar crítica funciones biológicas cuando el análisis se extiende más allá de la identificación diferencial de los genes-expresó.

Métodos
Las células y estimulación celular

Monocitos fueron purificados a partir de la sangre del cordón umbilical de salud, los recién nacidos a término y de la sangre periférica de adultos sanos de selección positiva utilizando anti-CD-14-MAB recubierto bolas magneticas (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. El consentimiento informado se obtuvo de adultos voluntarios, recogida de sangre del cordón estaba exento de consentimiento después de la revisión de Oklahoma Centro de Ciencias de la Salud IRB. En resumen, la sangre se recogió en tubos estériles que contengan citrato de sodio como anticoagulante (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). De sangre periférica de células mononucleares (PBMC) fueron elaborados a partir de la lucha contra la sangre coagulada utilizando gradiente de separación en Histopaque-1077 efectuada directamente en los tubos de extracción de sangre. Las células fueron lavadas tres veces en Ca 2 + y Mg 2 + sin Hanks equilibrado de solución de sal. PBMC se incubaron durante 20 min a 4 ° C con CD14 microbolas a 20 μ l / 1 × 10 7 células. Las células fueron lavadas una sola vez, re-suspendido a 500 μ l de Ca 2 + y Mg 2 + libre de PBS que contenga un 5% de SFB / 1 × 10 8 células. La suspensión se aplica a un MAC columna. Después de etiquetar las células pasado a través de la columna se lava con 3 × 500 μ l de Ca 2 + y Mg 2 + libre de PBS. La columna fue retirado de la separador y fue puesto en un nuevo tubo de recogida. Un ml de Ca 2 + y Mg 2 + libre de PBS se añade a la columna, que fue inmediatamente vaciado de aplicar con firmeza el émbolo se suministra con la columna.

Purificada monocitos fueron incubadas con LPS de Escherichia coli 0111:4 B (Sigma, St Louis, MO) a 10 ng / ml durante 45 minutos y 2 horas en RPMI 1640 con 10% suero bovino fetal o estudiado en la falta de estimulación ( "tiempo cero"). Cabe señalar que este producto no es "puro", y estimula tanto TLR-4 y TRL-2 vías de señalización [15]. Un menor número de repeticiones (n = 5), se analizó después de 24 horas de incubación. Después de los pertinentes puntos de tiempo, los monocitos se zadas con TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y el RNA fue aislado a lo recomendado por el fabricante. Las células de plazo ocho recién nacidos y ocho adultos sanos se utilizaron para estos estudios.

Microarrays de genes

Los microarrays se utilizan en estos experimentos fueron desarrollados en la Oklahoma Medical Research Foundation Microarray centro de investigación y contiene sondas de 21329 genes humanos. Láminas fueron producidas comercialmente disponible usando las bibliotecas de 70 nucleótidos de largo moléculas de ADN, cuya longitud y secuencia de la especificidad fueron optimizados para reducir la cruz-la hibridación ha tropezado con problemas a base de cDNA microarrays (Qiagen-OPERON). Los oligonucleótidos fueron derivados de la UniGene y RefSeq bases de datos. El RefSeq base de datos es un esfuerzo por el NCBI para crear una verdadera base de datos de referencia de la información genómica para todos los genes de función conocida. Todos los 11000 genes humanos de los que se sabe o se sospecha la función estuvieron representados en estas matrices. Además, la mayoría indefinido marcos de lectura abierta Estuvieron representados (aproximadamente 10000 genes adicionales).

Los oligonucleótidos fueron avistados en Corning ® ™ UltraGAPS amino-silano recubierto diapositivas, rehidratada con el vapor de agua, broche de secado a 90 ° C, y luego fijo covalentemente a la superficie del cristal con 300 mJ, 254 nm de longitud de onda de la radiación ultravioleta. Sin aminas libres en la superficie de cristal fueron bloqueados durante 15 minutos con agitación moderada en una solución 143 mM de anhídrido succinic disuelta en 1-metil-2-pyrolidinone, 20 mM borato sódico, pH 8,0. Diapositivas fueron para enjuagarse 2 min en agua destilada, inmerso durante 1 minuto en etanol al 95%, y se seca con una corriente de gas nitrógeno.

Etiquetado, la hibridación y la digitalización

Fluorescente marcada cDNA fue sintetizado por separado de 2,0 μ g de RNA total utilizando un oligo dT primer 12-18, PowerScript la transcriptasa inversa (Clontech, Palo Alto, CA), y Cy3-dUTP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) durante 1 hora a 42 ° C en un volumen de 40 μ l. Las reacciones fueron quenched con 0,5 M EDTA y el ARN se hidrolizada por la adición de NaOH 1 M de 1 hora a 65 ° C. La reacción fue neutralizada con 1 M Tris, pH 8,0, y cDNA fue purificado con la PCR Montage 96 Kit de Limpieza (Millipore, Billerica, MA). cDNA fue agregado a ChipHybe ™ hibridación de amortiguación (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) que contiene Cot-1 DNA (0,5 mg / ml concentración final), tRNA de levadura (0,2 mg / ml) y poli (dA) 40-60 (0,4 mg / ml). Hibridación se realizó en un sistema de Ventana Discovery durante 6 horas a 42 ° C. Microarrays se lavaron a un final rigor de 0,1 × cooperación Sur-Sur, y luego escaneados utilizando un doble láser color (Agilent biotecnologías, Palo Alto, CA). La intensidad de fluorescencia se mide por Imagene ™ software (biológico, El Segundo, CA).

PCR validación de datos array
PCR cuantitativa

Gene-primers específicos para 10 genes (Erbb3, Tmod, Dscr1l1, SP1, Scya4, Gro2, Cri1, Scya3, Scya3l1, y Il-1a) fueron diseñadas con un 60 ° C, temperatura de fusión y una longitud de 19-25 pb por PCR productos con una longitud de 90-140 pb, con Applied Biosystems Inc (ABI, Foster City, CA) Primer Express 1,5 software. PCR fue ejecutada con 2 μ l cDNA plantilla a 15 μ l reacciones por triplicado en un ABI SDS 7700 utilizando la ABI SYBR Green I Master Mix y primers específicos de genes en una concentración de 1 μ M cada una. La temperatura perfil consistía en un inicial 95 ° C paso durante 10 minutos (para la activación Taq), seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 1 minuto y, a continuación, un último análisis de la curva de fusión con una rampa de 60 ° C a 95 º C durante 20 min. Genes específicos de amplificación fue confirmada por un único pico en la curva de disociación ABI software. No plantilla controles estaban a cargo de cada par de primers. Desde cantidades iguales de RNA total se utilizaron para la síntesis de ADNc, Ct valores debe reflejar la abundancia relativa [16]. Estos valores se utilizaron para calcular la media del grupo Ct (cable vs adultos) y la relativa Δ Ct se utilizó para calcular el cambio veces entre los dos grupos [17].

Apoptosis ensayos

Expuesto fosfolípidos de membrana (un marcador temprano de la apoptosis) se detectaron en adultos y neonatal monocitos después de LPS estimulación mediante un comercialmente disponibles annexin V vinculante ensayo. Monocitos de la sangre del cordón umbilical y sangre periférica de adultos se obtuvieron a lo expuesto anteriormente. Monocitos aislados o bien fueron etiquetados inmediatamente con annexin V-FITC o fueron estimulados durante 14 horas con LPS 10 ng / ml antes de etiquetado (esta vez el punto se deriva empíricamente para maximizar la apoptosis). Annexin V-FITC tinción se completó a través de la Annexin V-FITC Kit de detección de apoptosis I (BD Biosciences, San Jose, CA) a través de 5 μ l de yodo propidio y 5 μ l annexin V-FITC según lo recomendado por el fabricante. El análisis de citometría de flujo se llevó a cabo en un FACS Calibur automatizado benchtop citómetro de flujo. Los datos obtenidos por citometría de flujo se analizó por no paramétrica t-test (Mann-Whitney test). Un nivel alfa de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

El análisis estadístico

Microarrays se normalizaron y la prueba de expresión diferencial mediante los métodos descritos anteriormente [18]. Expresión diferencial se llegó a la conclusión de si los genes que cumplían los siguientes criterios: un mínimo nivel de expresión al menos 10 veces superiores al fondo a uno o más puntos de tiempo, un mínimo de 1,5 veces el promedio de valores de expresión entre los grupos en uno o más puntos temporales, y un mínimo del 80% de reproducibilidad usando el cuchillo-jack método. Un jack de cuchillo es el tipo más común de la licencia-un-out-validación cruzada (LOOCV); se utiliza aquí para validar transversal genes seleccionados por análisis diferencial [19]. Análisis de series temporales se realizó a través de hipervariables (HV) de genes método descrito previamente por nuestro grupo [20].

Después de la selección, HV genes se agrupan e interrogado durante gen-gen interacciones. K-means clustering, sin supervisión técnica, se realizó en el HV genes para crear agrupaciones imparcial. Discriminar análisis de función (DFA), una técnica de supervisión, se utilizó para determinar el espacio y el mapa de genes-genes interacciones [21].

Todos los análisis estadístico se realizó en Matlab R14 (Natick, MA) y Statistica v7 (Tulsa, OK, EE.UU.). Un nivel alfa de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo para todos los análisis.

Análisis de la apoptosis ensayos se llevó a cabo utilizando tanto paramétricos y no paramétricos métodos de análisis. Parametric análisis se llevó a cabo utilizando el estudiante prueba de la t de; no parametic utilizado el análisis de Mann-Whitney U-test. Un valor de p> 0,05 fue el umbral para rechazar la hipótesis nula.

Resultados
La expresión génica diferencial análisis

El cuadro 1 se enumeran los genes determina que expresó diferencialmente entre el cordón y adultos monocitos de sangre periférica, como se ha descrito anteriormente. No se han encontrado genes para ser estadísticamente significativa entre expresadas diferencialmente adultos y del cordón monocitos en la ausencia de LPS exposición. 168 genes fueron expresados diferencialmente entre los adultos y del cordón monocitos después de 45 min de incubación con LPS. El 95% de estos genes (159 de 168) eran demasiado expresada en adultos en relación con cordón monocitos. Después de 120 minutos de exposición LPS, 24 genes son expresados diferencialmente entre los adultos y del cordón monocitos. De estos últimos genes, 23 eran más altamente expresado en el cordón que los adultos monocitos. Este patrón de genes expresados diferencialmente sugiere una primera respuesta tardía a LPS seguida de un aumento de la transcripción de los genes en relación con el cordón de adultos monocitos. Para probar esta hipótesis, k-means clustering se utilizó para clasificar los genes expresados diferencialmente sobre la base de su perfil temporal. Relativa disminuye en la transcripción de genes por cable de monocitos en 45 min se observaron en 6 de los 9 grupos (Figura 1]. Cada uno de estos grupos figuran entre los 15 y los 46 genes. El examen de los grupos mostró que las diferencias entre los grupos después de 45 minutos de exposición LPS se debieron a una) en ciertos genes que son grupos de hasta reguladas en adultos sólo monocitos, b) los genes en otras agrupaciones que se establecen reguladas en el cordón sólo monocitos, o c) los genes en otras agrupaciones hasta que fueron reguladas en los adultos y hacia abajo-regulada en el cordón monocitos. Estos resultados, resumidos en un mapa de calor en la Figura 2, se indica una alta complejidad de la expresión génica diferencias entre adultos y monocitos de sangre de cordón monocitos en respuesta a LPS.

Además de lo anterior genes que difieren en la expresión entre los grupos después de la exposición LPS, 516 genes también se identificó que fueron expresadas diferencialmente en el tiempo dentro de un grupo. Un cuadro con estos datos está disponible previa solicitud. Para estos genes, un patrón similar de expresión dinámica fue visto como se observó en el otro grupo. Por lo tanto, estos genes reflejan respuestas comunes a LPS en monocitos de ambas fuentes.

Un subconjunto de los genes que son expresados diferencialmente entre adultos y monocitos de sangre de cordón fueron seleccionadas para su validación, mediante el cuantitativo en tiempo real de reacción de polimerasa en cadena método (QRT-PCR). Estos incluyeron cuatro genes que difieren entre los grupos después de 45 minutos de exposición LPS (Erbb3, Tmod, Dscr1l1, y SP1), y seis genes que difieren en la expresión, después de 2 horas de exposición LPS (Scya4, Gro2, Cri1, Scya3, Scya3l1, y Il-1a). Nueve de los diez genes probados para QRT-PCR validación demostrado niveles similares de expresión relativa a QRT-PCR, como los experimentos en los microarrays. CRI1 no sólo para corroborar los datos de microarrays.

Hipervariables análisis de genes

Ciento ochenta y ocho hipervariables (HV) se seleccionaron los genes de los genes expresados en los adultos y los monocitos de sangre de cordón sobre la base de sus cambios a través de tres puntos temporales. Estos genes expuestos significativamente más alta expresión variación en el tiempo que la mayoría de los genes. Las diferencias en las variaciones entre dos conjuntos de la muestra experimental, en este caso de adultos y neonatal muestras, puede representar diferencias en los mecanismos de control homeostático entre estos dos grupos [20]. Los genes seleccionados se hipervariables en ambos grupos de muestra. HV genes altamente correlacionados con los niveles de expresión en una población dada es probable que comparten la función [20]. Una correlación basada en la agrupación procedimiento se llevó a cabo para estos genes HV, tal como se describe en la sección de métodos. Los genes pertenecientes a las 5 mayores grupos fueron utilizados para la creación de una salida gráfica, denota una correlación mosaico. Un mosaico de correspondencias que permite la identificación de los genes dentro de los grupos de inspección visual y la posterior análisis funcional de los genes dentro de los grupos (Figuras 3A y 3B]. Figura 3A representa 110 genes de la misma distribución entre el grupo de adultos y la sangre del cordón umbilical muestras de los monocitos, lo que demuestra una gran similitud entre las células de estos dos grupos, según lo medido por los coeficientes de correlación entre los genes de los adultos y del cordón monocitos con valor> 0,90 (cifra 3A, en blanco y negro gráfica a la derecha). Tres genes en esta lista (# 101-103) fueron la excepción: regulador transcripcional que interactúan con el PHS-bromodomain 2 (Trip-Br2), interleucina 1 beta (Il1b), y la GRO2 oncogén (Gro2). Estos genes pueden jugar un papel fundamental en la diferenciación entre adultos y del cordón monocitos comportamiento [22, 23]. La gran similitud de estos mosaicos se presentan pruebas para detectar la presencia de procesos fundamentales en el desarrollo monocitos que parecen ser muy similares en ambos grupos de muestras. Los detalles de los genes utilizados en la Figura 3A se presentan en la Tabla 2. Otro grupo de 78 genes se han encontrado que tienen diferentes denominaciones entre el grupo de adultos y monocitos de sangre de cordón (Figura 3B]. Los detalles de estos genes se enumeran en el cuadro 3.

Se analizaron estos genes utilizando DFA, a fin de encontrar los genes más probable para poner de relieve las diferencias entre los adultos y del cordón monocitos. DFA identificado los genes que tengan alta capacidad discriminatoria. La DFA software seleccionado los genes de la Tabla 3, con mayor capacidad discriminatoria para este caso. Un total de 12 genes (marcados con asterisco en el cuadro 3] fueron utilizados por la DFA programa para diferenciar los cambios dinámicos en los dos adultos y del cordón monocitos después de la estimulación LPS. Los valores de las raíces obtenidas por DFA análisis se utilizaron para representar gráficamente las diferencias de la expresión génica valores obtenidos en los adultos y del cordón muestras en diferentes etapas tras la estimulación (Fig. 4]. La organización espacial de los elementos de esta representación ofrece una medida de la similitud general de la dinámica de comportamiento de estas muestras. Los mayores cambios temporales en la expresión génica para adultos y del cordón monocitos se ha señalado anteriormente después de 45 minutos de exposición LPS también se observó en el análisis utilizando estos 12 genes. Sin embargo, casi no se produjeron diferencias en el tiempo de 2 horas entre el cordón y células adultas lo que sugiere que el comportamiento global de las células es similar, pero la cinética de cambio difieren es decir, muchos de los cambios son los mismos en ambos grupos, pero que se produzcan en diferentes tipos.

Apoptosis ensayos

Los productos de un subconjunto de los genes que son expresados diferencialmente entre los grupos después de 45 minutos de exposición a LPS están implicados en la apoptosis. Por lo tanto, realiza una serie de experimentos funcionales comparar la apoptosis en adultos (n = 10) y neonatal (n = 10) sangres de cordón. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 4. Annexin ensayos demostraron que los adultos monocitos mostrar diferentes cinética de ambos apoptosis y necrosis en comparación con los monocitos neonatal. Citometría de flujo reveló que el 43 ± 5% (media + SD) de los adultos y 53 + 8% de monocitos neonatal están en la apoptosis tras la estimulación con LPS durante 14 horas (p <0,002), mientras que 38 + 8% de los adultos y 25 + El 9% de los monocitos son neonatal necrótico después de 14 horas de LPS estimulación (p <0,003). El número de monocitos en vivo después de 14 horas de LPS estimulación no fue estadísticamente diferente entre los dos grupos. Tampoco hubo diferencias estadísticamente significativas en el número de vivir, apoptosis, o necrótico monocitos entre adultos y neonatal muestras antes de la estimulación LPS (datos no presentados).

Discusión

A raíz de un determinado estímulo fisiológico, señalización cinasa activación, factor de transcripción translocación, y la transcripción de genes se producen en todos rápido fin. Sin embargo, al igual que todos los procesos biológicos, la acumulación de ARNm (o disminución) no se produce de manera uniforme, y estamos estudiando la hipótesis de que la cinética de acumulación de mRNA o desaparición podría aportar pistas en los celulares dinámica. Se utilizó un bien desarrollado y validado la expresión de genes de microarrays para estudiar la dinámica de acumulación de mRNA y las diferencias entre adultos y neonatal monocitos en ese proceso.

Los genes se comprobó que estaban expresados diferencialmente entre los adultos y del cordón monocitos después de uno 45 o 120 minutos de exposición LPS, con poca diferencia a las 24 hr (ver Figura 4]. Curiosamente, ninguna diferencia estadísticamente significativa en la expresión génica se observaron entre estos grupos en las células no tratadas. Informes anteriores de otros indicaron alterado las funciones de monocitos de sangre de cordón en la secreción de citoquinas y la adhesión celular. Los resultados de este estudio emitidos nueva luz sobre estas conclusiones y añadir complejidad a la comprensión de estas diferencias. En algunos casos, nuestros datos apoyan anterior neonatal especulaciones sobre la función inmunológica. Por ejemplo, el incremento en la expresión de IL-17B en monocitos neonatal es coherente con las observaciones de Vanden Eijnden y colegas que los recién nacidos para compensar su relativa deficiencia inmune por un exceso de expresión de los IL23-IL-17 en vía de señalización de las células dendríticas [24] . Del mismo modo, encontramos las elevaciones significativas en el cordón monocitos transcripciones de las quimiocinas MIP1B y MIP1A después de 2 horas de exposición LPS, de conformidad con Sullivan y sus colegas el informe de cantidades superiores de MIP α en muestras de sangre de cordón en comparación con los adultos [25]. Por otro lado, transcripciones de cadherina 9, Rock1, periostin, sulfato de heparina 6-O-sulfotransferasa 3, y C20orf42, cuyos productos participan en diversos mecanismos que están asociados con la adherencia [26 - 28] fueron estadísticamente significativamente mayor en los adultos después de monocitos 45 minutos de exposición LPS, aunque no las diferencias en la expresión de estos genes entre los grupos fueron detectados en el punto más adelante. Estos datos sugieren complejos, dinámicos para las relaciones genes cuyos productos están relacionados con la adhesión celular, colectivamente y poner de relieve la importancia de examinar los perfiles de expresión génica (o relacionados con los niveles de expresión de proteínas) en el tiempo.

Los límites de perfiles de expresión génica como una técnica, aunque una técnica muy útil, hay que reconocer. La técnica se examinan sólo transcripciones de ARN, no la síntesis de proteínas. Por lo tanto, alteraciones en otros críticos mediadores de la inflamación, tales como eicosanoids, siguen siendo incumplido con este método. Por otra parte, es bien sabido que hay muchas proteínas, incluida la crítica mediadores inflamatorios, cuya síntesis y secreción no está directamente relacionada a la acumulación de ARNm [29]. Por lo tanto, de perfiles de expresión génica debe complementarse con otros métodos con el fin de maximizar el potencial existe.

En última instancia, la utilidad de los perfiles de expresión génica se ha demostrado sólo en caso de que proporciona una visión de los fisiológicos o fisiopatológicos función. Por esa razón, hemos elegido para poner a prueba la validez de la matriz de datos mediante el examen de un mecanismo fisiológico implicado por ordenador de modelos de la gama de datos. Como se observa en el Cuadro 1, los adultos-más de monocitos expresó un pequeño número de genes asociados con la regulación de la apoptosis. Dado que los monocitos de activación es un "acto de equilibrio" entre las señales que induce la apoptosis y la inducción de los activación y diferenciación [30, 31], las diferencias en la cinética de expresión o activación de enzimas o factores de transcripción que regulan la apoptosis podría tener un resultado crucial de si los monocitos las respuestas son pro-o anti-inflamatorios. Annexin ensayos confirmó que hay diferencias significativas en la aparición de células apoptóticas entre los adultos y los recién nacidos monocitos (Cuadro 4]. Dado que las células apoptóticas amortiguar la respuesta inflamatoria, es interesante especular que los mitigado neonatal respuesta a estímulos inflamatorios (incluida la infección) puede resultar, al menos en parte, a partir de la producción excesiva de células apoptóticas en los monocitos de activación.

No ha habido, a nuestro conocimiento, un artículo publicado anteriormente la expresión génica mediante arrays para estudiar neonatal función de los monocitos [14]. Nuestros resultados difieren un tanto de los descritos por estos autores. La novedad más evidente fue nuestro de no encontrar diferencias estadísticamente significativas entre adultos y muestras de sangre de cordón en el estado de reposo. Debemos tener en cuenta, sin embargo, que es otra cosa difícil de comparar los dos estudios. Jiang y sus colegas utilizaron una 1.000 veces mayor dosis de LPS para estimular los monocitos, RNA y se preparó después de 18 h de estimulación. Por lo tanto, es difícil determinar cuáles son los efectos observados por estos autores fueron el resultado directo de la activación o LPS se autocrina mediada por la activación de las proteínas secretadas en respuesta a LPS. Además, la falta de dosis fisiológicas de LPS utilizados por los autores hace que el biológicos / patológica importancia de ese estudio difícil de interpretar. Por último, cabe señalar que el estudio de Jiang y sus colegas utilizaron diferentes metodologías para la depuración de monocitos. Si bien nuestro método, de selección positiva utilizando CD14 revestido con microbolas, lleva el riesgo teórico de la activación de las células a través de TLR-4/CD14 vías de señalización, los procedimientos de adhesión llevar el mayor riesgo de activación de las células, como β2 integrinas se activan durante el proceso de adhesión.

Desde el punto de vista la bioinformática, nuestros datos demuestran cómo los experimentos de microarrays de genes pueden moverse rápidamente a partir de la generación de listas de genes para el desarrollo de plausible y comprobables modelos pertinentes de la biología y la fisiología. En concreto, demuestran que con ayuda de computadora, modelos fisiológicos es otro medio de corroborar los resultados de gama y ofrece la ventaja de proporcionar un enfoque para las pruebas de inmediato la importancia biológica de los microarrays de datos antes de emprender la laboriosa tarea a veces de confirmar la expresión diferencial de decenas o incluso cientos de genes identificados en un experimento de microarrays. Como se describe en la sección de resultados, las diferencias entre los grupos en la expresión génica en 45 minutos se debieron a una única sobre regulación de genes específicos de adultos en monocitos, una única baja regulación de otros genes en monocitos cable, o una combinación de ambos procesos para otros genes. Hemos buscado mecanismos que dan cuenta de estos patrones. En concreto, hemos analizado los genes dentro de derivados k-means grupos para determinar si un gran número de genes dentro de un grupo están relacionadas con la superposición de funciones utilizando ingenio Pathway Ayudar a los programas informáticos, o, alternativamente, a compartir la respuesta transcripcional elementos aguas arriba de estos genes. Sin embargo, estas estrategias no han logrado dilucidar razones para explicar estos hallazgos.

Nuestros estudios sugieren también que, si bien costosos y que consumen mucho tiempo para llevar a cabo, estudiar la cinética de la expresión génica mediante microarrays pueden ser altamente informativos. El estudio se informó anteriormente [14] la expresión de genes de examinar las diferencias entre adultos y monocitos de sangre de cordón se realizó en un solo punto de tiempo (18 horas después de la activación con un no fisiológicos dosis de LPS). Nuestros estudios sugieren que la biología no puede residir en los genes específicos que son expresados diferencialmente en un momento determinado punto, pero, como sería de prever con un sistema dinámico, los genes que se expresan cuando. Momento de la acumulación de mRNA puede determinar, entre otras cosas, si pro-apoptóticos señales se procesan en monocitos antes se produce la necrosis celular.

La validez de la dinámica y cinética enfoque está respaldada por el análisis de correspondencias (Figuras 3 y 4]. Estos análisis demuestran claramente que la acumulación de un ARNm no es un evento independiente. La transcripción de genes y la degradación de ARNm son procesos dinámicos estrechamente ligado a la acumulación o la degradación de otros mRNAs y la transcripción de sus afines proteínas. Nos sostienen que, sin esta visión dinámica de la actividad celular, los investigadores tratan de uso de microarrays de datos para dilucidar las biológicas o procesos patológicos se encontrará obstáculos innecesarios en los intentos de pasar de la generación de listas de genes específicos para las pruebas de hipótesis.

Abreviaturas

LPS - lipopolisacárido

DFA - análisis de función discriminante

HV - hipervariables

Agradecimientos

Apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (NIH), Centro Nacional de Recursos para investigación, un componente de los NIH, General Clinical Research Center Grant MO1 RR-14467, NIH subvenciones P20 RR020143-01, P20 RR15577, P20 RR17703, y P20 R016478-04 y por el Centro de Oklahoma para la Ciencia y la Tecnología (OCAST).

Los autores también desea extender su agradecimiento a Julie McGhee, MD, para su revisión y comentarios sobre este manuscrito.