TGF-β depende la regulación de radicales de oxígeno durante transdifferentiation de activar las células hepáticas stellate a las células myofibroblastoid

Mecanismos de defensa antioxidante evolucionado como consecuencia de la aeróbica estilo de vida causado por la actividad fotosintética de los organismos a base de hierbas, que a su vez depende de la capacidad de reducción de oxígeno que ocurren durante la respiración. Especies reactivas del oxígeno (ROS) son esenciales para un par de procesos dentro de la celda y desempeñan un papel fundamental en varias enfermedades incluyendo daño al hígado [1]. ROS se producen (i) por la interacción de la radiación ionizante con moléculas biológicas, (ii) durante la respiración celular y (iii) de myeloperoxidase y nicotinamide-adenina dinucleotide fosfato (NADPH) oxidasa de las células fagocíticas, como los neutrófilos y macrófagos. Además, varios Estados no phagocytotic tipos de células como hepatocitos [2] y las células hepáticas stellate (HSCs) [3] También se han mostrado para expresar una NADPH oxidasa-al igual que la enzima juega un papel importante en la generación de ROS [4].

Oxidantes fuertes como ROS pueden dañar proteínas, lípidos (lipidperoxidation), así como el ADN, y, por tanto, se han sugerido para tener una implicación crítica en la carcinogénesis [5]. Como consecuencia de ello, cada tipo celular alberga varios mecanismos de defensa contra los efectos nocivos del estrés oxidativo. Dos enzimas desempeñan un importante papel protector, es decir, la superóxido dismutasa (SOD), que convierte los dos aniones superóxido (O ₂ ^-) en peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂₎ y el oxígeno, y catalasa, que promueve la conversión de peróxido de hidrógeno al agua y oxígeno molecular. Los antioxidantes como el ácido ascórbico, β-caroteno y α-tocoferol también reducir el peligro de ROS producido accidentalmente. Otro mecanismo de defensa se basa en glutatión (γ-glutamil-cysteinyl-glicina, GSH), que participa en diversas acciones, como por ejemplo celulares del metabolismo de nutrientes y la regulación de los eventos celulares como la transducción de señales, la producción de citoquinas, proliferación celular, apoptosis y de la respuesta inmune [ 6]. Sin embargo, GSH es conocido principalmente como un sistema redox intracelular que exhiben dos conformaciones, los antioxidantes "glutatión reducido" tripeptide denomina convencionalmente como la mencionada GSH, y la forma oxidada, una de azufre-azufre vinculado compuesto conocido como el disulfuro de glutatión (GSSG).

Aparte de putativo consecuencias perjudiciales causados por ROS, los últimos informes demuestran que los radicales libres, también están implicadas en la señalización celular, especialmente en las células tumorales y las células decididos a someterse a la apoptosis. Existen pruebas sólidas en particular para las enfermedades hepáticas que el aumento de la producción de radicales libres y / o perjuicios en los mecanismos de defensa antioxidante están involucrados. Como consecuencia de ello, numerosos estudios se han centrado en la significación patológica de ROS lesiones en el hígado, así como en intervención terapéutica con antioxidantes [1, 7 - 10].

Hepatic stellate células desempeñan un papel fundamental durante el daño hepático. En el adulto sano el hígado, los HSCs son considerados como los principales lugares de almacenamiento de los retinoides, mientras que HSCs se activan a miofibroblastos (MFBs) al daño hepático. Transdifferentiation Esto va acompañado de drásticos cambios morfológicos, incluyendo la pérdida de gotitas de lípidos frente al citoplasma y alteraciones en los patrones de la síntesis de proteínas, que comprende la síntesis de novo de α-actina de músculo liso [11 - 14]. Además, HSC derivado del MFBs son los principales responsables de la matriz extracelular (ECM) en la remodelación de la fibrosis del hígado, lo que representa un sello distintivo de fibrogenesis. En particular, MFBs secretar altos niveles de la intersticial colágenos Iy III [15], así como varias metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [14, 16] y tejidos inhibidores de MMPs [16 - 18], lo que resulta en una densa y rígida red de constituyentes de la matriz que ejerce el estrés físico que rodea a las células.

ROS si están implicados en la activación de HSC y los mecanismos moleculares que son la base para la transdifferentiation de HSCs a MFBs sigue siendo motivo de debate. Lee y sus colegas demostraron que ROS son indispensables para la activación y HSCs que c-myc y NF-κ B actuar como mediadores moleculares de estrés oxidativo [19]. Además, co-cultura experimentos han demostrado que extracelular ROS, estable producida por el citocromo P450 2E1 (CYP2E1) sobreexpresión en células HepG2, facilitar la activación de quiescent HSCs in vitro, lo que resulta en una mayor expresión de colágeno I y α-SMA [20]. Por otra parte, el tratamiento de los hepatocitos con nitrilotriacetato complejo resultados en respuesta a estrés oxidativo. Se ha demostrado que la transferencia de medio condicionado por HSCs estimulado su proliferación, así como la acumulación de colágeno I en estas células [21]. Se obtuvieron resultados similares en Kupffer y otras células inflamatorias, que han demostrado para producir H ₂ O ₂ [19, 22, 23].

Una de las más estudiadas antagónicos jugador de ROS es GSH, que ha sido informado de que significativamente upregulated cultivadas en primaria HSCs en siete días en comparación con el recién aisladas HSCs [24]. Además, a largo plazo cultivadas HSCs exhiben una mayor tasa de síntesis de GSH en comparación con las células en corto plazo la cultura. En cambio, no aumentó GSH o γ-glutamil-cisteína sintetasa (GCS) nivel se ha observado en HSCs aisladas de hígado de rata fibrótica después de 8 semanas de la ligadura del conducto biliar o 4 semanas de tratamiento CCL ₄ [24].

Recientemente, hemos publicado un hepática stellate línea celular denominado M1-4HSC [25], que ha sido aislada de p19 ^ARF null ratones y representa activado HSCs mostrando una sorprendente plasticidad que afecte a su morfología. Desde que se hayan sometido a la activación espontánea in vitro, M1-4HSCs ya han perdido la grasa de almacenamiento de gotitas y expresar grandes cantidades de α-SMA. Debido a TGF-β administración, estas células son provocados a someterse a un nuevo proceso de activación de las células myofibroblastoid, denominada M-HTs [25, 26]. Por lo tanto, este celular modelo proporciona la capacidad única para estudiar los eventos finales de etapa de HSCs de activación, es decir, la transdifferentiation de HSCs activado para MFBs. De hecho, la mayoría de los estudios de investigación HSC activación han empleado recién aisladas, quiescent HSCs y seguimiento de activación espontánea que tiene lugar tan pronto como las células son cultivadas in vitro, según el cual TGF-β se sugiere para acelerar transdifferentiation a pesar de que no se requiere [27].

Abordamos la cuestión de si el estrés oxidativo está implicado en la etapa tardía de activación de M1-4HSCs a myofibroblastoid M-HTs. Con el fin de dilucidar si ROS desempeña un papel en el TGF-β impulsada transdifferentiation, que supervisó los niveles de ROS durante las primeras 72 horas de TGF-β tratamiento, lo que se conoce como la fase de inducción. Se demuestra que son upregulated ROS durante el TGF-β impulsada HSCs de activación, mientras que M-HTs muestra un medio muy eficaz para counterregulation TGF-β inducida por estrés oxidativo de upregulation de SOD actividad enzimática en lugar de catalasa. Además, los genes implicados en la respuesta al estrés oxidativo, tales como c-fos y c-jun, así como plaquetas factor de crecimiento derivado de (PDGF), los receptores α y β se muestran a ser regulado lo que apunta a sus funciones reguladoras en el establecimiento de la resistencia a la el estrés oxidativo.

La línea celular M1-4HSC representa activado HSCs, que someterse a una activación a myofibroblast-al igual que las células en respuesta a TGF-β [25]. La fase de inducción se refiere a las 72 horas de TGF-β tratamiento, que se caracteriza por el cambio a un myofibroblastoid morfología (Figura 1A]. Después de 20 días de TGF-β administración, representan las células activadas MFBs estable con un fenotipo, denominado M-HTs. Transdifferentiation de M1-4HSCs a M-HTs muestra una mayor acumulación nuclear de Smad2 / 3 (Fig. 1B], lo que indica una mayor activación del TGF-β señalización. Además, M-HTs exposición disminuyó la expresión de desmina (Fig. 1C], como se informó recientemente [25]. Este modelo de celular ofrece la única capacidad de vigilar los acontecimientos finales de etapa durante fibrogenesis, desde la activación espontánea ya se ha producido. Con el fin de examinar si ROS están implicados en este transdifferentiation de HSCs activado para MFBs, analizamos intracelular de peróxido de hidrógeno durante la fase de inducción no tratados en comparación con el M1-4HSCs y M-HTs. Peróxido de hidrógeno se utilizó como marcador general de estrés oxidativo ya que todas las formas de radicales de oxígeno que ocurren intracelularmente finalmente se convierte en H ₂ O _2. Hemos observado un aumento significativo en los niveles de ROS después de 48 y 72 horas de TGF-β tratamiento (Figura 2A], mientras que no elevación de los niveles de peróxido de hidrógeno se determinó después de 24 horas. Dado que los niveles basales de ROS ya están inducidos por M1-4HSCs en comparación con quiescent HSCs, según lo informado por varios investigadores [20, 28 - 30], TGF-β, evidentemente, es capaz de proporcionar la acumulación de peróxido de hidrógeno en M1-4HSCs. En cambio, M-HTs mostró alrededor de un 40% la reducción intracelular de peróxido de hidrógeno en comparación con el contenido sin tratar M1-4HSCs (Figura 2B]. Por lo tanto, estos datos plantean la cuestión de si la reducción en los niveles de ROS M-HTs fueron causadas por la disminución de la producción de ROS o por el celular upregulation de mecanismos de defensa antioxidante. Para abordar este tema hemos solicitado la principal fuente de ROS en M1-4HSCs causados por TGF-β administración.

En la mayoría de tipos de células, las mitocondrias-anclado enzimas proporcionan la mayor parte de ROS como la NADPH-ubiquinone oxidoreductase y ubiquinol citocromo oxidoreductase [31]. Otra fuente importante de ROS se NADPH oxidasa, que ha demostrado ser activa en varios Estados no phagocytotic tipos de células incluyendo HSCs [32]. Este NADPH oxidasa-al igual que la enzima es una proteína multi-complejo que consta de la transmembrana de las proteínas P22 ^phox y p91 ^phox los relacionados con las enzimas de la NADPH oxidasa (Nox) la familia, la citosólica ^phox las proteínas p47 y p67 ^phox, así como las pequeñas GTP vinculante proteína CCR. NADPH oxidasa actividad depende, entre otros, a la co-enzima flavina y, por tanto, puede ser inhibida por diphenyleneiodonium cloruro (DIP). La participación de NADPH oxidasa en el TGF-β-dependiente aumento del estrés oxidativo en M1-4HSC se obtuvo por medio de mediciones de ROS contenido en las células que han sido tratados con TGF-β 1 en la presencia del Departamento de Información Pública. M1-4HSC hambre durante 6 horas y administrado con TGF-β 1 durante 3 horas, dio lugar a un aumento de los niveles de ROS a 50% (Fig. 2C]. Esta acumulación de estrés oxidativo se veía afectada por simultánea co-incubación con TGF-β y el Departamento de Información Pública, como los niveles de ROS en estas condiciones eran comparables a los medidos en las células control.

Por lo tanto, si analizamos la actividad NADPH oxidasa se vio afectado en respuesta a TGF-β1. El análisis reveló una fuerte elevación de la NADPH oxidasa actividad después de 48 horas que se redujo de nuevo después de 72 horas (Fig. 2D]. De acuerdo con ROS niveles observados a las 24 horas, ninguna actividad NADPH oxidasa podría ser detectado. Por el contrario, myofibroblastoid M-HTs mostraron una muy elevada actividad de la enzima de la producción de ROS en comparación con no tratados M1-4HSCs. Estos resultados excluyen que el intracelular de peróxido de hidrógeno en los niveles de estas células fueron causados por una baja producción de radicales libres. De acuerdo con estos datos, los componentes de la NADPH oxidasa se comprobó que estaban diferencialmente transcrito. Control M1-4HSC y los tratados con TGF-β, así como M-HTs se analizaron para NADPH oxidasa a través de componentes lineales, semi-cuantitativos RT-PCR. RhoA se utilizó como control de RT-PCR porque no las variaciones en los niveles de expresión se han encontrado a transdifferentiation de M1-4HSCs, tal y como se describe recientemente [25]. Ambos Nox4 ^phox y p47 eran considerablemente upregulated durante la fase de inducción M-1HSCs activación de M-HTs (Fig. 3]. Nox4 y p47 ^phox mRNA niveles ya estaban aumentadas después de 24 horas de TGF-β1 administración NADPH oxidasa, aunque la actividad se incrementó 48 horas después de TGF-β1 tratamiento. Esta discrepancia podría explicarse por el hecho de que precede a la transcripción y traducción funcional de activación de la enzima. Nox4 transcripción niveles se encuentran también a ser elevados en M-HTs (Fig. 3], que está en consonancia con la elevada actividad NADPH oxidasa (Fig. 2D]. En particular, Nox1, gp91 ^phox (Nox2) y Nox3 mostró comparativamente mayor en los niveles de mRNA M-HTs (datos no presentados).

En conjunto, estos datos apuntan a una influencia directa de TGF-β en la actividad NADPH oxidasa y la subsiguiente acumulación de ROS durante el transdifferentiation de M1-4HSCs a MFBs. De acuerdo a la literatura, upregulation de ROS debido a TGF-β También se ha demostrado en diversos tipos de células vasculares como células musculares lisas [33], hepatocitos [34], los fibroblastos del pulmón fetal [35], los fibroblastos cardiacos [36] y también HSCs [28], con mayor frecuencia por upregulation de la actividad NADPH oxidasa [33, 35 - 37]. Sin embargo, los datos disponibles para HSCs se refieren a (i) la activación de quiescent HSCs y (ii) proporcionalmente a los tiempos de incubación corto en comparación con la fibrosis modelo empleado en este estudio. Nos centramos en la fase de inducción dentro de las 72 horas en comparación con no tratados, pero ya activado espontáneamente los padres M1-4HSCs y M-HTS, este último crecido a largo plazo en el TGF-β complementarse a medio y comparable a HSC derivado del MFBs in vivo. Estas células de visualización muy alta actividad NADPH oxidasa, así como el aumento de p47 ^phox mRNA y Nox, a pesar de la disminución de los niveles de radicales libres. En consecuencia, Bataller et al. han demostrado recientemente el upregulation transcripcional de p47 ^phox en quiescent HSCs y activado HSCs aislado de sanas y ratas hígados cirróticos, respectivamente [32]. Con el fin de aclarar la contradicción de la reducción de estrés oxidativo en M-HTs concomitante con una alta actividad de NADPH oxidasa, que abordó la cuestión de la regulación de los mecanismos de contrarrestar.

Para examinar si las estrategias de defensa enzimática participar en la protección contra la acumulación intracelular de ROS, se analizaron las alteraciones en la actividad de la enzima SOD. El anión superóxido O ₂ ^- se produce de NADPH oxidasa y se plantea como radicales libres a través de fugas fuera de la cadena respiratoria. En los mamíferos, tres isoformas de SOD se han identificado como citosólica Cu / Zn-SOD (SOD 1), el de la mitocondria Mn-SOD (SOD 2), y extracelular Cu / Zn SOD (SOD 3), que son responsables de la destrucción de O ₂ ^- a peróxido de hidrógeno y oxígeno. Posteriormente, catalasa y / o GSH ciclo redox son responsables de eliminar el peróxido de hidrógeno a partir de la celda con agua y oxígeno como productos. No significativa alteración en la actividad SOD se observó durante el inicio del TGF-β impulsada MFB activación, mientras que la actividad de SOD en M-HTs se upregulated al 50% en comparación con el M1-4HSC (Fig. 4A]. RT-PCR reveló una ligera upregulation de SOD 1 mRNA durante la fase de inducción y mostró más alta expresión en M-HTs (Fig. 3]. La expresión de mRNA SOD 2 también aumentaron ligeramente después de TGF-β tratamiento de la M1-4HSCs. El alto nivel de expresión de SOD 2 transcripciones mantenerse a la cinética de TGF-β administración y se observó incluso en M-HTs. Un aumento en SOD1 expresión podría producir un aumento en la actividad de SOD citosólica, que contrarresta la producción de ROS en la membrana plasmática. Estos resultados están en consonancia con los datos obtenidos por el análisis de la NADPH oxidasa, que mostró firmemente una mayor actividad en M-HTS, que indica grandes cantidades de anión superóxido que tiene que ser eliminado principalmente por la participación de SOD.

Tomados en conjunto estos resultados apuntan a una función esencial para la SOD 1 a M-HTS, frente a una aumentada anión superóxido contenido que tiene que ser eliminado con el fin de proteger las células de consecuencias desfavorables. Esto es esencial, aunque el estrés oxidativo apoya la creación de HSC de activación y la fibrosis, que también se ha mostrado para stellate células en el páncreas (PSC). Por ejemplo, Emori et al. informó un importante papel de SOD en la activación PSC, como el bloqueo de diethyldithiocarbamate se tradujo en una importante inducción de α-SMA células positivas [38]. Por lo tanto, consideramos que el TGF-β inducida por la elevación de ROS es crucial para la transdifferentiation de M1-4HSCs a M-HTs. Sin embargo, MFBs también dependerá de la reducción de la acumulación de radicales libres con el fin de sobrevivir.

Con el fin de reducir el estrés oxidativo, intracelular de H ₂ O ₂ es dismutated al agua y el oxígeno, ya sea de catalasa o GSH ciclo redox. Curiosamente, se observó un ligero downregulation actividad de catalasa durante la fase de inducción y un moderado en upregulation M-HTs en comparación con los padres M1-4HSCs (Fig. 4B]. Los niveles de mRNA correspondientes no fueron regulados en absoluto (Fig. 3] que lleva a la conclusión de que la catalasa no es crucial que participan en el estrés oxidativo defensa durante M1-4HSCs activación de M-HTs. Estos datos son contrarios a Bleser et al. que demostró que los niveles de mRNA catalasa donde firmemente inducida en HSCs activado in vivo como in vitro. Por lo tanto, sugerimos que catalasa inducción representa un evento temprano en HSCs activación, que no participará en la counterregulation de estrés oxidativo en M-HTs. Anterior datos indican una función discriminante entre baja y alta concentración de H ₂ O _2, determinar si catalasa o GSH redox ciclo es más probable que los radicales libres claro. En general, se propone que el GSH es más eficiente a bajas intracelular de H ₂ O ₂ mientras que las concentraciones altas cantidades de H ₂ O ₂ son preferentemente eliminados de catalasa [29, 39 - 41]. Esto apunta a bastante moderado H ₂ O ₂ en los niveles M1-4HSCs, que podría ser importante en la transducción de señales apoyo a la etapa tardía de activación de M-HTs. Por lo tanto, la hipótesis de que el GSH redox ciclo debe tener considerables repercusiones en el desarrollo de resistencia a los ROS en M-HTs.

Entre otras funciones, GSH participa principalmente en el mantenimiento de la homeostasis redox intracelular, incluida la renovación de peróxido de hidrógeno. Se encontró que los niveles de glutation total se upregulated después de las 24 y las 48 horas, e incluso se ha más que duplicado a las 72 horas de TGF-β tratamiento (Fig. 4C]. Esta elevación en el contenido intracelular de glutatión se detectó en M-HTS, que exhibieron un 2,5 veces más elevado que sin tratar M1-4HSCs. Por otra parte, si analizamos la expresión del ciclo redox componentes se ven afectados. Notables, la producción de glutatión se logra mediante la síntesis de novo a través de sintetasas como γ-glutamil-cisteína sintetasa (GCS). Curiosamente, RT-PCR análisis de la correspondiente transcripción GCS demostró que fue un poco inducido a las 24 horas TGF-β tratamiento y mantenido en niveles elevados en el M-HTs (Fig. 3]. Además, se analizó el ARNm nivel de glutatión peroxidasa (GSHPx) y glutatión reductasa (GSSG-R), que se proponen a participar en la eliminación de peróxidos (GSH utilizando como sustrato) y la reducción de GSSG, respectivamente. Sin embargo, no modulación de los niveles de transcripción fue encontrado.

En conjunto, estos resultados sugieren una regulación directa de NADPH oxidasa de TGF-β y el aumento de los niveles de ROS, así como una contribución especial de GSH en la resistencia a aumentar el estrés oxidativo. Curiosamente, Bleser et al. catalasa propuesto para ser más eficaz para eliminar las concentraciones locales elevadas de ROS, los cuales están representados por intracelular producido H ₂ O _2. Contrariamente, extracelular de H ₂ O ₂ resultados en el consumo de GSH. Esto podría ser cierto para la pronta activación de la fase de quiescent HSCs pero no para la realización de transdifferentiation a MFBs. Dado que la actividad catalasa fue ligeramente downregulated durante las 72 horas de TGF-β tratamiento y alcanzó una moderada actividad en M-HTS, catalasa podría no ser eficaz en la eliminación de H ₂ O _2. En conclusión, estos datos indican que la actividad de SOD es responsable de la reducción del estrés oxidativo en M-HTs en cooperación con GSH. Con el fin de conocer la forma en que estas vías podrían ser regulados, analizamos objetivo genes que están involucrados en la respuesta al estrés oxidativo.

Desde AP-1 es factor de transcripción que participan en la respuesta de estrés, se analizó la regulación de sus subunidades c-fos y c-jun por RT-PCR durante el transdifferentiation de M1-4HSCs a M-HTs. El upregulation de mRNAs se mantuvo en M-HTs (Fig. 5], lo que apunta a una función reguladora de la AP-1 que participan en la creación de resistencia a estrés oxidativo. Como se ha demostrado que el PDGF es regulado a estrés oxidativo [3], hemos determinado los niveles de mRNA de los receptores de PDGF α y β-M1 en 4HSCs. De hecho, los receptores de PDGF transcripciones se incrementaron en la fase de inducción, ya que upregulation de PDGF-R α mRNA se detectó después de 48 horas e incluso aumentó aún más después de 72 horas, así como en M-HTs. A diferencia de PDGF-R α, cuyos niveles de mRNA no se vieron afectados después de 24 horas TGF-β administración, PDGF-R β mRNA abundancia alcanzado ya su cota máxima a las 24 horas con más de 10 veces la inducción. Además de su bien conocida función como potente mitogen, PDGF está implicada en numerosos otros procesos incluyendo la cicatrización y la formación de tejido conjuntivo, estimulando la producción de varias moléculas de la matriz como colágenos y fibronectina [42]. Esto está de acuerdo con nuestros datos desde HSC derivado del M-HTs secretan grandes cantidades de estos componentes de ECM (datos no publicados), que imita en vivo la situación durante el hígado fibrogenesis. Además, se ha demostrado por Adachi et al. que PDGF-BB ligando induce la NADPH oxidasa para producir ROS, lo que a su vez estimula la proliferación de LI-90 células [3]. De este modo, el upregulation de PDGF-R β expresión podría contribuir al aumento de la actividad NADPH oxidasa en M-HTs.

En resumen, nos muestran que a pesar de M-HTs puerto hiperactivo NADPH oxidasa, estos myofibroblastoid derivados de M1-4HSCs han reducido los niveles de ROS en comparación con la línea de células no tratadas. El celular mecanismo de defensa antioxidante depende del aumento de la actividad de SOD, que convierte los radicales libres de O ₂ ^- a peróxido de hidrógeno que luego se reduce, ya sea por la GSH redox ciclo o de catalasa. Desde catalasa no parece verse afectada durante este proceso de activación de HSC, sugerimos que la resistencia al estrés oxidativo en M-HTs depende de manera significativa el aumento de la disponibilidad de GSH.

La presente investigación demuestra el TGF-β depende la producción de especies reactivas del oxígeno a transdifferentiation de los derivados de las células hepáticas stellate (M1-4HSC línea) para M-HTs. Los datos proporcionan pruebas de que (i) el incremento del estrés oxidativo se correlaciona con un aumento en la actividad NADPH oxidasa, y (ii) la superóxido dismutasa de activación, en colaboración con glutatión reduce la acumulación de radicales en myofibroblastoid células. Estos mecanismos de defensa se propone ser particularmente pertinentes a fin de proteger las células de myofibroblastoid consecuencias perjudiciales causados por el estrés oxidativo.

M1-4HSC y derivados M-HT líneas fueron cultivadas en DMEM más 10% de suero de ternera fetal (FCS), tal como se describe anteriormente [25]. M-HTs, además, se completará con 1 ng / ml TGF-β1 (R & D Systems, Minneapolis, EE.UU.). Todas las células fueron mantenidas a 37 ° C y el 5% de CO _2, y forma rutinaria pruebas de la ausencia de micoplasma.

Las células fueron fijadas y como se describe permeabilized recientemente [25]. Primaria anticuerpos fueron utilizados en las diluciones siguientes: anti-Smad2 / 3 (Transducción Laboratories, Lexington, Reino Unido), 1:100; anti-desmina (Dako Corp, Carpinteria, CA, EE.UU.), 1:100. Después de la aplicación de tinte Cye-conjugado con anticuerpos secundarios (Jackson Laboratories, West Grove, EE.UU.), imágenes de células se realizó con una TCS-SP microscopio confocal (Leica, Heidelberg, Alemania). Los núcleos se visualizaron utilizando To-PRO3 a la dilución de 1:10000 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.).

Intracelular de ROS se midió como anteriormente se ha descrito [43], con modificaciones menores. En resumen, las células fueron chapados en 12 placas y bien tratados con TGF-β1 para el tiempo indicado. Para la medición, las células fueron incubadas durante 1 hora a 2,5 μ m de la oxidación-sensibles sonda 2'7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DH) (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) en DMEM más 10% FCS. Celular intensidad de fluorescencia se midió a 485/20 y 530/25 nm con Fluorimeter (Wallace) y representa en porcentaje con respecto al control, tal y como se representa sin tratar de M1-4HSCs.

Diphenyleneiodonium cloruro (DIP; Sigma) se utilizó a una concentración final de 20 μ M. M1-4HSCs han sido tratados con TGF-β1 durante 3 horas o co-incubados con el DIP (4 horas) y TGF-β (3 horas) durante la hambruna general de 6 horas. Celular intensidad de fluorescencia fue una vez más representado en porcentaje con respecto al control, representado por 6 horas de hambre M1-4HSCs.

Las células fueron cosechadas por trypsinization, pildoradas por centrifugación a 2500 g durante 5 min a 4 ° C, y resuspendido en PBS, seguido de incubación con 250 μ mol / l NADPH. NAD (P) H oxidasa se analizó la actividad tal como está descrita anteriormente [31]. NADPH consumo fue seguido por la disminución de absorbancia a λ = 340 nm durante 5 min. Para el análisis específico de la actividad NADPH oxidasa, la tasa de consumo de NADPH inhibida por el Departamento de Información Pública se midió mediante la adición de 10 μ mol / l DIP 30 min antes de la medición. Para la normalización, la concentración de proteínas fue determinada por la lisis de una parte alícuota de células mediante la adición de SDS y la medición de proteínas Lowry solución. La absorción del coeficiente de extinción utilizados para calcular la cantidad de NADPH se consumen 6,22 mM ^-1 cm ^-1. Los resultados se expresaron como pmol / l de sustrato por minuto y por miligramo de proteína.

Las células fueron lavadas dos veces, raspó en PBS a 90% la densidad y se centrifuga a 950 g durante 5 min a 4 ° C. Glutation celular fue extraída en una solución tampón que contiene 0,2% Tritón X-100, el 2,5% de ácido sulfosalicílico y, a continuación, se centrifuga a 10000 g durante 10 min a 4 ° C. El sobrenadante se utilizó para la determinación del total (GSH y GSSG) de la glutatión Griffith del método, con las modificaciones descritas anteriormente [44, 45]. Usando como norma glutatión, glutatión contenido se expresa como pmol / μ g de proteína y representados como porcentaje con respecto a la no tratada M1-4HSCs (control).

Actividad enzimática se determinó como se describe anteriormente [31]. En resumen, las células fueron cosechadas como se describe para la determinación de glutatión. "Pellets" se zadas en 150 μ l de 50 mM di-sodiumphosphate una solución tampón que contiene 0,5% Tritón X-100, 1 mM PMSF y 5 μ g / ml leupeptina y sonicated. Lisados fueron purificados por centrifugación a 13000 g durante 10 min a 4 ° C. SOD se midió la actividad de control de la autooxidation de 6-hidroxi-dopamina. Autooxidation se inhibe de 6-hidroxi-dopamina consumiendo durante superóxido generado este proceso, tal y como se describe anteriormente [31, 46]. En pocas palabras, la cinética de autooxidation de 6-hidroxi-dopamina fueron supervisadas por λ = 490 nm durante 60 segundos en las condiciones que dieron lugar a una cinética lineal. Los ensayos de extractos de proteínas (20-30 μ g de proteína en 20 μ l de extracto proteico) se llevaron a cabo en las condiciones que dieron lugar a un 40% - 60% de inhibición de la autooxidation de 6-hidroxi-dopamina. Las mediciones se repitieron en tres ocasiones. Los datos se calcula como porcentaje de inhibición de la autooxidation de 6-hidroxi-dopamina que se obtuvo con 10 μ g de proteína. Los valores se representan como porcentaje con respecto a las no tratadas M1-4HSCs (control).

Cosecha de células y proteínas extracto de preparación se realizó tal como se describe la actividad de SOD medición. Catalasa se midió la actividad de control de la desaparición de peróxido de hidrógeno en λ = 240 nm [46]. La mezcla de reacción contenía 40 - 80 μ g de proteína, 50 mmol / l de tampón fosfato de potasio, pH 7,0, y 10 mmol / l de H ₂ O _2. Los cambios en la absorbancia se realizaron mediciones de 100 seg. La actividad específica se calculó tal como está descrita anteriormente [31] y representa como porcentaje con respecto a las no tratadas M1-4HSCs (control).

La extracción de poli (A) + ARNm, la transcripción reversa de cDNA y PCR se realizó como se describió anteriormente [47]. Las condiciones para la reacción de PCR lineal fueron optimizados para cada par de primers. El ADN de adelante y atrás primers corresponden a ratón catalasa (5'-CAA TGA CGC GAA GCC TAA-3 'y 5'-CGC ACA ACG TAA CAG GAA-3'), c-FOS (5'-GAC GCT TAC AGA ACT ECP AGC 3'and GG-5'-AAG AGG TGT ACG AAG TGC GTA AG-3 '), γ-glutamylcysteine sintetasa (5'-AAC CAT TCC CAA GCT GTC-3' y 5'-CTG CAC CTP CCA ACG TAA -3 '), GSPH-1 (5'-GGA TTC CAC CAG GAG AAT-3' y 5'-GCA GCC AGT AAT CAA CAC-3 '), GSSG reductasa (5'-GCG TGG AGG TGT AGT TGA y 5 '-TTC CAC GCG GCT ACA AAG-3'), c-Jun (5'-AGA GTT GCA CTC ACT GTG GCT GAA-3 'y 5'-AGA ACA GTC CGT CAC TTC AC-3'), Nox4 (5 '-TTGCTACTGCCTCCATCAAG-3' y Nox4 5 'ATCAACAGCGTGCGTCTAAC-3'), p47 ^phox (5'-CCG AGG CTC GTA ACA TCT-3 'y 5'-CAC CAG CTC GTG ACT AGT-3'), PDGF-R α ( 5'-CAG TCG ACT AGT GAA GAG GCC ATC-3 'y 5'-CAG TAC TTG AAG GCG GTG CGT G-3'), PDGF-R β (5'-AAC GAA CGT CAA GGT CCT GCT-3 'y 5 '-GGC ATT GTA GAA CTG GTC GT-3'), RhoA (5'-GTG GAA TTC TTG GCC CAT CTG AGA AGT-3 'y 5'-GAA CAC TAA TTC AAT CCG CAT GAG GCT-3'), SOD 1 (5'-AGC GAA CCA GGT GTT GTG-3 'y 5'-CGG CCA GAA ATG ATG TGC-3') y SOD 2 (5'-ACA ACT GTC CAG GCT CTT-3 'y 5'-AGC AGG CAG CAA GTA TCT-3 '). El específicos amplificados fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa y visualizado con bromuro de etidio.

Todos los resultados se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Las comparaciones de control, tal y como se representa sin tratar de M1-4HSCs, se realizaron con la t de Student prueba en caso de la Figura 2B. Por lo que respecta a todos los demás datos, análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA seguida de la post-hoc test de Duncan. Todos los datos mostraron la distribución normal como analizados por la prueba de Kolmogorov-Smirnov.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

VP realiza la mayor parte de los experimentos y también redactó el manuscrito. Corte Penal Internacional y MMM llevado a cabo mediciones sobre la actividad NADPH oxidasa y apoya la preparación de VP de extractos celulares y análisis estadísticos. HH realizado análisis de inmunofluorescencia. SI participado en el diseño del estudio y participó con la experiencia particular sobre el estrés oxidativo. WM coordinó el estudio y, por último, editado el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el contenido del manuscrito.