Cardiovascular Diabetology, 2007; 6: 7-7 (más artículos en esta revista)

Los niveles plasmáticos de leptina, omentin, colagenosa repetir que contengan la secuencia de 26-kDa de proteínas (CORS-26) y adiponectin antes y después de la absorción oral de glucosa en adultos delgado

BioMed Central
Sylvia Wurm (sylvia_wurm@hotmail.com) [1], Markus Neumeier (markus.neumeier @ klinik.uni-regensburg.de) [1], Johanna Weigert (johanna.weigert @ klinik.uni-regensburg.de) [1] , Andreas Schäffler (andreas.schaeffler @ klinik.uni-regensburg.de) [1], Christa Buechler (christa.buechler @ klinik.uni-regensburg.de) [1]
[1] Departamento de Medicina Interna I, Hospital Universitario de Regensburg, D-93042 Regensburg, Alemania

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

El tejido adiposo son las proteínas secretadas colectivamente llamado adipocytokines e incluir la leptina, adiponectin, resistin, colagenosa repetir que contengan la secuencia de 26-kDa de proteínas (CORS-26) y omentin. Varios de estos adipocytokines influir en la sensibilidad a la insulina y el metabolismo de la glucosa y los niveles sistémicos, por tanto, puede verse afectada por la absorción oral de glucosa. Considerando que los resultados contradictorios se han publicado para la leptina y adiponectin, resistin no ha sido ampliamente investigada y no los informes sobre omentin y CORS-26 existen.

Métodos

Por lo tanto los niveles plasmáticos de estas proteínas antes y 120 minutos después de una carga oral de glucosa fueron analizados en 20 de la insulina altamente sensibles, los adultos jóvenes de ELISA o inmunoblot.

Resultados

Leptina circulante se redujo 2 h después de la absorción de glucosa que adiponectin y resistin niveles no se cambian. Distribución de adiponectin y CORS-26 isoformas fueron similares antes y después de la ingestión de glucosa. Omentin es muy abundante en el plasma y el análisis de inmunoblot no reveló alteraciones cuando los niveles plasmáticos antes y 2 h después de la ingesta de glucosa fueron comparados.

Conclusión

Tomados en conjunto nuestros datos indican que sólo la leptina se reduce la absorción de glucosa-insulina en probands sensibles que adiponectin y resistin no se alteren. CORS-26 se demostró por primera vez a circular como de alto peso molecular en forma de plasma y al igual que omentin no estuvo influenciada por la carga oral de glucosa. Omentin ha demostrado mejorar la insulina-glucosa estimulado la absorción sistémica, pero los niveles no son correlacionados con niveles de glucosa en sangre postprandial.

Fondo

Varios tejido adiposo proteínas de origen tienen una gran influencia sobre la regulación de la homeostasis energética y, por tanto, están en el centro de investigaciones en curso. La leptina, en el hipotálamo, regula la absorción de los alimentos y, además, tiene numerosos efectos sobre las células periféricas y órganos incluyendo la regulación de las células inmunitarias, las células beta pancreáticas, adipocitos, músculo y el hígado y la sensibilidad a la insulina [1]. Adipocytokines también puede ejercer una función metabólica en la hiperglucemia postprandial y por lo tanto, la leptina sistémica se ha investigado en varios estudios. Las concentraciones de leptina durante la tolerancia a la glucosa oral test (OGTT) en las mujeres de peso normal se encontraron sin cambios, mientras que en mujeres obesas un aumento [2, 3] o alteraciones no han sido descritas [4]. En la insulina-los hombres sensibles, una reducción de la leptina se detectó en obesos y delgados probands mientras que en las resistentes a la insulina estado, la leptina no cambió [5].

Si bien sistémica es el aumento de leptina en la obesidad, se reduce adiponectin [6]. Adiponectin se conoce a ejercer anti-inflamatorios y sensibilizar a la insulina efectos pero, además, actividades proinflamatorias han sido descritas [6 - 8]. Adiponectin circula en la sangre como trimers, hexamers, y de mayor peso molecular (HMW) complejos [6] y estudios recientes indican que el HMW adiponectin es la forma activa de la proteína [9]. Total circulante adiponectin, fue significativamente superior en las mujeres con síndrome de ovario poliquístico en 120 minutos de OGTT [10] que no fue alterada en condiciones normales de glucosa tolerante, problemas de tolerancia de glucosa y diabéticos tipo 2 probands 2 h después de la ingestión de glucosa [11]. El adiponectin paralog CORS-26 (colagenosa repetir que contengan la secuencia de la proteína 26 kDa) se produce en adipocitos y monocitos y tiene propiedades antiinflamatorias [12]. Aunque los datos in vitro indican que CORS-26 es una proteína secretada [12], CORS-26 en plasma humano no se ha investigado hasta ahora.

Resistin, inicialmente identificado en ratones un tejido adiposo proteínas derivadas, se ha asociado con la inflamación de bajo grado y la resistencia a la insulina en pacientes diabéticos tipo 2 [13]. Aunque en roedores resistin claramente perturba la glucosa y la homeostasis de lípidos, su función en los seres humanos es poco clara [14]. Hasta el momento ninguna asociación de distribuir resistin la homeostasis de la glucosa y se ha identificado y controles sanos aun tenian niveles significativamente más altos niveles sistémicos resistin que los pacientes con tipo 1 y tipo 2 diabetes [15]. Sistémico resistin fue determinada después de carga oral de glucosa y no fue significativamente alterada en el curso de OGTT [10].

Omentin es muy abundante en el estroma vascular fracción de grasa visceral y se detectó en el suero humano de inmunoblot [16]. Recombinante omentin aumenta la insulina estimula la absorción de glucosa en adipocitos [16] pero hasta ahora no se analiza si sistémica omentin se ve afectada por la hiperglucemia aguda.

El tejido adiposo proteínas secretadas anteriormente descritos han sido investigadas en 20 jóvenes, sensibles a la insulina probands después del ayuno nocturno y 2 h después de la absorción de glucosa. Los datos obtenidos pueden ayudar a aclarar aún más la regulación fisiológica de bien descritas las proteínas plasmáticas como la leptina y adiponectin, pero además revelan nuevas perspectivas sobre la abundancia de resistin, omentin y CORS-26 en el plasma de los adultos jóvenes antes y después de la absorción de glucosa.

Métodos
Temas

Veinte sujetos sanos (6 mujeres y catorce hombres, rango de peso: 55-86 kg, con una media de IMC de 22,5 ± 2 kg / m 2, con una edad media de 22,2 ± 0,5 años) participaron en el estudio. La base de muestra de sangre fue tomada después de la noche a la mañana en ayunas. Se les dio 75 g de glucosa disueltos en 300 ml de agua y una segunda muestra de sangre se tomó 2 horas más tarde. El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética local y se llevó a cabo de conformidad con las directrices de Helsinki. Todos los probands dio por escrito el consentimiento informado para participar en el estudio.

Reactivos

DuoSet ELISA Sistema de Desarrollo para resistin humanos, la leptina y adiponectin, así como CORS-26 y adiponectin anticuerpos fueron adquiridos a partir de R & D Systems (-Nordenstadt Wiesbaden, Alemania). La insulina se realizó mediante ELISA de Mercodia (Uppsala, Suecia). Omentin anticuerpo se planteó en los conejos con el uso de un péptido (IYQKYPVKYGEGKC) para la inmunización.

SDS-PAGE y immunoblotting

El plasma fue diluido 1:1000 en PBS para la detección de adiponectin, 1:200 para CORS-26 y 1:50 de omentin immunoblots. Las proteínas fueron separadas por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron a membranas PVDF. Incubaciones con los anticuerpos se han realizado en un 5% nonfat seco de leche en PBS, 0,1% Tween. La detección de los complejos inmunes se llevó a cabo con la ECL Western blot sistema de detección (Amersham Pharmacia, Deisenhofen, Alemania).

In-vitro traducción de omentin

De larga duración humanos omentin (GenBank astillero. No. CB266342 ) Fue amplificado con los primers omentin_uni: 5'-atgaaccaactcagcttcctgct-3 'y omentin_rev: 5'-acgatagaatagaagcacagca-3' de tejido adiposo humano mRNA y se clonado en el vector de expresión pcDNA3.1/V5-His (C) TOPO TA ( R) (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y secuenciados. In-vitro traducción se realizó con el TNT ® T7 Rápida Junto Transcripción / Traducción System (Promega, Mannheim, Alemania).

ELISA

Las pruebas ELISA se realizó según lo recomendado por el distribuidor.

Estadísticas

Los datos se presentan como media ± desviación estándar (12,0 SPSS para Windows). Diferencias estadísticas fueron analizadas por pareados, dos de cola de la t de Student y prueba de un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados
Oral prueba de tolerancia a la glucosa (OGTT)

Veinte sujetos sanos participaron en el estudio y niveles de glucosa en sangre en ayunas fue de 88 ± 7 mg / dl (valor de referencia de 70 a 110 mg / dl) y 2 h después de que el reto de glucosa en 79 ± 14 mg / dl (valor de referencia: menos de 140 mg / dl). La insulina fue de 2,4 ± 1 mU / l antes y 7,4 ± 3,7 mU / l 2 h después de la ingesta oral de glucosa. El Homeostasis Model Assessment (HOMA) Índice fue de 0,5 ± 0,2 (valor de referencia <1), indicando una alta sensibilidad a la insulina de la probands que participaron en el estudio actual.

Determinación de leptina y de plasma adiponectin

La leptina se determinó en el plasma de los 20 probands en ayunas y fue de 3,0 ± 2,8 ng / ml y 2 h después de la glucosa desafío que llegó a niveles de 2,5 ± 2,5 ng / ml (p = 0,0003) (Figura 1A]. La leptina en las mujeres en ayunas fue de 6,7 ± 2,1 ng / ml, y 2 h después de la glucosa reto que fue de 5,7 ± 1,9 ng / ml (p = 0,0006). En los hombres 1,3 ± 0,5 ng / ml se detectó en la mañana y 1,1 ± 0,6 ng / ml (p = 0.0005) postprandial. La leptina es mayor en las mujeres abundantes y esto fue confirmado en nuestro grupo de estudio (p <0,0001).

Adiponectin fue significativamente mayor en las mujeres con 21,3 ± 11,8 μ g / ml en comparación con los hombres, con 10,1 ± 3,4 μ g / ml. En ayunas, adiponectin fue del 13,5 ± 8,5 μ g / ml y 13,1 ± 6,7 μ g / ml 2 horas después de la absorción de glucosa (p = 0,27) cuando el plasma de todos los donantes se comparó. Se obtuvieron resultados similares cuando los hombres y las mujeres se analizaron por separado (no mostrado). Además de distribuir adiponectin total, los niveles de la HMW adiponectin isoformas fueron analizados por inmunoblot. Plasma muestras fueron separadas por SDS-PAGE en ausencia de condiciones y la reducción de HMW-APM se detectó en todas las muestras de plasma (Figura 1B]. La reducción de las condiciones de convertir la APM-HMW a una subunidad de proteína de aproximadamente 75 kDa más probable es que se asemeja trimeric APM y cantidades similares fueron detectados en el plasma antes y después de la ingestión de glucosa (Figura 1B].

Determinación de plasma resistin

Resistin fue 1,77 ± 0,57 ng / ml antes y 1,77 ± 0,59 ng / ml después del desafío de glucosa (p = 0.47) y datos similares se obtuvieron cuando resistin muestras de plasma de los hombres y las mujeres se calcularon por separado (no se muestra).

Análisis de CORS-26 de inmunoblot

Especificidad de la CORS-26 anticuerpo fue analizado por inmunoblot recombinante utilizando adiponectin recombinante y CORS-26 producidos en células de insectos [7, 12]. 100 ng de proteína se separó por SDS-PAGE y la plata tinción del gel reveló cantidades similares de proteína (Figura 2A]. Las membranas se hibridó con adiponectin o CORS-26 y anticuerpos cada antisuero específico puesto de manifiesto una señal con las respectivas proteínas (Figura 2A].

Plasma de 20 probands fue analizado por inmunoblot utilizando el CORS-26 y anticuerpos CORS-26 se encontró muy abundante. La cuantificación de los immunoblots utilizando software OptiQuant reveló a 2 veces en CORS-26 cuando los niveles plasmáticos de todas las muestras se compararon (no se muestra).

CORS-26 fue igualmente abundantes antes y después de la absorción de glucosa en inmunoblot, pero no es adecuado para detectar cambios de menos de 20% en los niveles de proteína y, por consiguiente, alteración por debajo del 20% no se puede excluir (Figura 2B]. Plasma muestras fueron separadas por SDS-PAGE en virtud de no reducir las condiciones y CORS-26 fue detectado en todas las muestras de plasma como de alto peso molecular complejo de unos 180 a 250 kDa (Figura 2B]. La reducción de las condiciones de convertir el HMW-CORS-26 a una subunidad de proteína de alrededor de 60 kDa que pueden semejar monómeras o dimeric proteínas y cantidades similares fueron detectados en el plasma antes y después de la ingestión de glucosa (Figura 2B].

Análisis de omentin de inmunoblot

In vitro traducido omentin y un control con una proteína C-terminal V5 etiqueta se utiliza para inmunoblot utilizando un anti-V5 anticuerpos (no se muestra) o anti-omentin de anticuerpos (Figura 3A]. Anti-omentin detecta anticuerpos específicamente omentin proteína y, por tanto, se utilizó para immunoblots. Plasma antes y después de la absorción de glucosa se analizó omentin y con un peso molecular de 30 kDa similar se encontró abundante y un representante resultado se muestra en la figura 3B. Serial dilución de plasma puesto de manifiesto que una diferencia del 20% puede ser detectada por inmunoblot y la posterior cuantificación de las señales con OptiQuant software (no se muestra).

Una alta variabilidad de los niveles plasmáticos omentin se identificó cuando se plasma de diferentes donantes y se comparó la cuantificación de inmunoblot utilizando software OptiQuant reveló un máximo de 5,8 veces. Sin embargo, estas variaciones no guardaban relación con el género de los donantes de plasma (Figura 3C]. Correlación de Pearson no identificó una correlación de los niveles plasmáticos omentin con el ayuno o postprandial de glucosa en la sangre o cambios en el nivel de glucosa en sangre en ayunas cuando los valores y los valores 2 h después de la ingestión de glucosa se calcularon (no se muestra).

Discusión

Tejido adiposo segrega una variedad de moléculas en la circulación. Estos adipocito derivados de las proteínas participan en el mantenimiento de la homeostasis energética, la acción de insulina, glucosa y metabolismo de los lípidos y, por tanto, sytemic se analizaron los niveles de antes y 2 h después de la absorción de glucosa. Dado que la mayoría de los estudios se centran en probands sobrepeso o pacientes que pueden no reflejar la situación normal, los niveles plasmáticos de varios tejido adiposo proteínas secretadas se analizaron en ayunas y 2 h después de la ingestión de 75 g de glucosa en la joven, delgado y muy sensible a la insulina adultos.

En contraste con algunos estudios que describen una inducción o no alteraciones de la leptina [2 - 4], sistémica leptina se encontró reducción de 2 h después de la ingestión de glucosa al 85 ± 8% en nuestro grupo de estudio y esto es en conformidad con las conclusiones de Masuo et al. [5], donde la insulina sensible probands también mostraron menores niveles de leptina. La leptina no se alteró en resistentes a la insulina temas en su estudio [5] que indica una alteración de la respuesta sistémica a la leptina resistentes a la insulina probands. La leptina se sugiere aumentar la sensibilidad a la insulina o causar resistencia a la insulina [17] y la obesidad se asocia con resistencia a la leptina y una disminución del transporte de leptina a través de la barrera hemato-encefálica [18]. La leptina parece ejercer su función principalmente en el hipotálamo. La leptina aumenta el volumen de negocios de serotonina por inhibición del óxido nítrico (NO) de síntesis en el cerebro y el hipotálamo endógena de serotonina (5-hydroxytryptamine) está bien descrita para controlar el apetito y la ingestión de calorías [19]. La inyección de leptina en el hipotálamo ventromedial aumenta la absorción de glucosa y glucógeno hepático disminuye sin ningún tipo de alteraciones plasmáticas de insulina, o los niveles de glucosa lo que sugiere que los efectos periféricos de la leptina en el metabolismo de la glucosa están mediadas por el sistema nervioso central [20]. Bradiquinina y NO se identificaron a participar en leptina mediada por la absorción de glucosa en músculo esquelético [21].

La leptina no es sugerido para regular a corto plazo la ingesta de alimentos y la administración central de la leptina en monos reducido la ingesta de alimentos al día siguiente [22]. Por consiguiente reducción de la leptina circulante después de la ingestión de carbohidratos puede ser un factor importante en el control del peso corporal en adultos delgado.

En contraste con la leptina, adiponectin y resistin no se alteró 2 h después de la absorción de glucosa y esto está de acuerdo con estudios recientes [10, 11] que indica que adiponectin sistémica y resistin no están influidas a la hiperglucemia aguda y / o hiperinsulinemia. Adiponectin aumenta la señalización de la insulina mediante la reducción de p70 S6 quinasa mediada por fosforilación de la serina del IRS-1 [23], pero los niveles sistémicos adiponectin no se vean influidos por la absorción de hidratos de carbono. La expresión mRNA de la adiponectin receptores AdipoR1 y AdipoR2 se reduce de refeeding en ratones y de insulina in vitro que indican que adiponectin efectos están regulados a nivel del receptor en la fase postprandial [24]. Resistin se considera como una proteína proinflamatoria y acaba de poner de manifiesto para bloquear la señalización de insulina en hepatocitos humanos [25], pero al menos resistin sistémica no se ve influenciada por la absorción de glucosa-insulina en probands sensibles.

El adiponectin paralog CORS-26 ha demostrado ser muy abundante en el plasma humano, por primera vez, que no fue detectado en el suero del ratón [26]. Por otra parte, similar a adiponectin, CORS-26 circula como un complejo HMW que se convierte en una de menor peso molecular de forma denaturating condiciones. Sistémico CORS-26 fue similar antes y después de la absorción de glucosa a pesar de inmunoblot análisis sólo puede ser el adecuado para detectar los cambios de al menos el 20% y un adecuado ELISA es necesario investigar más a fondo sistémica CORS-26. Hasta el momento el papel fisiológico de CORS-26 no está claro. E. coli produce CORS-26 estimula la proliferación de precursores chondrogenic condrocitos y por lo tanto la regulación de chondrogenesis cartílago y el desarrollo [27]. En contraste con adiponectin que sólo es sintetizado por adipocitos, CORS-26 se expresa también en células de riñón y monocitos [12]. Sin embargo CORS-26 puede ejercer funciones similares a adiponectin, efectos antiinflamatorios y [12] y la formación de HMW complejos, tanto de proteínas también apoya esta hipótesis. Por lo tanto el efecto de recombinación CORS-26 en la señalización de insulina tiene que ser investigado más a evaluar el papel fisiológico de esta proteína.

Omentin, inicialmente identificado como intelectin-1 se expresa en las células intestinales paneth [28, 29], es muy abundante en el estroma vascular fracción de tejido adiposo omental [16]. Omentin se detectó en el suero de tres donantes y la concentración está decidido a ser de 100 ng a 1 μ g / ml [16]. Esta proteína reconoce galactofuranose y juega un papel importante en el reconocimiento de las bacterias de componentes específicos en el país de acogida [30]. En el estudio actual se omentin fácilmente detectados en plasma de inmunoblot, pero los niveles no fueron marcadamente influidos a la absorción de glucosa ni en relación con el género de los donantes. Omentin aumenta la insulina estimulada por la absorción de glucosa subcutánea y visceral adipocitos humanos in vitro [16] y, por tanto, omentin sistémica puede influir en los niveles de glucosa posprandial. Sin embargo, los niveles sistémicos omentin no se correlacionó con la glucosa posprandial en sangre que indican que al menos circulan omentin no está directamente asociado con los niveles de glucosa posprandial en vivo.

Conclusión

La hiperglucemia posprandial se asocia con un menor mientras que la leptina circulante resistin y adiponectin no se alteren los delgados, sensibles a la insulina probands. CORS-26 y omentin son muy abundantes en el plasma humano y no están gravemente afectados por la absorción de glucosa, aunque este tiene que ser confirmado con un método cuantitativo más. Los estudios futuros tendrán que dilucidar aún más la importancia biológica de estos adipocytokines en la homeostasis de la glucosa.

Abreviaturas

El índice de masa corporal (IMC), Collagenous repetir que contengan la secuencia de 26-kDa de proteínas (CORS-26), de alto peso molecular (HMW), Homeostasis Model Assessment (HOMA), de bajo peso molecular (Lmw), los anticonceptivos orales prueba de tolerancia a la glucosa (OGTT).

Declaración de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

SW realizó la OGTTs y llevó a cabo inmunoensayos y immunoblots, MN y JW llevó a cabo inmunoensayos, AS participado en el diseño del estudio, CB concebido del estudio, y participó en su diseño y la coordinación.

Agradecimientos

El experto de asistencia técnica de Natalie Smolnikow y Kerstin Winkler es muy apreciado. El estudio fue parcialmente apoyado por el Regensburger Forschungsförderung Medizin (reforma C).