Glucógeno sintasa quinasa 3, los ritmos circadianos, y el trastorno bipolar: un vínculo molecular en la acción terapéutica de litio

El trastorno bipolar es un común, crónica, severa, ya menudo ponen en peligro la vida enfermedad, que se caracteriza por episodios recurrentes de dos diametralmente opuestos estados de ánimo: la manía y la depresión [1]. A pesar de los esfuerzos clínicos que abarca cuatro décadas, la fisiopatología y etiología de la DBP siguen sin estar claros, en parte debido a la inherente heterogeneidad genética de los trastornos del humor afectiva [2]. Actualidad consolidado modelos de BPD sugieren que la interacción entre factores genéticos, epigenéticos, y los factores ambientales causan la enfermedad [1, 3].

Modos de terapia que se consideren eficaces para aliviar los síntomas han sido desconcertante con respecto a sus modos de acción a nivel molecular, celular, sistémica y de comportamiento. A pesar de cuatro décadas de uso clínico, y ha demostrado eficacia en la reducción de la frecuencia y gravedad de los episodios afectivos recurrentes, los mecanismos moleculares subyacentes a las acciones terapéuticas de litio, una característica de BPD terapéutica, aún no se han dilucidado plenamente [4, 5]. La identificación molecular de la meta (s) de los estabilizadores del ánimo no sólo facilitaría el desarrollo de mejores métodos de tratamiento, sino también proporcionar una base para el trazado de la fisiopatología de los trastornos del humor afectivos.

Características de ritmicidad circadiana representan una endophenotype que ha recibido una cantidad importante de la atención [2, 6]. La naturaleza cíclica del trastorno bipolar en sí, y las características clínicas de la depresión como prematuro despertar temprano en la mañana de sueño diurno y variación en el estado de ánimo, acortar la latencia del sueño REM, los avances en los anticonceptivos hormonales y los ritmos de temperatura, así como la actividad, poner de relieve la prevalencia del ritmo circadiano anomalías en los sujetos afectados, con especial tendencia a la fase de los anticipos y / o acortar los períodos [2, 6 - 8]. Por lo tanto, es de gran consecuencia que el litio se ha considerado que modificar el funcionamiento libre período o fase de numerosos sincronizada de comportamiento, fisiológicos, bioquímicos y ritmos diversos en parámetros experimentales realizadas sobre un filogenéticamente diversa variedad de organismos, incluidos los seres humanos [9]. La mayoría de coherente entre estas modificaciones es el efecto del período de prolongación y / o fase de demora. Ejemplos de estos iones de litio modificados ritmos incluyen retraso ritmos de consumo de alcohol y actividad locomotora en roedores [10, 11], así como la temperatura, la actividad, la latencia del sueño REM y de sueño / despertar ritmos de los sujetos humanos [12 - 14]. Por otra parte, inducida por el litio período de prolongación también se ha demostrado en el pacemaking propiedades de células individuales, lo que sugiere una modulación directa del mecanismo de reloj [15].

GSK3, una serina / treonina quinasa codificado en los mamíferos de dos isoformas, GSK3 α y β GSK3, es una consecuencia directa, in vitro e in vivo blanco de la inhibición de litio [16 - 18]. Shaggy (SGG), el homólogo de Drosophila GSK3, obras de teatro un papel central en la determinación circadiano período de duración en las moscas [19], proporcionando una moleculares objetivo de la mecánica base de litio de efectos terapéuticos. El sistema circadiano funciones para promover la óptima organización temporal de una variedad de estados especializados, en el tiempo segregar las que son incompatibles entre sí, integrando así neurotransmisor, endocrino y del comportamiento dysregulation cuyos mecanismos pueden estar involucrados en la fisiopatología de los trastornos afectivos [6]. Si bien hay muchas diferencias en la genética molecular y los detalles de los mecanismos circadianos en los mamíferos y Drosophila, los principios normativos básicos se mantienen [20, 21]. Central para el circadiano molecular de los distintos circuitos filogenéticamente diversos organismos están interconectados los positivos y negativos autoregulatory bucles de transcripción y traducción, proteína-proteína interacción, fosforilación, translocación nuclear, y la degradación, cuyo impuesto retrasos se combinan para crear un ciclo molecular que se aproxima a la ~ 24 Horas LD período medio ambiente [21]. Un importante determinante del período de duración es el retraso en la translocación nuclear de los complejos de regulación negativa, el momento de que esté bien regulado [22 - 27]. En Drosophila, se encontró SGG para modular la localización nuclear de la eterna / PERÍODO inhibitoria complejo, a través de su fosforilación de la proteína TIM, la promoción de la translocación nuclear del PER / TIM complejo [19]. En este sentido, la sobreexpresión de SGG dio lugar a un acortamiento del período intrínseco, mientras que una reducción de SGG actividad tuvo un período de alargamiento efecto, precisamente el sentido de atribuir a litio en el libre funcionamiento del período estudiado la mayoría de los organismos, incluida la Drosophila [28].

La naturaleza conservada evolutivamente de la circadiano mecanismo molecular [21, 29] y el período de alterar los efectos del litio conducido a la actual investigación del papel de GSK3 en el reloj circadiano de mamíferos. El examen de los perfiles de transcripción de genes fundamentales reloj sincronizado en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), tras genético o farmacológico reducción de la actividad GSK3, reveló un período de alargamiento / retrasar la fase efecto. Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan una base molecular para la eficacia terapéutica de litio, y validar GSK3 como un candidato de mamíferos "núcleo" de genes reloj.

Un siRNA secuencia objetivo, 5'-aaagcgtcagtcggggctatg-3 ', situado en la codificación de la secuencia N-terminal única prórroga a GSK3 α se identificó utilizando Ambion la meta buscador de siRNA [30]. A través de BLAST análisis, esta secuencia se determinó a ser único para ratón GSK3 α. El silenciador Express ™ siRNA expresión cassette (SEC) kit (Ambion) se utilizó para crear un SEC para GSK3 α con oligos dirigidas contra la GSK3 α secuencia objetivo se ha descrito anteriormente. La SEC fue clonado en PCR ^{®-Blunt-II-TOPO ®} (Invitrogen) y la secuencia fue verificada. Para hacer posible una línea celular estable generación, la SEC se sub-clonado en el único sitio EcoRI del plásmido pPUR (Clontech) para crear el plásmido pPUR_ASEC1. Inmortalizada MEFs derivados de GSK3 β nullizygous embriones [31] fueron transfectadas con ScaI-linearized pPUR_ASEC1 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dos días después de transfección, las células fueron sometidas a selección usando 2 μ g / ml puromycin (InVivogen). Puromycin-clones resistentes fueron aisladas, ampliado, y prueba de Western Blot para determinar el nivel de GSK3 α desmontables.

E14K ratón las células madre embrionarias con LoxP-recombinación sitios de acompañamiento exón 2 de GSK3 (ambos alelos), se hicieron nulo para GSK3 β a través de la orientación convencional de genes de primera para sustituir el exón 2, con una neo cassette positivo para la selección con G418 y luego hacer que la legitimación a través de homocigotos selección en 2,5 mg / ml G418 tal como está descrita anteriormente [32]. Estos GSK3 β ^(-/-); GSK3 α ^{(flox / flox)} ES células fueron inyectadas en blastocistos procedentes de ratones B6 para generar embriones quiméricos. Un total de 14 embriones a partir del 3 de las madres embarazadas beneficiarias fueron cosechadas en el día 16,5 DPC para generar distintas culturas primarias de fibroblastos de ratón cada embrión. Para seleccionar MEFs derivados de la inyectado células madre embrionarias, las culturas se encontraban bajo la selección con 1 mg / ml G418. Sólo el 1 de las 14 crías (10 crías) dio lugar a un gran número de G418-resistentes MEFs, mientras que los otros arrojado ninguna. El resistente MEFs se passaged 10 veces, el mantenimiento de selección en G418 y el uso de una relación de separación de 1:3. Después de 10 pasajes, las células entrado crisis. Inmortalizada de fibroblastos que se escapó crisis transduced con un retrovirus que expresa la libre creación ablación recombinado para generar la GSK3 β ^(-/-); GSK3 α ^{(flox / -)} (3/4KO) fibroblastos líneas utilizadas en este estudio [33].

MEFs se cultivaron en Dulbecco modificado del águila medio (DMEM) complementado con un 5% de suero fetal bovino (Gibco) y una mezcla de penicilina-estreptomicina-glutamina (Gibco de PSG). Puromycin resistentes MEF líneas fueron cultivadas, mantienen conmocionados suero y suero de hambre en el soporte de 2 μ g / mL puromycin. En caso de que se indique lo contrario, suero y suero de choque hambre los medios de comunicación se complementaron con una concentración final de 20 mM cloruro de litio o 25 μ M kenpaullone (Calbiochem). El suero de choque se realizó como se describió anteriormente por Balsalobre y colegas [34], con ligeras modificaciones: 4 × 10 ⁵ cm cells/10 cápsula de Petri se chapada en 6-7 días antes del experimento, suero y conmocionado por 2 horas a TP0, y posteriormente el suero de hambre en DMEM para la duración del experimento. En el momento indicado, tras dos helado de 10 ml de PBS lavados, las células fueron zadas en 1 mL de tampón RLT (QIAGEN) para las cosechas de ARN, o 1 mL de tampón RIPA proteínas para las cosechas. El lisados han sido recogidos, flash congelado en una de etanol / baño de hielo seco, y se almacena a -70 ° C hasta la extracción de RNA de células enteras o SDS-PAGE la preparación de la muestra.

Todos los cosechados RLT lisados fueron homogeneizados utilizando QIAshredder ™ columnas (QIAGEN), y el ARN se extrajo de la homogeneizada lisados utilizando columnas RNeasy ^® (QIAGEN). Las concentraciones de ARN fueron medidos por medio de espectrofotometría UV estándar a 260 nm. Todas las muestras fueron recolectadas diluido hasta el más bajo registrado concentración, y electrophoresed a través de un gel de desnaturalización para verificar la calidad del RNA. 1 μ g de ARN total fue inverso-transcrito con Stratascript ™ RT (Stratagene) a 42 ° C durante 1 hora en un volumen final de reacción de 10 μ l, y posteriormente diluida 5 veces para generar un poli-dT biblioteca de cDNA de cada muestra recolectada , Para su uso como plantilla en amplificación por PCR.

Para todos los perfiles de transcripción, las reacciones de PCR para todos los puntos de tiempo se prepararon de manera simultánea, donde 5 μ l de cDNA se añadió a 45 μ l de mezcla de PCR [10 × reacción de amortiguación, 0,5 unidad Taq DNA polimerasa (Roche), 0,2 mM dNTPs, y 50 pmol de primers]. Ciclos de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 1 min, ciclos de 45 s a 95 ° C, 60 s a 60 ° C, y 120 s a 72 ° C, y un último período de prórroga de 10 minutos a 72 ° C. La amplificación consistió en 25 ciclos de GAPDH, 27 ciclos de reverberación α y Bmal1, 30 ciclos de mCry1, y 34 ciclos de mPer2. El siguiente avance y retroceso primers fueron diseñados, sintetizados (ACTG Corp), y se utilizan en las anteriores reacciones: GAPDH adelante 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGCCG-3 ', GAPDH revertir 5'-CTCCTTGGAGGCCATGTAGGCCATGAGGTC-3'; reverberación α adelante 5'-CAGCTTCCAGTCCCTGACTCAAGGTTGTCCCACATAC - 3 ', reverberación α revertir 5'-GGCGTAGACCATTCAGCGCTTCATTATGACGCTGAG-3'; Bmal1 adelante 5'-CCGTGCTAAGGATGGCTGTTCAGCACATG-3 ', Bmal1 revertir 5'-GTCCTCTTTGGGCCACCTTCTCCAGAGGG-3'; mCry1 adelante 5'-GTGAACGCCGTGCACTGGTTCCGAAAGGGAC-3 ', mCry1 revertir 5'-GTCATGATGGCGTCAATCCACGGGAAGCCTG - 3 '; mPer2 adelante 5'-GATCAGCTGCCTGGACAGTGTCATCAGGTACC-3', y mPer2 revertir 5'-CTGAGCGTCGAGGTCCGACTAGGGAACTCAGCC-3 '. Amplificación por PCR con muestras de suero de cada choque experimentos se llevó a cabo al menos dos veces para asegurar la reproducción adecuada de los perfiles resultantes transcripcional.

MEFs se enjuagado 3 veces con PBS, colocado en hielo y luego raspar o bien en el hielo frío hipotónico amortiguador de lisis (50 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.4), complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) (200 μ l / pocillo de 6-así plato) en el caso de la selección clonal análisis, o 1 ml de helado RIPA buffer [1% (v / v) NP-40, 1% (w / v) deoxycholate de sodio, 0,1 % (W / v) SDS, 150 mM NaCl, 10 mM fosfato sódico (pH 7.2), 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM benzamidine, 25 mM β-glicerofosfato] complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) para el suero MEFs conmocionado. Hipotónica lisados fueron centrifugadas durante 1 hora a 4 ° C a 16100 × g. RIPA lisados fueron homogeneizados con 23 jeringas con aguja calibre, y se centrifuga a 13500 × g durante 12 minutos a 4 ° C en una microcentrífuga Eppendorf. El extracto clarificado se recogieron cuidadosamente a fin de que el precipitado y cualquier flotante restos celulares no fueron aspirados durante pipeting. El contenido de proteínas de los lisados se determinó a través de la Dc Determinación de proteínas (BioRad). Las muestras se ejecuta a través de un 8% SDS geles de poliacrilamida y por electroforesis transferidos a membranas PVDF. Los blots fueron bloqueados durante 1 hora (RT) en 5% leche descremada en polvo / TBS y luego incubadas durante 1 hora (RT) con los siguientes ratón anticuerpos monoclonales primario diluido en el 2% de leche descremada en polvo / TBST (TBS + 0,1% Tween - 20): GAPDH (1:100 000, el clon 6C5, Abcam); β-actina (1:20 000, el clon AC-15, Abcam); β-catenina (1:1000, clon 14, BD Transducción Labs), y GSK-3 (1:1000, clon 4G-1E, Upstate). Blots fueron enjuagarse 3 veces con el diluyente para anticuerpos y luego se incubaron durante 1 hora (RT) con la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con HRP (BioRad) diluido 1:10 000 en el mismo buffer. Después de 5 lavados con TBST (no leche), blots fueron incubadas durante 5 minutos con SuperSignal West Pico sustrato quimioluminiscente (Pierce). X-Omat azul científico de imágenes de película (Kodak) se utilizó para detectar la señal de quimioluminiscencia.

La investigación de la función y / o exigencia de GSK3 en el mecanismo del reloj circadiano se ve obstaculizada por el hecho de que GSK3 β nullizygous embriones desarrollen con normalidad a mediados de la gestación, pero mueren en torno a los 14 días de desarrollo embrionario [31]. Sin embargo, el descubrimiento de Balsalobre y colegas que las altas concentraciones de suero puede sincronizar el reloj de oscilación de los genes en Rat-1 fibroblastos establecido la existencia de relojes periféricos [34], cuyo oscilatoria mecanismo es similar y comparable a la central oscilador que residen en el suprachiasmatic núcleos (SCN) del hipotálamo [23, 35].

Aunque los patrones de expresión conocidos núcleo reloj genes se han documentado anteriormente, la fase de control de las relaciones entre determinados componentes de reloj se establecieron en el medio silvestre de tipo MEFs con fines comparativos anteriores a la investigación de los efectos de GSK3 deficiencia en el mecanismo de reloj. A raíz de suero tratamiento de choque, la oscilatoria perfil transcripcional de expresión de cuatro genes reloj - mPer2 (Período 2), mCry1 (Cryptochrome 1), Bmal1 y reverberación α, fueron examinados por la transcripción reversa (RT)-PCR. El CLK (Reloj) gen fue excluido de este estudio como CLK CLK ARNm y proteínas están expresadas constitutivamente [36]. Los perfiles de expresión resultante (fig. 1A] y la fase de las relaciones de estos cuatro genes eran compatibles con las cuentas publicadas con anterioridad [23, 24, 34, 37, 38].

Una vez establecido el oscilatoria fases de mPer2, mCry1, reverberación α, y Bmal1 en el medio silvestre de tipo MEFs, los efectos de GSK3 β deficiencia en ritmicidad circadiana se investigaron en GSK3 β nullizygous MEFs [31]. Por mCry1, reverberación α, y Bmal1, las horas punta de transcripción son idénticos a los observados en sus homólogos de tipo salvaje. La única alteración notable se observó un discreto cambio en la mPer2 pico se producen en el segundo ciclo, que es ~ TP44 en MEFs tipo salvaje (Fig. 1A, C], y el retraso de TP48 en GSK3 β ^{- / -} MEFs (Fig. 1B, C], mientras que el primer pico se produce a TP24 en ambos genotipos. En un entorno en el mecanismo del reloj circadiano, dentro de un rango funcional, es relativamente aislado de la reducción en los niveles absolutos de GSK3, la ausencia de GSK3 β podría ser compensada por las acciones de GSK3 α, donde en un 72 hr lapso de tiempo, una reducción del 50% GSK3 en niveles todavía puede ser suficiente para cumplir plenamente con la enzima de deberes funcionales. Por lo tanto, el objetivo "tumbar" de la isoforma α GSK3 en la β-null MEFs se llevó a cabo con el fin de minimizar la contribución de GSK3 en la generación de oscilaciones transcripcional.

Un total de 13 puromycin-clones resistentes fueron aisladas (A1.3 - A1.15), ampliado, y prueba de Western Blot para determinar el nivel de GSK3 α desmontables. Los primeros análisis Western Blot de la GSK3 estable α desmontables clones se hizo tan pronto como hubo un número suficiente de células (Fig. 2]. Los niveles de GSK3 α fueron evaluados, así como los niveles citosólica de β-catenina proteína, lo cual debería aumentar como total GSK3 disminuir los niveles [39 - 41]. Una clara reducción de GSK3 α los niveles de proteína con el consiguiente aumento de β-catenina niveles se detectó en varios de los puromycin clones resistentes, es decir, A1.4, 6, 7 y 13 (Fig. 2]. En particular, el clon A1.13 había apenas detectable proteína GSK3 α, así como el esperado aumento masivo en citosólicas β-catenina. Sin embargo, el nuevo análisis de estos cuatro clones, después de sólo 3 pasos adicionales, reveló que a pesar de la retención de puromycin resistencia, clon 13 se había recuperado GSK3 α expresión a un nivel comparable a su forma natural, mientras que el clon, hubo 7 (~ 50% de salvaje - tipo) se recuperó GSK3 expresión α (datos no presentados). El A1.4 y A1.6 clones inicialmente identificadas por tener un sub-máximo, pero significativo nivel de desmontables todavía conserva el mismo grado de reducción, con A1.6 muestra un mayor nivel de GSK3 α desmontables que A1.4. La completa "reversión" de clonar 13 sugiere que puede haber contra la selección de células con muy bajos niveles de GSK3 y GSK3 que pueden ser esenciales para la viabilidad MEF. El A1.4 y A1.6 clones fueron seleccionados para su posterior choque suero-análisis. Con el fin de garantizar que cualquier posible circadiano los efectos observados en estos clones no son un artificio de la transfección proceso, el pleno volvió A1.13 clon fue sorprendido y suero analizadas. El perfil transcripcional de mPer2, mCry1, Bmal1 y reverberación en la α A1.13 MEFs resultaron ser idénticos a los observados en los padres GSK3 β-null MEFs (datos no presentados).

El reloj gen mRNA perfiles de expresión se examinaron en el A1.4 y A1.6 clones. Considerando que la prolongación en el período de mPer2 observado en los padres GSK3 β-null línea celular fue sutil en el contexto de este ensayo, una forma mucho más distintivo y exagerado período de prolongación mPer2 fenotipo surgido de las nuevas RNAi mediada por la reducción de GSK3 α. El efecto sobre mPer2 fue más pronunciada en A1.6, que (1) carecen de los niveles séricos inducidos por transcripcional pico a TP4, y (2) tuvo un dramático ~ 8 hr retraso en la represión transcripcional, con picos de transcripción se producen en TP32 y TP52 (Fig. 3A, B]. Paralelamente a la A1.4 y A1.6 muestras de RNA, proteínas extractos fueron cosechadas en el 0, 4, 24, 36 y 48 horas después de la conmoción de suero, con el fin de supervisar la reducción relativa de los niveles de GSK3 expresión en los dos clones (Fig. 4]. Como era de esperar, sobre la base del proceso de selección, el clon A1.6 alcanzado el nivel más alto de "knock-down", sobre todo antes de (TP0) e inmediatamente después (TP4) suero de choque, el tiempo puntos en los que expresó A1.4 ligeramente niveles más altos de GSK3 (Fig. 4]. Estas observaciones fueron consistentes con el efecto intermedio inicialmente en mPer2 transcripción visto con el clon A1.4, que había derogado una detectables en suero, pero inducida por la activación de mPer2 expresión en TP4, y un ~ 4 Horas retraso en la represión transcripcional en el primer ciclo, con un pico a ~ TP28 (Fig. 3A, B]. Sin embargo, de TP48, en la que A1.4 y A1.6 ambos tienen niveles comparables de GSK3 residual de expresión, un retraso de ~ 8 hrs se observa con las dos clones, con un pico que ocurre en TP52 (Fig. 3A, B].

El litio, un inhibidor directo GSK3 [16 - 18], se sabe que constantemente alargar el período circadiano de una variedad de organismos en un dependiente de la dosis de forma [15, 42, 43]. De hecho, el litio ha demostrado alargar el período de tasa de disparos en las neuronas individuales del SNC [15], lo que sugiere un efecto sobre el pacemaking propiedades de células individuales, además de abierto a los efectos de comportamiento. La naturaleza mecánica de este efecto, sin embargo, a nivel de la maquinaria molecular circadiano, aún queda por dilucidado. Después de haber demostrado un efecto de alargamiento período en GSK3 desmontables MEFs, concretamente con respecto a mPer2 transcripcional oscilación, los efectos moleculares de litio a largo plazo se ha investigado en MEFs tipo salvaje. A final de litio concentración de 20 mM fue elegido en representación de la parte superior del rango de inhibición de GSK3, sobre la base de la in vitro curva dosis-respuesta a GSK3 de litio, tal como se describe en lo que respecta a Tau, así como reverberación α [17, 44, 45].

Como puede verse en los perfiles de transcripción, el litio también se encontró para producir el mismo período de prolongación. Por mPer2, picos de transcripción se retrasaron por 4-8 horas a ~ TP32 y TP52 (Fig. 3 A, C], pero a diferencia de A1.6, una modesta inducción de mPer2 se logró a TP4, que representa un suero respuesta iniciados antes de el pleno efecto inhibitorio de litio, cuya absorción es conocido por ser el máximo a ~ 2 hr en fibroblastos humanos [46].

El paullones fueron por primera vez como ATP-inhibidores competitivos de CDK1/cyclin B [47], y posteriormente demostrado que inhiben la GSK3 y otras CDKs [48], y, por tanto, representan una alternativa de clase de los inhibidores de GSK3 que son estructuralmente y de manera mecánica que no guardan relación con el litio. Aunque es un Alsterpaullone más potente inhibidor de GSK3 que kenpaullone, se ha demostrado que es menos específico y, por tanto, menos adecuadas para celulares basados en los ensayos [49]. Por otra parte, continua la exposición de MEFs a Alsterpaullone por un período de 72 horas resultó ser tóxico, ya que la mayoría de las células chapada perecieron después de "sólo" ~ 32 hrs (datos no presentados). Además, una proporción relativamente alta concentración inicial de kenpaullone se administró para tener en cuenta la degradación probable del compuesto durante un período de 72 hr. Como tal, kenpaullone, a una concentración final de 25 μ m, se administró durante e inmediatamente después de suero de choque y su efecto sobre la transcripción de genes reloj se investigó. El análisis de los perfiles de transcripción posterior reveló un efecto tangible en mPer2 período de duración. El suero inducida por mPer2 transcripcional pico a TP4 fue relativamente moderada (Fig. 3 A, C], un efecto visto con A1.4, A1.6, y litio. En el primer ciclo, una normal subjetiva pico se observó a TP24, con anterioridad a través de un retraso en TP36, mientras que el segundo pico de la transcripción se retrasó a TP52 (Fig. 3 A, C], de nuevo, como en los dos GSK3-clones y desmontables litio. El efecto de kenpaullone a GSK3 actividad ha demostrado ser lenta y gradual en diversas líneas celulares [50], y puede explicar, al menos en parte, por la latencia observada en el mismo.

Con el fin de confirmar aún más la circadiano repercusiones de GSK3 in vitro desmontable, y para atribuir los efectos observados en mPer2 transcripcional en bicicleta GSK3 específicamente a los niveles de expresión, un definido genéticamente estable knockout (3 / 4 DKO) MEF línea se generó a eludir las cuestiones de orientación y la respuesta celular especificidad presentada por el método de RNAi GSK3 desmontables. A pesar de numerosos intentos de generar estable GSK3 α y β doble knockout MEFs de GSK3 α ^{(flox / flox);} GSK3 β ^(-/-) MEFs utilizando cre-recombinado enfoques no han tenido éxito hasta la fecha, un GSK3 α ^{(flox / -)} MEF línea estable, designado como c2.1, se ha generado en un GSK3 β nullizygous fondo. Usando el paso antes, más joven y, por tanto, las líneas celulares disponibles, el perfil transcripcional mPer2 fue examinado en ambos A6 (wildtype) MEFs, y c2.1 3 / 4 DKO MEFs más de un 44 hr lapso de tiempo después de suero de choque (Fig. 5A, B ). Para controlar GSK3 expresión en c2.1 relativo a A6, extractos de proteínas de las dos líneas celulares fueron cosechadas a los 0, 4, 12, 24, 30 y 36 horas después de la conmoción de suero (Fig. 5C] en paralelo con el suero conmocionado y A6 c2.1 RNA de muestras. Asimismo, los Centros de Comercio entre los 20 y 32, ARN muestras fueron recolectadas en intervalos de 2 horas, en lugar de intervalos de 4 horas, para examinar mejor la fluctuación de transcripcional mPer2 en este intervalo de tiempo crítico.

Como anteriormente se ha descrito, mPer2 transcripción en wildtype MEFs llegaron a un máximo de TP24, a raíz de la transcripción inicial de respuesta a suero de choque en TP1 (Fig. 5A, D]. Por el contrario, a pesar de un pico similar a la transcripción en TP1, mPer2 transcripcional de expresión fue mitigado por la amplitud y mantenerse cerca de niveles máximos entre TP24 y TP28 y represión transcripcional en c2.1 se retrasó hasta después de TP28 (Fig. 5B, D], un efecto en consonancia con los anteriores resultados obtenidos por la reducción de la actividad GSK3 de shRNA, genéticamente o farmacológicamente. Para asegurar la reproducibilidad, A6 y transcripcional muestras fueron recolectadas perfiles generados y por triplicado, mientras que el c2.1 muestras fueron recolectadas y ha generado en sextuplicate (Fig. 5E].

El ~ 4 Horas prolongación en mPer2 transcripción c2.1 en la línea celular, que es del 75% deficiente en la mayoría de GSK3 expresión se asemeja a la ~ 4 Horas mPer2 transcripcional alargamiento observado previamente con la caracteriza A1.4 línea que exhiben un nivel similar de GSK3 α expresión .

Nuestros resultados han demostrado que tanto genéticos y farmacológicos reducción de la actividad GSK3 tienen un efecto específico sobre la oscilación circadiana transcripcional que consiste en alargar mPer2 período siguiente suero choque mediada la sincronización in vitro, lo que indica un retraso en la fase. Esta es una característica en particular con respecto a litio de estabilizar las propiedades de ánimo, teniendo en cuenta la correspondencia entre mPer2 expresión y ritmos de comportamiento [51], lo que sugiere que mPer2 pueden estar más íntimamente implicados en impulsados por el comportamiento que otros genes reloj. La cuestión ahora será la siguiente: ¿cómo puede una disminución de la actividad GSK3 resultado en la fase retraso, concretamente con respecto a Per2, teniendo en cuenta el actual paradigma del mecanismo del reloj circadiano? Como los inhibidores de primaria transcripcional, período longitud está controlada por el mCRY proteínas, a través de sus regulados y mPER-heterodimerization dependientes de calendario de la translocación nuclear [24, 26, 52]. Este post-translacional modificaciones impuestas por retraso en la translocación nuclear está optimizado para mantener un periodo de ~ 24 Horas [21, 53]. Modelación matemática de los mamíferos oscilador circadiano bucles ha demostrado que la extrema retrasos (~ 7 horas) se puede lograr variando la tasa de importación nuclear de la PER / CRY complejo, y las demoras> 8,8 hr entre Per / Cry mRNA y nucleares PER / CRY resultado la acumulación de proteínas en la supresión de oscilación [54]. Las predicciones de este modelo fueron consistentes con los hallazgos en cultivos de fibroblastos de la falta de sincronización primaria derivados de mPer2 ^{Luciferase-SV40} ratones knockin, cuyos períodos rítmicos se encontró que van desde 22 a ~ ~ 30 hrs [55]. Por otra parte, mPer2 expresión se consideró la fase de retraso de 8 h de reloj en ratones mutantes en comparación con el de tipo salvaje hermanos [56]. Por lo tanto, la demora máxima de ~ 8 horas en mPer2 logrado en el presente estudio establece, además, este límite superior en el periodo longitud permitida, más allá de que el fracaso catastrófico en ritmicidad puede dar lugar. Este nivel de plasticidad periódico es probable permitido, al menos en parte, por la característica diferencia de ~ 8 hr transcripcional entre los picos de mPer1 / 2 y mCry1 [24], y la limitación de velocidad mPER función de las proteínas para PER-CRY y la interacción acumulación nuclear [52]. Como tal, asumiendo un PER / CRY complejo nuclear de la promoción de la translocación de GSK3 papel similar al de SGG y los PER / TIM complejo en la Drosophila mecanismo de reloj [19], se postula que una reducción en los niveles de GSK3 puede producir un retraso en la translocación nuclear del PER / CRY complejo. Más recientemente, Iitaka y colegas [57] encontró que GSK3 β (i) interactúa con PER2 in vitro e in vivo, (ii) puede phosphorylate PER2 in vitro, (iii) promueve la translocación nuclear de PER2 en células COS1 y (iv) la sobreexpresión ~ causó un anticipo de 2 horas en mPer2 fase. Extreme fenotipos están definidas por las mutaciones que alteran período de> 15% (3-4 hr) o conducir a la pérdida completa de los ritmos circadianos. En los casos en que los mutantes nulos son letales, una extrema fenotipo puede considerarse lo suficientemente convincentes para definir un reloj de genes de interés. El mClk, DBT, Tau, y que aquí se describen GSK3 mutantes entran en esta categoría en la que las mutaciones causadas> 4 h período de cambios y mutaciones nulas cierto no están disponibles [58].

El litio, un bien documentado directo inhibidor de la GSK3, ha sido una piedra angular de BPD terapéutica a pesar de una escasez de conocimientos sobre la naturaleza de su eficacia y su modo de acción. Su capacidad para modular la ritmicidad circadiana sin embargo, específicamente su fase retrasar en numerosas propiedades, filogenéticamente diversos organismos, ha sido un factor importante en el establecimiento de un nexo causal y symptomalogical relación entre DBP y los ritmos circadianos. En estudios de comportamiento donde las concentraciones de litio comparables a los utilizados en los seres humanos para el tratamiento de la DBP (0.6-1.2 mM) son administrados, el período de alterar los efectos a menudo se medirán a lo largo del lapso de semanas o meses, y producen sutiles pero significativos efectos suele medirse en minutos en lugar de horas [2]. Por el contrario, las células basadas en ensayos de cultura con mucho más limitado temporal ventanas de observación, como el presente estudio, han demostrado la necesidad de mayores concentraciones de litio [15, 43, 44, 57, 59]. De hecho, la mejora clínica de BPD de ánimo en los pacientes a menudo toma semanas en aparecer tras la administración crónica de litio [60], un lapso de tiempo coherente con una progresiva redistribución de los reloj circadiano. Por otra parte, una serie de estudios han examinado SNP mutaciones en la β GSK3 eficaz promotor. Kwok y colaboradores [61] mostró que un T / C en sustitución de dicho promotor se asocia con el nivel de actividad transcripcional, con C en sustitución resultante disminución de expresión, mientras que tres estudios realizados por Benedetti et al. han demostrado C / C homocigoto BPD pacientes comparten características clínicas sugerentes de una forma más leve de la enfermedad, incluida una edad más tardía de inicio, una mejor respuesta antidepresivo, y una mejor respuesta a largo plazo para la estabilización de ánimo de litio [61 - 64]. Los resultados también ofrecen una posible explicación a un informe en el que 2 circular maníaco-depresiva cuyos temas relojes circadianos se consideraron "demasiado lento" de litio no respondedores, mientras que 5 sujetos en el mismo estudio con un "rápido" ritmo circadiano libre correr se responda [65].

Atack [66] adecuadamente propone que cualquier hipótesis sobre las acciones terapéuticas de litio debería ser capaz de explicar cómo se controla tanto la manía y la depresión por la modulación de la actividad de distintos sistemas neurotransmisores que controlan ambos extremos de ánimo. Señalización de objetivos directos de GSK3 es poco probable que satisface plenamente este requisito. Sin embargo, el papel modulador de GSK3 en el mecanismo del reloj circadiano, cuyas señales de salida regular diversos neurotransmisores y sistemas de neuropéptido, sienta las bases de litio mediada por el control de una amplia gama de vías de señalización neuronal en las anomalías que se han demostrado en DBP. Por otra parte, neuroactive drogas comúnmente no alterar el calendario circadiano [67]. Por lo tanto, es altamente significativo el hecho de que otros tres no relacionados estructuralmente antidepresivos - la segunda generación de inhibidores de la monoamino oxidasa (IMAO) clorgyline, el antidepresivo tricíclico imipramina, y el selectivo de serotonina reuptake inhibidor (ISRS) fluoxetina, se han atribuido propiedades chronobiotic en los estudios de su administración crónica en roedores [6, 68].

Teniendo en cuenta el subconjunto de pacientes con DBP que no son sensibles a litio, y el hecho de que las anormalidades circadiano no necesariamente resultado en los trastornos del humor [6], y viceversa, la inhibición de GSK3 de litio en el contexto de los ritmos circadianos no es una panacea para el tratamiento de los trastornos del humor afectivos. Sin embargo, (i) el cíclico y naturaleza episódica de los síntomas BPD, (ii) la prevalencia de alteraciones del ritmo circadiano en DBP, (iii) la conservadas evolutivamente coherente período / fase alterar los efectos del litio, (iv) intervención directa de la inhibición de GSK3 litio in vivo e in vitro, y (v) el papel de Sgg/GSK3 en el período de modulación de longitud en la mosca de la fruta y murino relojes, lugares GSK3 a la vanguardia de la lista corta de objetivos fisiológicos conocidos en la eficacia terapéutica de litio en BPD.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

SK llevó a cabo el suero de ensayos de choque cultura, el aislamiento del RNA de muestras, amplificación por PCR y Western análisis de las muestras, participó en el diseño del estudio, y redactó el manuscrito. Generado la BD GSK3 RNAi líneas mutantes (A1.4 y A1.6 ), Generó la c2.1 3 / 4 DKO mutante, y llevó el análisis clonal Occidental y la selección. NA participó en el análisis de los resultados y la cifra diseños. JW participado en el diseño del estudio. Concebido AM del estudio, participaron en su diseño y la coordinación, y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.