Mediators of Inflammation, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

Antioxidante mecanismo está implicado en la gastroprotector Efectos de aceite de girasol ozonizado en etanol-Induced úlceras en las ratas

Hindawi Publishing Corporation
B. Zullyt Zamora Rodríguez [1], Ricardo González Álvarez [1], Dailén Guanche [1], Nelson Merino [2], Frank Hernández Rosales [1], Silvia Menéndez Cepero [1], Yaima González Alonso [1], Siegfried Schulz [3]

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Resumen

Esta investigación se realizó con el fin de determinar los posibles efectos protectores del aceite de girasol ozonizado (OSO) por la lesión de la mucosa gástrica en ratas inducidas por etanol absoluto y así como para dilucidar el papel de especies de oxígeno reactivas (ROS), la peroxidación lipídica, y algunos componentes importantes de defensa antioxidante, como la superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSH-Px) y catalasa (CAT) a estos efectos. OSO se administró a las ratas intragastrically por una cánula y se aplica durante cuatro días para los animales. La dosis de OSO administrados diariamente a cada uno de los grupos de ratas fueron 4, 12 y 24 mg / kg, respectivamente, y una hora después del último tratamiento, etanol absoluto (1 mL/200 mg de peso corporal) se administró. Nuestros resultados muestran que el índice de úlcera gástrica se redujo significativamente en ratas pretratadas con OSO, en comparación con el etanol tratada con los controles. Sin embargo, en ratas pretratadas con OSO, no una reducción significativa del contenido de TBARS en la mucosa gástrica se encontró en comparación con las ratas tratadas con etanol por sí solo. Por el contrario, SOD y GSH-Px actividades estaban significativamente aumentados en la mucosa gástrica de OSO-ratas pretratadas con respecto a los tratados con etanol por sí solo. En resumen, nuestros resultados demuestran que el tratamiento previo OSO ejerce efectos protectores en etanol inducida por las úlceras gástricas en ratas. Por otra parte, estos resultados proporcionan pruebas de que estos efectos protectores de OSO están mediadas, al menos parcialmente, por la estimulación de algunos importantes enzimas antioxidantes como la SOD y GSH-Px, que son los basureros de ROS y, por tanto, evitar las lesiones gástricas inducidas por ellos.

1. INTRODUCCIÓN

Aceite de girasol ozonizado (OSO) por vía oral de aplicación es una droga que se obtiene a partir de la reacción entre el ozono y el aceite de girasol en condiciones adecuadas de acuerdo a un proceso desarrollado en nuestro centro.

OSO ha demostrado efectos antimicrobianos contra virus, bacterias y hongos [1]. Además, los estudios toxicológicos preclínicos con OSO han demostrado que este fármaco es seguro y no genotóxicos [2], mientras que en los ensayos clínicos de fase II y fase III han informado de muy pocos y no graves reacciones adversas en los pacientes.

Por otro lado, el uso de OSO en el tratamiento de la infección por Giardia lamblia se ha estudiado en modelos animales y los seres humanos por vía oral administraciones que han demostrado la eficacia terapéutica del OSO a esta enfermedad [3].

La peroxidación lipídica mediada por especies reactivas del oxígeno (ROS) es una importante causa de la destrucción y el daño a las membranas celulares y se ha involucrado en la patogénesis de la lesión de la mucosa aguda inducida por etanol, la isquemia-reperfusión, y la indometacina [4, 5]. Además, glutation (GSH) es un importante constituyente del mecanismo intracelular de protección contra una serie de estímulos nocivos, y es conocido como uno de los principales de bajo peso molecular scavenger de los radicales libres en el citoplasma. Sulfhidrilo (SH) que contienen compuestos, y también los agentes que modifican SH grupos, previene la erosión hemorrágica aguda causada por el etanol, antiinflamatorios no esteroideos (AINE), o el estrés en modelos animales [6]. De la misma manera, diversas enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD), un importante radicales superóxido scavenger, y glutatión peroxidasa (GSH-Px), una enzima implicada en la eliminación de peróxido de hidrógeno y lípidos hidroperóxidos, desempeñan un papel importante en la celda protección [7, 8].

Recientemente, el papel de los neutrófilos en las lesiones gástricas inducidas por AINEs, ácido acético, etanol o se ha señalado [9, 10]. Estos leucocitos se adhieren a las células endoteliales, con lo que el bloqueo de los capilares y la inducción de daño a las células endoteliales a través de la liberación de proteasas, leucotrienos, activo y oxidantes [11, 12].

Teniendo en cuenta que los productos de la oxidación de lípidos pueden ejercer propiedades anti-inflamatorias [13, 14], los objetivos de este estudio fueron determinar si el tratamiento con OSO (4, 12 y 24 mg / kg) podría reducir la úlcera gástrica aguda inducida por etanol absoluto y si es así, para determinar los posibles cambios en las actividades de ciertas enzimas antioxidantes como la SOD, catalasa (CAT), y GSH-Px. Ácido tiobarbitúrico sustancias reactivas (TBARS) también fueron medidos.

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2,1. Productos Químicos

Todos los reactivos utilizados para la determinación de SOD, CAT, GSH-Px, y TBARS se compraron los productos químicos de Sigma (St. Louis, Mo, EE.UU.). Los otros reactivos de grado analítico se obtuvieron a partir de fuentes comerciales normales.

2,2. Animales y tratamientos

Male Sprague / ratas Dawley (180-200 g) fueron adquiridos de Centro Nacional de Producción Animal de Laboratorio (CENPALAB, La Habana, Cuba). Ellos fueron asignados aleatoriamente a seis grupos. Los animales fueron alojados en jaulas macrolon (Tecniplast, Italia), en un nivel animal Bioclean habitación, y mantenerse bajo de 12 horas luz-oscuridad en el ciclo 22-24 ° C y la humedad del 70-75%.

Los animales fueron privados de alimentos durante 24 horas antes de los experimentos, pero tienen libre acceso al agua, y se les permitió aclimatarse durante una semana antes del experimento. Todos ellos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices éticas para las investigaciones con animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del Centro Nacional de Investigación Científica, La Habana, Cuba.

OSO se administró intragastrically de una cánula, y se aplicó durante cuatro días (un día) para cada grupo. Las dosis aplicadas de OSO para grupos (4, 12 y 24 mg / kg). Control de ratas recibió el vehículo por vía oral (aceite de girasol 0,12 mg / kg). Normalización de la preparación de OSO se llevó a cabo de acuerdo con los siguientes parámetros: índice de peróxido (IP), lo que indica la cantidad de peróxido disponible en OSO, fue 650 mmol / kg, índice de yodo, que es una medida de la tasa de unsaturation OSO , Fue entre el 50 y 90 unidades; viscosidad, que es una medida de la polimerización por condensación de la formación de peróxidos en OSO, fue entre 100 y 450 mPa s.

Ulceración fue inducida, tal como se describe por Robert [15] inculcar etanol absoluto (1 mL/200 g de peso corporal). OSO se administró 1 hora antes de la administración de etanol. Una hora después del período experimental, los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de éter, y sus estómagos fueron retirados y se abrió a lo largo de la curvatura mayor, y sus lesiones fueron un examen microscópico.

2,3. Ulceración Índice

La longitud y la anchura de cada lesión se mide por estereoscopía (Carl Zeiss, Berlín, Alemania) y la suma de los productos se expresó en términos de índice de la úlcera (IU, milímetros cuadrados). La medición del índice de úlcera se determinó mediante un protocolo ciego investigador.

La mucosa gástrica se raspó con diapositivas de cristal y congelados a -20 ° C, para su posterior determinaciones bioquímicas.

2,4. Ensayos bioquímicos

Mucosa gástrica fue ponderada y homogeneizada en un 10% w / v de una solución de KCl 100 mM de EDTA 0,3 mM de TBARS, GSH-Px y SOD, utilizando un pañuelo de papel homogenator Ultraturrax T25 POLYTRON a 4 ° C. Mucosa gástrica homogeneizado para CAT enzimática ensayo se obtuvieron con un 50 mM tampón fosfato (pH 7) que contiene 1% Tritón X-100 (1: 9 w / v). El homogeneizado se centrifuga a 600 g durante 60 minutos a 4 ° C y los sobrenadantes fueron tomadas para análisis bioquímicos.

2,5. Determinación del contenido de TBARS

Los niveles de TBARS en la mucosa gástrica tomadas como índice de peróxidos lípidos (LP) se medirá con arreglo a un método descrito por Ohkawa et al. [16], con ligeras modificaciones. En pocas palabras el homogenado se complementó con el 8,1% de sulfato de sodio dodecyl (SDS), el 20% de ácido acético, y el 0,8% de ácido tiobarbitúrico (TBA), y se hierve a 100 ° C durante 1 hora. Después del enfriamiento, los reactivos fueron complementados con 2,5 ml de n-butanol-piridina (15: 1) la mezcla, agitar vigorosamente durante 1 minuto, y se centrifuga durante 10 minutos. Se midió la absorbancia a 532 nm y los resultados se expresaron como nmol de TBA por gramo de proteínas.

2,6. Determinación de la actividad de SOD

Actividad de SOD fue determinada por la versión modificada del método de Minami y Yoshikawa [17]. En pocas palabras, cincuenta microlitros de la mucosa homogenado se mezclaron con 450 μ l de agua desionizada fría, 125 μ l de cloroformo, y 250 μ l de etanol. La mezcla fue centrifugada a 8000 g durante 2 minutos a 4 ° C. Quinientos microlitros del extracto se han añadido a la mezcla de reacción que contiene 500 μ l de 72,4 mM tris-cacodylate buffer con 3,5 mM dietileno pentaacetic ácido (pH 8.2), 100 μ l de 16% Triton X-100, y 250 μ l de 0,9 mm nitroblue tetrazolio (NBT). La mezcla de reacción se incubó durante 5 minutos a 37 ° C antes de añadir 10 μ l de 9 mm de pyrogallol disueltos en 10 mM HCl . A continuación, se incubarán durante exactamente 5 minutos a 37 ° C. La reacción se detuvo con la adición de 300 μ l de 2 M fórmico buffer (pH 3.5) que contenga 16% Triton X-100. La absorbancia se midió a 540 nm en un espectrofotómetro. Una unidad de SOD actividad enzimática es igual a la cantidad de enzima que reduce la absorción inicial de nitroblue tetrazolium en un 50%.

2,7. Determinación de GSH-Px actividad

Glutatión peroxidasa se midió usando una versión modificada del método de Faraji et al. [18]. Todas las mezclas fueron disueltos en 20 mM tampón fosfato de sodio que contienen 6 mM EDTA (pH 7,0). La mezcla de reacción consistió de 98,8 μ l de tampón fosfato, 700 μ l de 2,86 mM GSH, 100 μ l 1 mM de azida sódica, 100 μ l de 1 mM NADPH, y el 4,2 μ l de GSH reductasa (0,5 unidades). Luego, 10 μ l del tejido homogenado sobrenadante se añadieron a la mezcla de reacción y incubados a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Posteriormente, el 10 μ l de 30 mm, t-butyl Hidroperóxido disueltos en agua bidestilada se han añadido a la mezcla de reacción y se midió a 340 nm durante 7 minutos en el espectrofotómetro. Un coeficiente de extinción molar de 6,22 × 10 3 μ mol se utilizó para determinar la actividad de GSH-Px. La actividad enzimática se expresó como unidades internacionales de actividad enzimática / mg de proteína. Internacional unidades se expresan como μ moles de hidroperóxidos transformado / min / mL de enzima.

2,8. Determinación de la actividad CAT

CAT se determinó según el método de Rice Evans y Diplock [19]. Homogenado de la mucosa gástrica en ratas fue diluida con buffer, tal y como se describe anteriormente, con el fin de obtener una adecuada dilución de la enzima. A continuación, 2 ml de la enzima de dilución se han añadido a la cubeta y mezclado con 1 mL de 30 mM H 2 O 2 , Midiendo la absorbancia a 240 nm durante 100 segundos. Absorbancia inicial de la mezcla de reacción debe ser alrededor de 0,5. La actividad de la enzima se expresa como el de primer orden constante que describe la descomposición de H 2 O 2 a temperatura ambiente.

2,9. Proteínas de ensayo

Las concentraciones de proteína se determinó por el método de Lowry et al. [20] usando albúmina sérica bovina como estándar.

2,10. Evaluación histológica de la mucosa gástrica

Las muestras de la mucosa gástrica se tomaron de las ratas tratadas con OSO y en comparación con las tomadas de ratas tratadas con etanol. El tejido de la mucosa gástrica se fijó en formalina al 10%, luego embebido en parafina y, por último, teñidas con hematoxilina y eosina (H & E). El estudio histológico se realizó utilizando un microscopio de luz, y fue realizado por un patólogo ciego para el tratamiento de protocolo.

2,11. El análisis estadístico

Los datos fueron expresados como medias ± SEM y se analizaron estadísticamente utilizando la prueba Kruskall Wallis seguida de Mann-Whitney en que se aplicó para el resto de los marcadores. 0,05 El nivel de probabilidad fue utilizado como la significación estadística.

3. RESULTADOS

En el cuadro 1, los efectos protectores de OSO en etanol gástrica inducida por lesiones se muestran. La administración oral de etanol absoluto (1 mL/200 g de peso corporal) inducida por múltiples, alargada, de color rojizo bandas de hemorrágico erosiones en la mucosa gástrica de rata. La úlcera índice fue 115,75 ± 20,29 mm 2. En este modelo experimental, oral OSO pretratamiento con etanol antes de la administración impedido ulceración. La interfaz de usuario (3 ± 2,27 mm 2) fue significativamente más baja que en las ratas que reciben el etanol por sí solo.

El uso de TBARS contenido en la mucosa gástrica en forma de índices, la peroxidación lipídica aumentó significativamente (P <.05) de la concentración basal de 0,038 ± 0,06 nmol / g de proteína a 0,55 ± 0,20 nmol / g de proteína después de la administración de etanol. OSO no redujo significativamente los niveles de TBARS en la mucosa gástrica (Tabla 2].

El cuadro 2 muestra también que el etanol indujo una notable y significativa disminución de GSH-Px actividad en la mucosa gástrica de ratas, mientras que OSO induce una reversión significativa de etanol efecto en esta enzima.

En forma similar, SOD actividad disminuyó significativamente en la mucosa gástrica después de etanol absoluto tratamiento, pero en las ratas pretratadas con OSO, una importante reversión de la actividad SOD se observó sobre todo con una mayor dosis de OSO (Tabla 3].

Por el contrario, ni tampoco OSO etanol indujo cambios significativos en la actividad CAT (Tabla 3].

La Figura 1 muestra una estructura histológica normal de la mucosa gástrica de rata. La figura 2 muestra las lesiones histopatológicas en la mucosa gástrica de rata 1 hora después del tratamiento con etanol. OSO pretratamiento reducido necrosis inducida por el etanol (Figura 3].

4. DISCUSIÓN

Los datos disponibles sugieren que ROS desempeña un papel principal en el daño tisular durante la patogénesis de diversos trastornos del aparato digestivo [21]. La administración oral de etanol absoluto en ratas sea nociva para el estómago, que afectan a la mucosa gástrica tópica de perturbar su barrera y provocar cambios microvasculares pronunciado en pocos minutos después de su aplicación. Por lo tanto, el rápido y fuerte vasoconstricción va acompañada por una rápida y vigorosa la dilatación arteriolar y esta combinación de eventos microvasculares induce daño en la mucosa capilares [22, 23]. Actualmente, hay consenso en que el ex efectos adversos del alcohol en la mucosa gástrica son consecuencia del aumento de la peroxidación lipídica y disminución de glutation (GSH). La participación de radicales de oxígeno en etanol gástrica inducida por lesión fue confirmada en cultivos de células de la mucosa. La exposición al etanol aumentó, en un dependiente de la dosis manera, la generación de aniones superóxido y el grado de daño celular [24]. Salim [5] y Brzozowski et al. [25] han demostrado que el etanol induce la mucosa daños y perjudica la cicatrización de las lesiones.

Nuestros resultados demuestran que el etanol incrementa la peroxidación lipídica con respecto a nontreated control de ratas, pero no se encontraron diferencias significativas con respecto a OSO-ratas tratadas. Puede ser debido a la presencia de algunos aldehídos y hidroperóxidos en OSO que puedan contribuir a aumentar TBARS contenido en la mucosa gástrica de rata.

Los resultados también revelaron una disminución de GSH-Px actividad en la mucosa gástrica después del tratamiento con etanol. GSH-Px es una importante enzima que juega un papel clave en la eliminación de peróxido de hidrógeno y hidroperóxidos de lípidos en las células de la mucosa gástrica [8].

En contraste con la SOD y GSH-Px actividades, que aumentaron significativamente en las ratas tratadas con OSO (Cuadros 2 y 3], CAT actividad no fue significativamente modificada por los tratamientos ni con el etanol ni con OSO (Tabla 3]. Este hecho parece deberse al hecho de que la GSH-Px desempeña un papel mucho mayor que el Comité contra la Tortura en la eliminación de baja de estado de las concentraciones H 2 O 2 . Por lo tanto, parece que GSH-Px es la principal enzima antioxidante para eliminar H 2 O 2 CAT y muestra una baja afinidad para que ROS. En este contexto, nuestro resultado está en concordancia con los reportados por Billici et al. [26] y Kanter et al. [27].

La actividad antioxidante de GSH-Px es, junto con la oxidación del glutatión reducido (GSH), que puede ser posteriormente reducido de glutatión reductasa de NADPH como agente reductor. Por lo tanto, la inhibición de esta enzima puede dar lugar a la acumulación de H 2 O 2 con la consiguiente oxidación de los lípidos.

En contraste, el tratamiento previo OSO 4, 12, 24 mg / kg de peso inducida por un aumento significativo de la GSH-Px actividad después de la administración de etanol. Este aumento de la GSH-Px actividad sugiere que el efecto de antiulcerogenic OSO se pueden conectar con el metabolismo de GSH.

En resumen, nuestros resultados sugieren que el efecto gastroprotector de OSO en la rata lesión de la mucosa gástrica inducida por etanol podría estar mediado, al menos parcialmente, por su efecto estimulante sobre las enzimas antioxidantes como la SOD y GSH-Px que constituyen los basureros endógeno de ROS.