Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2007; 6: 2-2 (más artículos en esta revista)

Evaluación de antibióticos para su uso en la medicina utilizando un modelo de biofilm poloxámero

BioMed Central
Abi L Clutterbuck (abiclutterbuck@gmail.com) [1], Christine A Cochrane (CACochrane@liverpool.ac.uk) [2], Jayne Dolman (Jayne.dolman @ bms.com) [3], Steven L Percival (steven . percival@bms.com) [3]
[1] Universidad de Gales, Instituto de Estudios Rurales, Aberystwyth, Ceredigion, Gales, SY23 3AL, Reino Unido
[2] Universidad de Liverpool, Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias, División de Estudios Equinos, Leahurst, Neston, South Wirral, CH64 7TE, Reino Unido
[3] ConvaTec herida Terapéutica ™, GDC, la Primera Avenida, Deeside Industrial Park, Deeside, CH5 2NU, UK

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Resumen
Fondo

Infecciones de la herida, debido a biofilms, son un problema constante debido a su carácter recalcitrante hacia los antibióticos. Antibiótica adecuada selección para el tratamiento de estas infecciones biofilm es importante. La tradicional in vitro disco método de difusión para los antibióticos de selección de cultivos bacterianos usos cultivados en placas de agar. Sin embargo, la forma de crecimiento de las bacterias en agar no es representativo de cómo las bacterias crecen en las heridas y otros tejidos como los sitios aquí las bacterias crecen naturalmente en un biofilm. El objetivo de esta investigación fue poner a prueba un método más adecuado para probar la eficacia antimicrobiana en biofilms y comparar con los métodos estándar utilizados para pruebas de sensibilidad antibiótica.

Métodos

Membrana externa de proteína se realizó un análisis sobre la E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis y Acinetobacter juni cuando se crece en agar Mueller Hinton ( 'cuasi-estado biofilm') y el 30% poloxámero hidrogel ( 'verdadero estado de biofilm). Susceptibilidad a los antibióticos, el 28 de los aislados clínicos se determinó a través de la modificación de Kirby Bauer disco método de difusión, en agar y el 30% poloxámero.

Resultados

Similar proteínas de membrana externa [OMPs] se identificaron a las bacterias que crecen en un biofilm estado y en un 30% de poloxámero hidrogel, que son muy diferentes a las OMPs identificadas en bacterias cultivadas en Mueller-Hinton agar y caldo. Hubo una diferencia significativa entre los medios de la limpieza de las zonas en torno a los antibióticos en los discos estándar de agar y geles poloxámero [P <0,05]. Las zonas de liquidación fueron en general más pequeños para poloxámero crecido-que las bacterias cultivadas en agar estándar. Difusión distancias de varios antibióticos a través de agar y el 30% poloxámero no mostró diferencias significativas [P> 0,05].

Conclusión

Los resultados de este experimento sugieren que poloxámero gel podría ser utilizado como un medio adecuado en el que llevar a cabo biofilm pruebas de susceptibilidad a antibióticos, ya que permite a las bacterias se cultiven en un estado representante de la superficie infectada de que la cultura se ha tomado.

Fondo

En ambientes naturales, con frecuencia las bacterias crecen en comunidades estructuradas llamado biofilms. Biofilms se definen como poblaciones bacterianas adheridas entre sí y / o superficies encapsuladas dentro de una matriz tridimensional de sustancias poliméricas extracelulares [EPS] [1]. Biofilms puede constituir un problema importante para la salud humana con muchos médicos y citó como la causa de una variedad de infecciones bacterianas crónicas [2]. Células bacterianas están protegidos por la cada vez mayor en un biofilm, y aunque los anticuerpos producidos en respuesta a antígenos biofilm pueden eliminar las células planctónicas una nave de la biopelícula, no pueden llegar las células sésiles dentro del biofilm y puede dañar los tejidos circundantes en lugar [3]. Del mismo modo, la terapia con antibióticos a menudo falla para erradicar biofilms, sólo la supresión de los síntomas de la infección por el asesinato células planctónicas [4]. En consecuencia, las infecciones en los animales y los seres humanos pueden persistir durante años con síntomas recurrentes después de cada período de tratamiento con antibióticos hasta que la superficie está colonizada removerse quirúrgicamente.

Ya sea en los seres humanos o animales, la resistencia a los antibióticos de biofilms tiene un impacto significativo sobre la salud incluido el aumento de la morbilidad y la mortalidad [5]. El tratamiento prolongado de las enfermedades y las infecciones aumenta los costes sanitarios y graves consecuencias para ambos humanos y el bienestar de los animales. Actualmente, los antibióticos de selección se basa en una prueba de sensibilidad a antibióticos utilizando el Kirby-Bauer método de difusión del disco, elaborado en 1966 por Bauer y otros [6]. Otros métodos han sido desarrollados, pero la técnica de difusión en disco ha sido aprobado por el Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico [NCCLS] en 1975 y aún se utiliza hoy en día como la base para la difusión en disco de normalización [7].

Aunque el método de difusión en disco de pruebas de sensibilidad antimicrobiana ha sido descrito como un socio fiable, fácil y barato método de evaluación de la eficacia antimicrobiana [8], investigaciones recientes han indicado que los resultados de la prueba de disco están abiertos a error de interpretación y que es sólo útil como una primera pantalla para las pruebas de sensibilidad [9]. Costerton et al. [3] declaró que el cultivo de bacterias para su uso en la prueba de susceptibilidad transforma la formación de un biofilm patógeno en un laboratorio planctónicas-adaptado cepa. Por lo tanto, el problema con la susceptibilidad antibiótica estándar de prueba es que el crecimiento de bacterias en agar no es representativo de cómo las bacterias crecen naturalmente en los tejidos sitios. En consecuencia, el método actual de selección de los antibióticos se evalúa la sensibilidad bacteriana en un estado poco realista.

En el presente estudio poloxámero F127, un di-bloque de copolímero de polioxietilenado y polyoxypropylene, fue utilizado como un medio en el que las bacterias pueden ser cultivadas como un biofilm fenotipo y expresar las características más adecuadas para el "mundo real". Un primer experimento se llevó a cabo para determinar el peso molecular de las proteínas de membrana externa de P. aeruginosa crecido en agar estándar, poloxámero gel y en un biofilm sobre una placa de microtitulación para confirmar si las bacterias del biofilm expresar un fenotipo en poloxámero como fue encontrado por Gilbert et al. [10]. El segundo experimento entonces que participan sensibilidad antibiótica en las pruebas estándar y poloxámero agar gel para comparar los resultados de una serie de especies bacterianas.

En el presente estudio dos enfoques se utilizan para estudiar la eficacia de los antibióticos en los microorganismos apósitos. En primer lugar una amplia gama de bacterias aerobias y levaduras fueron probados utilizando un estándar de ensayo de agar [Kirby Bauer disco método de difusión [6] y un segundo método utilizado una técnica de poloxámero para alentar a la misma cepas de microorganismos para una exposición más clínicamente relevante biofilm fenotipo. Gilbert y otros determinó que p. aeruginosa las células cultivadas en poloxámero hidrogel ( 'true' biofilm forma) expresar proteínas de membrana externa entre el 78 y 87 kDa, que no son evidentes en las células cultivadas en agar nutriente estándar ( 'planctónicos / cuasi-estado sésiles ») [10]. En consecuencia poloxámero gel culturas imitar muchas de las propiedades de biofilm crecido-Pseudomonas aeruginosa [10]. Esto indica que existe una diferencia fenotípica entre p. aeruginosa las células cultivadas en poloxámero hidrogel y agar nutriente, con sólo poloxámero crecido las células se asemejan a las células del biofilm. Se llegó a la conclusión de Wirtanen del estudio [11] que las bacterias que se cultivan en poloxámero han biofilm y las propiedades de biocida mayor resistencia [11]. Gilbert y sus colegas sugiere que las bacterias que crecen en poloxámero hidrogeles pueden estar expuestos a los biocidas para proporcionar un método para probar la eficacia de los antibióticos biocidas contra las bacterias del biofilm [10]. Prueba de crecimiento de biopelículas en la poloxámero modelo también se confirmó mediante microscopía confocal láser [12]. Sincock y otros encontraron que el uso de microscopía, las bacterias dentro de poloxámero hidrogeles creció a altas densidades, formado microcolonies y exhibió un biofilm fenotipo. El poloxámero hidrogeles se han utilizado también para estudiar los biofilms de Streptococcus mutans en la placa [13], a ver a homoserine lactonas y eficacia biocida en biofilms [14] y también para estudiar y coaggregation biopelículas en el agua dulce bacterias Blastomonas natataria y Micrococcus luteus [15 ].

En el presente estudio hemos utilizado y adaptado la ciencia de Wirtanen del biofilm modelo [11] para prestar un servicio más clínicamente relevante método para probar la efectividad de los apósitos antimicrobianos en los microorganismos del biofilm. El objetivo de esta investigación fue una prueba más clínicamente relevante biofilm modelo para evaluar la eficacia de los agentes antimicrobianos contra los microorganismos de los exámenes clínicos y veterinarios importancia.

Métodos
Origen de los aislamientos bacterianos e identificación

Todas las cepas utilizadas en este estudio fueron aisladas de muestras clínicas de rutina presentado a la Universidad de Liverpool Hospital de Enseñanza Veterinaria, Leahurst, Wirral, Reino Unido. Todas las cepas fueron identificadas bioquímicamente morfológicamente y por procedimientos de laboratorio estándar.

Proteínas de membrana externa de ensayo
Antimicrobiana suceptibility prueba
Antibiótica difusión de investigación

Esta investigación se llevó a cabo con el fin de comparar la difusión de diferentes tipos de antibióticos a través de agar MH y el 30% poloxámero gel (biofilm modelo). Diferentes antibióticos con diferentes pesos moleculares (MW) fueron escogidos para este estudio. Estos incluyen ciprofloxacina (5 μ g - 331,34 MW), doxiciclina Hydrochloride (15 μ g - 512,94 MW), gentamicina (15 μ g - 653,21 MW), levofloxacino (5 μ g - 361,37 MW) y meropenem (10 μ g - 356,37 MW). En experimentos separados un antibiótico disco se colocó en el centro de una placa de Petri que contiene MHA o 30% poloxámero. Tres de 13 mm estéril discos de papel de filtro (Whatman, Reino Unido) se colocaron al lado del antibiótico en los discos de cada cápsula de Petri a varias distancias lejos de los antibióticos disco. El concepto detrás de esto es que a lo largo de un período de 24 horas los antibióticos conocidos difundirá a través del agar gel o poloxámero y convertirse impregnados en el filtro discos puestos a distancias conocidas de la central antibiótico disco. El nuevo filtro de discos impregnados fue entonces ser retirados y su eficacia en contra de un organismo llamado, en este caso E.coli, se investigó el uso de una zona de ensayo de inhibición (ZOI), de acuerdo con las directrices del NCCLS [16] en agar. Cuando una zona de limpieza se detectó en torno a la recién impregnanted disco que indican que el antibiótico se ha difundido a tal distancia. Esto se repitió por triplicado.

Resultados
Proteínas de membrana externa de prueba

Comparación de las proteínas de membrana externa de P. aeruginosa crecido en poloxámero gel, Mueller-Hinton agar y el pasador de la tapa de la placa de microtitulación de plástico (biofilm estado) mostró que las células cultivadas en gel de poloxámero se asemejaba a la biopelícula fenotipo. El biofilm y poloxámero crecido tanto las células una proteína expresada a 87 kDa, una proteína a 112 kDa y una proteína de entre 71-72 KDa que no estuvieron presentes en el agar MH crecido las células (Figura 1]. Hubo tres proteínas de un peso similar en torno al 57 kDa, 61 kDa y 64 kDa que se encuentra en la p. aeruginosa células de los tres medios de cultivo. También una proteína de 200 kDa fue identificada en los planctónicos modo de crecimiento y no en el biofilm de bacterias cultivadas.

Para Staphylococcus aureus proteínas de la membrana exterior con los pesos de 103-104 kDa y 42-43 kDa fueron identificados el 30% poloxomer. Esto corresponde a OMPs encontrado de Staphylococcus aureus crecido en el biofilm del Estado, pero difiere considerablemente de las OMPs identificados en agar MH MH o caldo.

El OMPs con pesos de entre 102 y 104 kDa y 19 kDa fueron identificados a partir de Escherichia coli crecido en un 30% poloxámero. Estos OMPs correspondía con OMPs se encuentran en E. coli creciendo en el biofilm del Estado. Como en el caso de Staphylococcus aureus estos OMPs difiere considerablemente con el agar MH y MH caldo crecido bacterias.

Por Proteus mirabilis OMPs a 289 y 205 kDa fueron identificados cuando se cultiva en un 30% poloxámero. Estos no eran evidentes en el estado planctónicas.

Con Acinetobacter juni OMPs a 265 kDa, entre 113 kDa y 115 kDa y entre 60 y 61 kDa fueron identificados en las células cultivadas en un 30% poloxámero. Estos OMPs correspondió a las cultivadas en el biofilm del Estado y sólo como se indica más arriba difiere considerablemente de la planktonically células cultivadas.

Prueba de resistencia a los antimicrobianos

Los resultados para los medios de las zonas de separación alrededor de los antibióticos para Gram positivos y Gram negativos, tanto en bacterias MH y poloxámero agar gel se muestran en los cuadros 1 y 2. Cinco bacteria (Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium renale, Micrococcus sp, Staphylococus citreus y Staphylococcus hominis) se excluyeron del análisis debido a las zonas de liquidación son mensurables en poloxámero gel, pero eran demasiado grandes para ser medidos en agar con una serie de antibióticos.

Entre las 14 bacterias Gram negativas de las especies cultivadas en placas de MHA, ciprofloxacina fue el antibiótico más efectivo, mientras que en el equivalente poloxámero gel crecido organismos ciprofloxacina y meropenem son los más eficaces antibióticos. De las 12 bacterias Gram positivas a prueba, imipenem demostró ser el antibiótico más efectivo contra el MH y poloxámero agar gel crecido organismos, sin embargo es la más eficaz en varios de los organismos cultivados en poloxámero gel que aquellos cultivados en agar MH (91,7 Versos% 58,3% respectivamente).

A pesar de que la misma fueron los antibióticos más eficaces tanto en el MH y el agar-gel poloxámero crecido Gram negativas y Gram positivas grupos de bacterias, los antibióticos susceptibilidades eran a menudo diferentes entre los dos medios de cultivo. Por ejemplo la bacteria Nocardia asteroides es más susceptible a levofloxacino cuando se crece en agar MH, con un promedio de 38,4 mm de media espacio libre, sin embargo, cuando se crece en poloxámero gel imipenem fue el antibiótico más efectivo produciendo un 27,53 mm significa gálibo.

Así como las diferencias entre los antibióticos para los distintos organismos bacterianos, la eficacia del mismo antibiótico también difiere entre los dos medios de cultivo. Esto fue más notorio con el antibiótico penicilina G. De los 14 organismos Gram negativos a prueba, la penicilina G es el antibiótico menos eficaz en ambos MH agar gel y poloxámero crecido organismos (57,1% y 64,3% respectivamente). Sin embargo, sólo uno de los organismos cultivados en agar MH muestra total resistencia a la penicilina G, en contraste con nueve de los organismos poloxámero crecido. Del mismo modo, entre las 12 especies Gram positivas, la penicilina G es el menos eficaz en el 50% de ambos organismos en MH y poloxámero agar gel, pero mientras que sólo un organismo que aparece resistencia en agar MH, tres organismos en poloxámero gel estaban completamente intactos de la penicilina G. Por lo tanto, mientras que las bacterias cultivadas en agar MH menudo muestran algunas espacio libre en torno a la penicilina G, poloxámero gel crecido con frecuencia los organismos no mostró limpieza de la zona en absoluto. Por ejemplo, la penicilina G es el antibiótico menos eficaz contra Bacillus cereus en tanto MH y poloxámero agar gel mientras que el antibiótico fue totalmente ineficaz en el poloxámero gel crecido la cultura, produjo un promedio de 7,07 mm de limpieza de la zona en placa de agar MH.

Aeromonas hydrophila había grandes zonas de ampicilina-sulbactam y amoxicilina-ácido clavulánico en poloxámero geles de agar MH. Esto también fue cierto en el caso de Bacillus licheniformis cuando son expuestos a la clindamicina. La importancia de este resultado es objeto de investigación.

Antibiótica difusión de investigación

El promedio de difusión distancias para cada uno de los antibióticos a través de cada uno de los dos medios de comunicación, poloxámero gel de agar y se muestran en la Figura 2. Es evidente que la difusión a través de las tasas de agar y el 30% poloxámero no fueron significativamente diferentes (p <0,05) para los antibióticos estudiados. En todos los casos los antibióticos ha difundido la misma distancia y se muestra a inhibir el crecimiento de E. coli en placas de agar.

Discusión

El tratamiento de las infecciones por tópicos o sistémicos antibióticos se está convirtiendo cada vez más problemático debido a la existencia de biofilms [17, 18]. Pruebas de sensibilidad antibiótica de los métodos tradicionales en agar se utiliza para diagnosticar el mejor antibiótico para tratar una infección. Sin embargo, la elección y la concentración de antibiótico a menudo se pierda en la liquidación de la infección [19]. Esto se debe al hecho de que cada vez más bacterias en un biofilm estado son muy recalcitrante al tratamiento antibiótico.

Gilbert et al. [10] sugiere el uso de poloxámero como un sustituto de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos y la hipótesis de que las bacterias que crecen en un biofilm estado en poloxámero en contraposición a un laboratorio adaptado »planctónicas estado. En su estudio OMPs de poloxámero crecido y crecido biofilm Pseudomonas aeruginosa tiene un número de partes idénticas OMPs que no se encuentran en las bacterias cuando se cultiva en agar y en caldo (planctónicos estado). En nuestro estudio también se han descubierto dos proteínas de membrana externa de Pseudomonas aeruginosa a 87 kDa y 112 kDa en el biofilm y poloxámero crecido estado. Estos no estuvieron presentes en el agar MH crecido las células lo que sugiere que la proteína perfil de Pseudomonoas aeruginosa biofilm las células son diferentes a la de MH agar crecido 'planctónicos / cuasi-sésiles' células. Los datos generados en el presente documento apoya las conclusiones de Gilbert et al. [10], que encontró que poloxámero biofilm crecido y Pseudomonas aeruginosa células expresó membrana externa proteínas entre 78 y 87 kDa, que no eran evidentes en agar MH células cultivadas. Otra proteína entre el 71 y 72 kDa se encontró en la biopelícula y poloxámero crecido las células que no se ha encontrado en las células cultivadas en agar. Esta proteína puede representar la proteína OPRC [70 kDa] que se encuentran en las células del biofilm por Gilbert et al., [10]. Esta proteína no es evidente en las células planctónicas y entender que hay una diferencia fenotípica entre p. aeruginosa las células cultivadas en poloxámero gel de agar y MH, poloxámero con gel crecido células se asemejan a las células del biofilm.

En general para todas las bacterias estudiadas en este documento único OMPs fueron identificados cuando las bacterias se cultivaron en poloxámero y en el biofilm del Estado, que no eran evidentes cuando las bacterias se cultivaron en agar MH MH o en caldo. OMPs También se han detectado a partir de bacterias que crecen en agar MH y el caldo que no se encuentran en poloxámero y bofilm crecido bacterias. Esto sugiere que las células bacterianas mostrar un fenotipo de biopelículas en la presencia de poloxámero. Por consiguiente, esto indica que la bacteria sésiles cuando se crece en poloxámero expresar OMPs que se biofilm específicos.

Habiendo identificado las similitudes fenotípicas entre poloxámero y biofilm las células cultivadas una susceptibilidad antimicrobiana se realizó sobre una serie de organismos de bacterias que crecen en forma paralela a MH y poloxámero agar gel, con el fin de determinar si existía una diferencia entre las dos diferentes medios de cultivo. Se comprobó que hubo una diferencia significativa [p <0,05] entre el aumento de los diámetros de las zonas de inhibición en MH y poloxámero agar gel. Las zonas fueron en general más pequeños cuando las bacterias se cultivaron en poloxámero gel antibiótico y la eficacia a menudo difieren entre las dos diferentes medios de comunicación. Por ejemplo, imipenem fue el antibiótico más eficaz contra el agar MH crecido Actinobacillus equuli [35,4 mm de diámetro medio de inhibición de la zona], mientras que el meropenem es el antibiótico más efectivo contra el poloxámero gel crecido forma de la bacteria produciendo una media 26,87 mm zona de inhibición. No sólo hubo una diferencia en el grado de eficacia de los antibióticos en ambas MH agar gel y poloxámero entre los antibióticos pero el grado de eficacia también difieren por el mismo antibiótico. Cabe destacar que esto fue demostrado en el caso de la penicilina G, donde los organismos probados mostraron susceptibilidad cuando se crece en agar MH pero completa resistencia cuando se crece en poloxámero gel. También es importante señalar que en este estudio las zonas de tamaños no son comparables entre los distintos antibióticos sobre todo en los métodos empleados no son cuantitativos, aunque las diferencias en cifras brutas pueden ser celebrados.

Las diferencias en los resultados relativos a los dos tipos de medios de comunicación pone en tela de juicio la aplicabilidad de la tradicional Kirby Bauer susceptibilidad antibiótica prueba que se ha utilizado ampliamente en los laboratorios de microbiología durante los últimos cuarenta años, más o menos. Incorrecto de antibióticos puede aumentar las concentraciones de la resistencia a los antibióticos tasas de mutación en bacterias [20]. En general, el uso de antibióticos ineficaces, ya sea debido a la clase o la dosis, para tratar las infecciones bacterianas, se aplicará la presión de selección para una población que favorezcan a las cepas resistentes. Con la creciente amenaza de epidemia de organismos resistentes como Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) la necesidad de una adecuada selección de los antibióticos es actualmente de importancia primordial para ambos clínica veterinaria y la ciencia [21, 22].

Conclusión

En general, este estudio ha demostrado que la eficacia de los antibióticos se reduce cuando las bacterias se cultivan en presencia de poloxámero gel, como un biofilm fenotipo. Ya se ha establecido que biofilm de bacterias son resistentes a los antibióticos [23], sin embargo pruebas de susceptibilidad actual sólo puede utilizar los medios de agar que alentar las bacterias para crecer más dentro de un 'planctónicos / cuasi-sésiles estado que como un' verdadero 'biofilm fenotipo. Las conclusiones de este estudio sugieren que poloxámero gel podría ser considerada como otro medio en el que llevar a cabo pruebas de susceptibilidad a antibióticos ya que permite a las bacterias para crecer en un biofilm estado más representativo de una superficie de la infección biológica (por ejemplo, crónicas herida infectada). Sin embargo, más estudios son necesarios para fundamentar esta afirmación en particular cuantitativa versión de esta tecnología para ayudar a los clínicos y microbiólogos a tomar decisiones informadas con respecto a la prevención y el tratamiento de infecciones graves del biofilm.

Conflicto de intereses

SLP y JD son empleados de la herida ConvaTec Terapéutica ™.

Autores de las contribuciones

ALC y JD trabajo experimental realizado. ALC, SLP CC y diseñó el estudio, recogido y analizado los datos y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a la herida ConvaTec Terapéutica ™ para la financiación de esta investigación. También queremos dar las gracias a la Universidad de Liverpool, Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias, División de Estudios Equinos de la utilización de sus instalaciones y organismos bacterianos.